수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation

요약

이 동영상 기사에서 우리는 하이 포스트 - 해동 서바이벌 속도로 햄스터 oocytes를 수집하고 cryopreserve하는 방법에 대한 단계별 데모를 제시한다. 동일한 절차도 성공적으로 동결과 preimplantation 개발의 다른 단계에 마우스 배아를 해동 적용할 수 있습니다.

초록

언제 위팅엄 배아와 oocytes 처음으로 성공적으로 30여 년 전에 cryopreserved되었습니다

프로토콜

동물 보호 절차 동물과 바르셀로나, 스페인 Universitat Autònoma 인간 연구에 대한 윤리위원회의 승인 지침과 규정에 따라 실시되었다.

I.의 Oocyte 컬렉션

1. 두꺼운 질 분비물 (postovulatory 방전)의 존재에 대한 골든 시리아 변형의, 여성 햄스터 (8-12주의 옛 Mesocricetus auratus)을 확인하고 선택합니다.
2. 60시간 나중에 PMSG 40 IU의 intraperitoneal 주사 (임산부 마레 세럼 생식 샘 자극 호르몬) hCG (인간 Chorionic 생식 샘 자극 호르몬)의 40 IU 다음으로 superovulate 선택한 여성을 유발.
3. 16 시간 이산화탄소 챔버의 hCG의 관리 후 여성의 햄스터를 안락사.
4. 로 비디오에 나타난 여성의 oviducts 격리하고 KSOM - H 매체의 드롭에게 전송할 수 있습니다.
5. 37 hyaluronidase (156 U / ML)의 드롭 입체 현미경 수란관 ampulla을 이간하여 oocyte - 큐뮬러스 단지를 수집 ° C. Oocytes은 약 5 분 큐뮬러스 세포에서 해방된 것입니다.
6. hyaluronidase의 oocytes을 들고 KSOM - H 매체에 두 번 그들을 씻으십시오.

마우스 배아의 수집을 위해, 여성 생쥐 (뮤스 musculus; 6-8주의 오래된)은 나중에 hCG 48 시간의 5 IU 다음과 남성 생쥐와 성관계를 PMSG 5 IU의 intraperitoneal 주사로 superovulate을 유도하고 있습니다. 암컷은 24-26에서 자궁 전위에 의해 희생되며, 44-46 또는 54-56시간 pronuclear, 2 셀 또는 4 셀 무대 배아, 각각의 obtention위한 hCG의 관리 후. 햄스터 oocytes에 대해 설명한 pronuclear 배아의 수집이 정확하게 수행됩니다. 2 셀 및 4 셀 단계에서 배아는 KSOM - H 매체 [6]로 oviducts 플러싱에 의해 저장됩니다.
참고 :이 프로토콜에 따라 약 20-30 oocytes / 배아 각 여성에서 수집한 수 있습니다.

II. 솔루션을 동결 융해의 준비

1. KSOM - H (propilenglycol 1.5 M) 5 ML에 propilenglycol의 0.57 ML을 diluting로, 솔루션을 준비합니다.
2. 0.2052 g의 자당 (자당의 0.3 M)와 튜브에 KSOM - H 2 ML를 추가하여 해동 솔루션을 준비합니다.
3. 0.0684 g의 자당 (propilenglycol와 0.1 M의 자당 1.5 M)과 튜브에 솔루션 I 2 ML를 추가하여 냉동 솔루션을 준비합니다.

참고 : 솔루션 I 및 솔루션을 동결 융해가 그들의 사용하기 전에 준비를해야합니다. 그러나, 동결 융해 솔루션의 준비에 사용되는 자당의 지정된 금액을 사전에 가중치를하고 몇 개월 동안 상온에서 3 ML - 튜브에 저장되어있을 수 있습니다.

III. 냉동 프로토콜

1. 전송 oocytes / KSOM - H 매체에서 솔루션 I의 드롭하고 실온에서 7~15분에 대해 품어 배아.
2. 한편, 그것이 동영상 (각 솔루션 / 밀짚 1 방울)에 나와있는 솔루션을 동결 융해 90 μl 방울을 배치하여 빨대를 로드할 90mm 페트리 접시를 준비합니다.
3. 냉동 솔루션 방울에 oocytes / 태아의 원하는 번호를 전송합니다.
   참고 : 우리는 보통 5-30 oocytes 또는 태아 / 드롭 사이에 전송할 수 있습니다.
4. 입 제어 흡인 시스템에 빨대를 첨부하며이 순서를 따라 그것을 로드할 수 : 솔루션 I, 공기, oocytes, 공기, 해동 드롭, 공기 동결 드롭합니다.
5. 짚으로이로드되면, 첫 번째 드롭은 빨대와 물개이를 상단 끝에있는 폴리머에 도달 (솔루션 I) 도입까지 aspirating 유지. 열 인감 플라스틱 플러그와 밀짚이나 인감의 다른 쪽 끝을.
6. 프로그램 냉동고에 스위치와 냉동 프로그램을 선택합니다. 이 프로토콜에 사용되는 냉동이 프로그램은 원래 Lassalle 호텔 외 발행 냉각 속도에 따라 달라집니다. [7] :
   • -7로 실온에서 2 ° C / 분 ° C
     0 ° C / 10 분 분 시딩의 온도 평균 및 유도 수 있도록 (아래 참조)
   • -7에서 0.3 ° C / ° -30 분 ° C로 C
     0 ° C / 2 분 분 온도 평균 수 있도록
   • 35 ° C / 분, -30 ° C에서 -130 ° C로
7. 해동 솔루션의 드롭으로 빨대 부분이 바깥쪽을 향하게되어 있는지 확인하고, 프로그래밍 냉동실의 소유자의 슬롯에 빨대를로드합니다. 냉동 프로그램을 시작합니다.
8. 샘플 온도 -7 ° C 및 냉각이 보류 중이라에 도달하면, 수동 시딩을 수행합니다 : 액체 질소에 빠지게 포셉는 즉시 해결책을 해동의 방울이 들어있는 빨대의 일부분을 노출 약간 밖으로 냉동실의 소유자를 당겨하고, 포셉와 짚으로이 부분을 터치. 홀더 각 소유자와 각 밀짚을 반복하고 끝날 때까지 실행 냉동 프로그램을 보자.
9. 프로그램이 완료되면, 액체 질소의 소유자를 뛰어들다.
10. 에서 빨대를 제거표시 gobelet에게 전송 보유자합니다.
11. 마지막으로, 액체 질소 탱크 내부 gobelet를 저장합니다.

IV. 프로토콜을 해동

1. 액체 질소 탱크에서 빨대를 제거합니다.
2. 40 초전에 실내 온도에 빨대를 유지합니다.
3. 40초 동안 30 ° C에서 물 목욕에 빨대를 적시게.
4. 짚을에서 플러그를 제거하거나 열 봉인 팁 잘라.
5. 35 mm 배양 접시에 짚을 비우기 부드럽게 냉동가 포함된 솔루션을 융해 두 방울을 섞는다.
6. 실온에서 15 분 혼합물에서 oocytes / 배아를 남겨주세요.
7. 37 추가 15 분 동안 KSOM - H의 새로운 드롭 oocytes / 배아를 전송 ° C.
8. Oocytes / 배아는 이제 더 이상 조작을위한 준비가되어 있습니다.

참고 : 6 단계와 7 단계 동안은 해동 oocytes / 배아는 천천히 rehydration로 인해 팽창되는가 나타납니다.

V. 대표 결과

cryopreservation 프로토콜의 사용은 여기 햄스터 oocytes 약 95 %와> 90 %, 85% 각각 pronuclear, 2 셀, 4 셀 단계에서 마우스 B6CBAF1 배아 80 %의 생존율에 결과를 발표했다. 마우스 배아는 해동 후 KSOM에 체외에서 양식하는 경우, 적어도 70-80% 최적의 문화 환경에 blastocyst 단계에 도달해야합니다.

그것은 당신이 각 냉동 실험에서 그 oocytes / 배아의 제어 그룹 (빨대)를 포함하는 것이 좋습니다 oocytes / 태아의 나머지 부분이 추가 조작에 사용되기 전에이 그룹을 녹여. 컨트롤 그룹에 대한 생존 속도가 예상보다 낮은 경우, 같은 많은 다른 빨대를 녹여. 이 두 번째 그룹의 생존 속도도 낮은 경우이 동결 많은에서 남은 빨대를 폐기하십시오.

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토론

이 프로토콜의 햄스터 oocytes와 마우스 배아가 성공적으로 cryopreserved 수로. 일단 냉동, oocytes / 배아가 무한정 액체 질소 탱크에 저장하고 원하는 어떤 시간이나 장소에서 복구할 수 있습니다. 이것은 필요한 때마다 사용하는 샘플을 거의 준비가 갖는 장점을 제공합니다. 한편,이 프로토콜은 또한 라이브 동물 식민지의 유지 관리를 위해 경제적이고 안전한 대안으로 가치 마우스 종자 (예 : 유전자 변형 라인 등)에?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
French type mini-straw 0.25 ml		Mini-tub	13407/0010
hCG		Farma-Lepori, Spain	749036.4
Hyaluronidase		Sigma	H-3884
KSOM-H medium				Ref. [11]
Liquid Nitrogen		Air Liquide
Plastic plugs		Mini-tub	19046
PMSG		Intervet, Spain	1.614/8447
Propilenglycol		Fluka	82280
Sucrose		Merck	107687
Surgical Scissors		Aesculap	BC-060R; BG-061R
Thermo-sealer		SIZ	220
35 and 90 mm culture dishes		Nunc	153066; 150350
10 ml tubes		Greiner Bio-one	163160
Nitrogen tank		MVE, Cryogenics	XC 43/28
Programmable Freezer		Planner Products Ltd.	Kryo-10 Series III
Forceps		Aesculap	BD-331R; BD-053R; OC-020R