병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMP) 트리거된 식물의 내성 (PTI)에 대한 분석

요약

Nicotiana benthamiana 공장에서 PTI에 대한 세포 죽음 기반 분석을 설명합니다.

초록

자신의 환경에서 잠재적인 병원체를 인식하기 위해, 식물은 패턴 인식 수용체 (PRRs)가 자신의 플라즈마 점막에있는 사용합니다. PRRs는 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs)라는 미생물 보존 기능을 인식하고이 감지 효과적으로 비 병원균의 ^1,2에 의해 식물 조직의 식민을 방지 PAMP - 트리거 면역 (PTI)에 연결됩니다. PTI에서 가장 잘 연구 시스템 FLS2 - 의존 경로 ^3입니다. FLS2은 박테리아 flagellin의 구성 요소입니다 PAMP flg22를 인식합니다.

성공적인 병원균은 독성 요인이나 PTI을 억제하고 병원균이 질병 ^1가 발생할 수 있습니다 effectors을 보유하고 있습니다. 차례로 일부 식물 effectors 또는 효과기 - 트리거 면역 (ETI) ² 리드 그들의 활동을 감지 저항 유전자를 보유하고 있습니다.

우리는 아와 Collmer ⁴ 수정 PTI에 대한 세포 사망 기반의 분석을 설명합니다. 분석은 N.의 표준되었습니다 식물 병원체 상호 작용 ⁵ 연구의 모델 시스템으로 점차 사용되고 있습니다 benthamiana. PTI는 나뭇잎으로 비 병원성 박테리아 스트레인의 침투에 의해 유발됩니다. 세븐 시간 후에, 그 박테리아 변종도 질병의 원인이나 어느 ETI 원래 침투 영역을 중복 영역으로 가득 활성화됩니다. 최초의 침투에 의해 유도된 PTI는 두 번째 도전 침투에 의한 세포 사망의 모양을 지연 또는 방지하기 위해 수 있습니다. 반대로, 접종의 중복 영역에서 세포 죽음의 모습은 PTI의 고장을 나타냅니다.

PTI 도전 예방 접종 inducers의 네 가지 조합 (표 1) 표준화되었습니다. 분석이 아닌 침묵 N.에서 테스트되었습니다 제어 및 PTI를 개발하는 능력에 손상 될 것으로 예측되었다 FLS2에 대한 입막음을 식물로 재직 benthamiana 식물.

프로토콜

1 부 : 식물의 성장 및 유지 보수

분석에 사용된 Nicotiana benthamiana 공장 약 7 주 된해야합니다. 그들은 모두 겨드랑 지점과 꽃을 제거하기 전에 분석 최소한 4~5일 손질하여야한다. 그것은 그들이 등장 후 식물보다 관리하기 위해 곧 겨드랑 지점을 제거하는 것이 좋습니다.

2 부 : 세균 문화

DAY 1 :

1. 분석에 사용된 모든 변종에 대해 번호판이나 문화가 동시에 시작됩니다. 모나스 종하십시오. 이는 냉동 글리세롤 주식 (표 2)에서 적절한 항생제를 포함하는 KBM 접시에 2 inducers 3 도전 변종, 리크 박테리아를 포함합니다. 박테리아의 소량은 접시의 중앙에 전파해야합니다. 약 18~24시간 30 ° C에서 번호판을 품어. , 30 Agrobacterium 들어, 신선한 플레이트에서 2 ML의 LB에서 액체 문화를 시작하고 250 rpm으로 하룻밤 사이에 성장 ° C.

DAY 2 :

2. 모나스 들어, 박테리아 액체 KBM의 150-200 μl를 추가하고 멸균 유리 확장기를 사용하여 전체 판을 통해 그들을 확산. 다시 인큐베이터에있는 접시를 넣어 다른 20~24시간에 대한 성장하자. 좋은 성장을 나타내는 접시 다음날에 세균 잔디가 있어야합니다. Agrobacterium의 경우, 20 μm의의 acetosyringone로 약 50-10 ML의 LB에서 보조 문화를 시작하고 그것이 250 RPM, 30 하루 20 시간을 기르 ° C.

파트 3 : 분석을위한 준비 식물

DAY 2 :

1. 분석 하루 전에는 식물이 22-24에서 객실로 이동해야 ° C ~ 35~40% RH 지속적인 조명.
2. 두꺼운 검은색 마커를 사용하여 직경이 최소 1.5 cm 아르 나뭇잎에 동그라미를 표시합니다. 두 시간 내지 네 동그라미는 잎 당 표시하실 수 있습니다. 동그라미가 잘 간격하고 선호 큰 정맥을 통과해서는 안됩니다. 잘 확장 나뭇잎을 선택합니다. 이전 나뭇잎이나 거친하거나 만지지 두꺼운 있으며 잎의 하단 부분에 동그라미를 표시하지 않도록 나뭇잎을 피하십시오.

마킹 원을 전에 실험에 하루 프로토콜에 필수되지 않습니다. 그러나, 그것은 assayed되는 식물의 큰 숫자가있다면 시간을 절약할 수 있으며, 쉽게 PTI의 유도 도전 예방 접종 사이의 정확한 타이밍을 달성할 수 있습니다.

4 부 : PTI의 유도

3 일 :

1. P. fluorescens와 P. 10 MM MgCl ₂ 접시에서 세포를 수확 putida. Agrobacterium 들어, 세포를 수집하는 문화를 원심과 10mM MgCl ₂ + 10 MM MES 산도 5.6에서 resuspend. MgCl ₂ MES 솔루션의 원심 분리와 resuspend를 반복합니다. 600 NM에있는 세포의 광학 밀도 (OD)를 측정합니다. 최종 필요한 값을 표 2에서 설명한대로. 모나스가 드디어 10 MM에 MgCl ₂ Agrobacterium을 resuspended되어야 MgCl ₂ - MES 솔루션 ODS를 조정합니다. 25 ML의 총 부피는 약 40-50 반점을 예방하기 위해 충분하다.
2. 1 ML needleless 주사기를 사용하여 나뭇잎에 미리 표시된 원을에 PTI의 inducers을 침투. 식물이 침투 순서와 침투가 시작되었다 정확한 시간을 적어 두십시오.

제 5 부 : 도전 접종

1. P. 준비 syringae PV. 토마토 DC3000, 일부 4.1 및 표 2에서 설명한대로 도전 PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 PS PV. tabaci.
2. 유도가 끝났다고으로 7 시간 유도의 침투 후 식물의 순서에 도전 침투를 수행합니다. 일반적으로, 첫 번째 접종 원의 주변에있는 요점은 두 번째 접종 원의 중심으로 사용할 수 있습니다. 나뭇잎의 여러 장소가있다면 다음 infiltrations가 중복되지 않도록 확인하십시오.
3. 정확한 CFU 번호를 확인하기 위해 적절한 항생제를 포함 KBM 또는 LB 접시에 분석에 사용된 모든 문화의 접시 시리얼 dilutions.

6 부 : PTI의 붕괴에 대한 점수

제 5 일 :

1. PST DC3000 맡고 있던 장소에 따라 ETI에 세포 죽음의 모습을 찾아보십시오. 침투의 중복 영역 내부의 세포 죽음은 PTI의 고장을 나타내는 긍정적인 표현형으로 득점한다.

일 7 :

2. PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 또는 PS PV 맡고 있던 장소에 의한 질병에 세포 죽음의 모습을 찾아보십시오. tabaci가 . 일부로 6.1에 설명된 같은 방식으로 긍정적인 표현형에 대한 점수.

컨트롤 식물 (PTI에 대한 타협해서는 안된다는)이 침투의 중복 영역에서 세포 죽음을 표시하기 시작하면, 더 이상 관찰하고 중지합니다.

7 부 : 대표 결과

그림 1은 분석 P.의 결과를 보여줍니다 fluorescens는 과제로 유도 및 PST의 DC3000로 사용되었다.

그림 1. P. fluorescens는 N.에 침투했다 benthamiana 나뭇잎 (블랙 서클)은 PTI를 유도하기 위해 7 시간 후에, 그 자리가 태평양 표준시 DC3000 (흰색 동그라미)와 함께 도전을했습니다. FLS2 위해 입을 식물 P. 지역의 PTI의 세부를 보여주 fluorescens는 세포 죽음으로 볼로, (A)에 침투했다. 침묵되지 않은 컨트롤 식물 PTI (B)의 유도에 의한 중복되는 지역에 세포 죽음을 보여주 없습니다. 빨간색 화살표가 부족하거나 침투의 중복 영역에서 세포 죽음의 존재를 나타냅니다. 사진은 2 일 infiltrations 후에 찍은. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

PTI의 유도	세포 죽음 - 도출 도전	세포 사망의 자연	암호
모나스 fluorescens 55	모나스 syringae PV 토마토 (PST). DC3000 6	ETI	PF / DC
P. putida KT2440	PST DC3000	ETI	PP / DC
P. fluorescens 55	PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 6	질병	Pf/Q1-1
Agrobacterium tumefaciens GV2260	P. syringae PV. tabaci 11528R	질병	농업 / Ptab

표 1 : PTI의 유도 및 세포의 조합 죽는 도출 PTI에 대한 세포 죽음의 분석에 사용되는 미생물.

박테리아 스트레인	선택 매체	최종 OD 실험에 사용	해당 CFU / ML
P. fluorescens 55	KBM 암피실린 (100 UG / ML)	0.5	1 X 10 9
P. putida KT2440	KBM 암피실린 (100 UG / ML)	0.5	1 X 10 8
A. tumefaciens GV2260	LB Rifampicin (100 UG / ML)	0.5	5 X 10 8
PST DC3000	KBM Rifampicin (100 UG / ML)	0.02	2 X 10 7
PST DC3000 Δ hopQ1 - 1	KBM Rifampicin (100 UG / ML)	0.1 100 배 희석	1 X 10 6
P. syringae PV. tabaci 11528R	KBM Rifampicin (100 UG / ML)	0.1 100 배 희석	1 X 10 6

표 2 : 문화 조건과 분석에 사용되는 inoculum 수준. OD와 해당 CFU 수준 spectrophotometers 서로 다른 브랜드 간의 차이가있을 수 있습니다.

토론

세포 죽음을 기반 분석은 PTI에있는 유전자의 참여를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 관심있는 유전자에 대한 손실 기능 돌연변이 분석을 사용하여 테스트하실 수 있습니다. 유도와 표 1에서 주어진 도전 예방 접종의 4 조합의 출력, 그것은 하나의 조합이 당신의 식물을 배경으로 표현형을 초래할 수도 있습니다. 우리는 FLS2에 대한 침묵 식물 PF / DC 및 유도 도전 예방 접종 (표 1) Pf/Q1-1 조합 PTI의 세부를 표시 것을 관찰했습니다.

그것은 분석을위한 환경 조건의 일부로 3.1에 ​​설명된 것과 가능한 한 가까운 것을 중요합니다. 낮은 습도는 점수에 대한 분석이 어렵게 너무 빨리 진행하기 위해 세포를 파괴됩니다. 우리 프로토콜에서 설명한 조건이 연구실에 작동하지 않는 경우, 유도 또는 도전의 접종 수준을 변경하십시오. 우리가 짧은 시간 간격은 분석이 통제 공장에서 너무 빨리 무너뜨리는 원인 것으로 나타났습니다하지만 수정할 수 있습니다 또 다른 매개 변수는 유도와 도전 사이의 시간 간격입니다.

우리는 적어도 4-5 식물 실험에 테스트하고 긍정적인 표현형 적어도 3-4 독립적인 실험으로 반복되어야하는 것이 좋습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Fisher Scientific	BP300-100	Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature.
Life Science UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	DU 730