전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

요약

우리는 조사 스캔 전기 분무 이온화 질량 분광법 (ESI / MS)를 사용하여 효모의 수많은 지질 수종을 식별하기위한 새로운 양적 lipidomics 방법을 설명합니다. 이 방법은 현재 lipids, 감도 및 속도의 다양한 분자 형태를 해결하는 능력 지질 식별 및 부량 사용할 방법을 초과했습니다.

초록

Lipids은 biomolecules의 주요 클래스 중 하나이며 중요한 역할 막 역학, 에너지 저장을 재생하고, 신호

프로토콜

재료 및 방법

1. 효모 변종과 성장 조건
   야생 형 변형 BY4742는 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) (1 % 효모 추출물, 펩톤 2 %, 2 % 포도당) 풍부한 YEPD 매체에서 재배되었다. 전지는 30 ° C 회전이 5시 1분의 "플라스크 볼륨 / 볼륨 매체"비율 Erlenmeyer flasks의 200 rpm으로 잡고 교양되었습니다.
2. 지질 추출을위한 효모 세포의 스토리지
   
   1. 세포의 50 ML 문화 5 분 동안 3,000 XG에서 원심 분리에 의해 수확했다.
   2. 찬물로 두 번 씻어.
      1. 25 ML 얼음 냉수에 Resuspend 펠릿
      2. 5 분 3,000 XG에 원심 분리기의 펠릿 세포
   3. eppendorf 튜브에 펠렛 및 전송을 Resuspend
   4. 원심 분리에 의해 펠렛, 2 분 16,000 XG, 사용할 때까지 -80 ° C에서 뜨는 및 동결을 제거하십시오. (우리는 이소 프로필 알코올의 비이커를 사용, 액체 질소도 사용할 수있는 -80 냉동실에 보관)
3. 시약
   생명 공학 등급 클로로포름과 메탄올은 시그마 - 알드리치에서 있었다. 자유 지방산과 triacylglycerols는 Larodan (말뫼, 스웨덴)에서 구입했다. phospholipids의 다양한 종류 - phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidic 산성 및 cardiolipins 포함하여 - 아반티 북극 지질 (엘라 베스터, AL, 미국)에서 얻은되었습니다. 테플론 늘어선 모자와 고속 유리 원심 분리기 튜브는 피셔에서 있었다.

지질 추출

이것은 블라과 다이어 ^{8 시까지} 설명한 프로토콜의 수정입니다. 추출 lipids로 모든 조작은 유리 pipettes이나 주사기를 사용하여 완료해야합니다, 그들은 클로로포름과 접촉하면 플라스틱이 큰 배경 신호를 생성합니다. MeOH - - 클로로포름에 대한 H ₂ 단계 3 O 및 2:2:1.8 - MeOH - H ₂ O 7 단계에서 보존 아르 클로로포름에 대한 1:2:0.8의 비율이로 정확한 볼륨은 한 중요하지 않습니다.

1. 얼음처럼 차가운 소주 H ₂ O.의 1.6 ML에 냉동 세포를 Resuspend
2. 고속 유리 원심 튜브에 세포 현탁액의 1.6 ML을 전송합니다.
3. 클로로포름과 MeOH (1시 2분) 믹스와 세포 현탁액을 유리 구슬의 0.8 ML 6 ML을 추가합니다.
4. 유리 구슬 1 분 두 배와 함께 소용돌이 세포 현탁액을.
5. 클로로포름 2 ML을 추가하고 부드럽게 섞는다.
6. 가끔 혼합과 함께 실온에서 5 분 알을 품다.
7. 소주 H ₂ O 2 ML을 추가하고 부드럽게 섞는다.
8. 가끔 혼합과 함께 실온에서 5 분 알을 품다.
9. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기.
10. 새로운 고속 유리 원심 튜브에 전체 액상를 수집합니다.
11. 9 단계에서 세포 펠렛을 클로로포름 3.2 ML를 추가합니다.
12. 1 분 와동을 차례로 두 번.
13. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기.
14. 10 단계에서 액상으로 뜨는을 추가합니다.
15. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기.
16. 상단 (수성) 단계를 폐기하고 새로운 고속 유리 원심 관에 낮은 (유기) 단계를 전송합니다.
17. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기.
18. 유리관에 전체 표면에 뜨는를 전송하고 질소하에 건조.
19. -20 ° C. 500 클로로포름의 μl와 저장소에있는 지질 필름을 디졸브

질량 분석법에 의해 lipids 분석

0.1 %로 클로로포름 (1:1) (V / V) 암모늄 수산화 - 클로로포름의 지질 기준 주식 혼합은 표 1과 같은뿐만 아니라 MeOH의 재고 솔루션마다 미리 준비를해야합니다.

1. 이전 주사로, 표 1에서 제공하는 lipids의 표준 혼합 10 μl와 샘플 10 μl을 결합. 1시 1분 클로로포름의 200μL의 경우 : 0.1 % NH ₄ OH와 메탄올.
   • 샘플 비율 표준은 필요에 따라 변경할 수 있습니다.
2. 1 μl / 분 유량에서 나노 전기 분무 소스 운영 갖춘 Micromass Q - TOF이 질량 분석기를 사용하여 lipids를 해결합니다.
   • 정확한 악기 매개 변수는 악기에서 악기로 달라질 수 있습니다. 나노 전기 분무 소스 갖춘 Micromass Q - ToF 2 (워터스, 밀퍼드, MA, 미국)의 설정 표 2를 참조하십시오. 우리는 질량 분석계의 Q - TOF 유형의 고해상도의 이점을 촬영했지만, 그것은 필수 요구하지 않습니다.
3. 취득 후 질량 스펙트럼은 smoothed 있으며, 배경 빼는와 중심 후 정상 목록은 Excel로 내보 냈습니다. 각 지질 클래스의 봉우리는 다음의 내부 기준에 정상화됩니다. 응용 프로그램에 따라, 그것은 deisotoping 및 deconvolution 등 추가로 후처리 등을 수행 할 필요가있을 수 있습니다.

표 1. 내부 지질 기준, 그들의 농도에표준 믹스, 그들의 분석을위한 MS 모드.

지질 클래스	표준 체인 구성	표준 질량	농도 (μg / ML)	MS 모드
Phosphatidic 수 소산	14시 / 14시	591.40	100	부정
Phosphatidylethanolamine	14시 / 14시	634.45	200	부정
Phosphatidylinositol	N / A	N / A	N / A	부정
Phosphatidylserine	14시 / 14시	622.37	40	부정
Cardiolipin	4x14 : 0	619.92	100	부정
자유 지방산	19시	297.28	100	부정
Phosphatidylcholine	14시 / 14시	650.48	100	긍정적인
Triacylglycerols	13시 / 13시 / 13시	698.63	200	긍정적인

표 2. Micromass Q - ToF 2 (워터스, 밀퍼드, MA, 미국)의 인스 트루먼트 설정은 나노 전기 분무 소스와 함께 갖추고 있습니다.

	유량	콘 전압	모세관 전압	충돌 가스
긍정 모드	1μl/min	-28 V	3.0 KV	10
부정 모드	1μl/min	30 V	-3.2 KV	10

토론

이 방법은 쉽게 사용할 수, 저렴한 재료를 사용하여 효모 lipidome의 급속한 양적 평가를 수 있습니다. 이러한 lipids가 수산화 리튬과 수산화 암모늄을 대체하여 확인할 수 있지만이 방법은, diacylglycerols, ergosterols 및 ergosteryl 에스테르를 제외한 효모 세포에있는 지질의 종류 대부분의 신분증을 수 있습니다. 설명한 방법은 농도 선형성은 진​​도 2 ~ 3 주문 (지질 종류에 따라 다름) 이상의 확산과 함?...