난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용

요약

SC1 라스 - GAP 및 ERK1의 이중 억제를 통해 기능을 수행합니다. 우리는 난생의 부재에서 마우스 ES 세포 자기 갱신을 지원 SC1의 기능을 테스트하고 SC1은 마우스 ES 세포 배양의 자기 갱신을 유지할 수 있는지 보여주었다.

초록

마우스 배아 줄기 (ES) 세포는 통상 자기 갱신을 유지하기 위해 백혈병 억제 팩터 (난생)와 양식입니다.

프로토콜

1. MEF 피더 플레이트의 준비

1. culturing의 ES 세포 전에 하루의 해동 한 병을 조사 E14.5 CF - 1 MEF의 피더 세포 (ES 세포를 해동하는 방법에 대한 절차를 참조).
2. 10000 세포의 밀도에 플레이트 MEF 피더 셀 / 물론 12 잘 플레이트 인치 37 ° C와 5% CO ₂ 밤새 세포를 품어. MEF 세포 미디어 : DMEM 10 % ES - PBS, 1X 및 1X 글루타민이 아닌 필수 아미노산과 보충.

2. 마우스 ES 세포 자기 갱신의 유지 관리

1. 트립신을 사용하여 ES 세포를 분리합니다. / 잘 성장 미디어에 이전에 준비 MEF 피더 플레이트 (마네의 멤은 15 % KSR, 4 MM의 L - 글루타민, 0.1 MM 아닌 필수 아미노산과 1X BME와 보충)에 50,000의 세포 밀도에 씨앗 세포가 SC1과 보충 원하는 농도에서 (우리는 100 nm의, 300 NM, 1 μm의 사용). 우리는 또한 1,000 μ / 평범한의 ML과 보충했습니다 잘 긍정적인 컨트롤을 추가했습니다. 37 ° C와 5% CO ₂ 밤새 세포를 품어.
2. 문화 37 세포 ° C와 5% 각 구절에서 3~4일에 대한 CO _2. 새로고침 미디어마다 48시간.
3. 패시지 세포 초기 시딩 밀도로 유사한 밀도를 유지하는 트립신과 1시 10분에서 1시 15분까지. 5 구절 후, 세포가 immunocytochemistry를 사용하는 전형적인 pluripotency 마커의 표현에 대한 검사 수 있습니다.

3. Pluripotency 마커 Immunocytochemical 시험

1. 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
2. 실온에서 20 분 정착액 500 μl와 세포를 수정.
3. 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
4. 상온에 한 시간 동안 500 μl 차단 버퍼가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다.
5. 특정 차 항체 250 μl (1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 그리고 우리가 다음 dilutions에서 Nanog, Sox2, SSEA1, 그리고 Oct4를 사용)으로 세포를 품어
6. 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
7. (우리가 1 1:2000과 동키의 알렉사 플루어 ® 488과 안티 - 토끼 복합에서 알렉사 플루어와 안티 - 마우스 복합 ® 555 당나귀를 사용하여 빛으로부터 멀리 보관, 상온에서 두 시간 동안 이차 항체 250 μl와 세포를 품어 : 2000).
8. 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
9. 마지막으로 씻어 DAPI를 (최종 농도가 1 μg / ML) 추가하고 핵을 시각화하기 위해 5 분 알을 품다.
10. 형광 현미경으로 세포를 분석합니다.

4. 대표 결과 :

1. 형태 결과 :

마우스 ES 세포 (ESC R1)가 undifferentiated 상태에서 자기 갱신을 유지하기 위해 난생 또는 SC1 중의 면전에서 MEF 피더 세포에서 성장했다. 두 번째 통로 후, 차별화는 평범한 또는 SC1 (대조군)하지 않고 세포에서 관찰 될 수있는 5 구절 후 본질적으로 아무런 undifferentiated 식민지는 관찰되지 않았습니다. 난생 (긍정적인 제어) 처리 식민지는 5 세포 통로를 통해 undifferentiated 상태에 있었다. 300 NM 또는 100 nm의의 농도에서 SC1로 치료 세포도 다섯 구절 후 undifferentiated 남아 그러나, 세포는 네 번째 통로 후 1 μm의 SC1 경험이 세포 죽음으로 취급. (애플 리케이션 노트 그림 2) 표 1은 형태학의 관찰을 요약한 것입니다.

2. Pluripotency 마커 표현

5 구절에 대한 유지 마우스 ES 세포는 SSEA1, Oct4, Nanog와 Sox2에 대한 고정 및 immunocytochemistry에 의해 조사되었다. 마커 표현이 평범한 유지 세포와 유사했다. (애플 리케이션 노트의 그림 3과 4)

그림 1 : 난생 또는 SC1 유지 세포의 형태론 비교. 형태에 차이는 관찰되지 않았습니다.

그림 2와 그림 3 : Nanog, SSEA1, Sox2, 그리고 SC1 또는 평범한 (애플 리케이션 노트의 그림 4) 유지 ES 세포의 Oct4 염색법. SC1 유지 전지는 평범한 유지 세포와 유사한 pluripotency 표시자 표현을 보여줍니다.

표 1

	대조군	평범한 긍정적인 제어	SC1 1uM	SC1 300 NM	SC1 100 NM
첫째 패시지	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태
둘째 패시지	어떤 차별 형태	일반 ES 셀 형태	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태
셋째 패시지	차별화된 세포의 대부분	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태
넷째 패시지	아무 ESC 식민지 없음	일반 ES 세포 형태	세포 죽음은 관찰	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태
다섯째 패시지	차별	일반 ES 세포 형태	세포 죽음은 관찰	일반 ES 세포 형태	일반 ES 세포 형태

토론

작은 분자 SC1은 마우스 ES 세포에서 undifferentiated 상태와 자기 갱신을 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 안된 세포 라인에 사용하기 전에, 그러나, 그것은 최적의 농도를 결정하기 위해 titrated해야합니다. 예를 들어, 마우스 ES 세포 라인 ESC R1 세 농도를​​ 테스트. 100 nm의 300 나노미터 농도가 마우스 ES 세포를 유지 수 있었던 것은, 그러나, 1 μm의 농도가 독성이되었다.

SC1 또한 피더 무료 조건에서 사용할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279