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Method Article
이 문서에서 우리는 photobleaching 후 다중 광자 형광 복구를 사용하여 확산 계수를 측정하기위한 절차를 설명합니다. 우리는 샘플에 대한 광학 경로를 따라 레이저를 정렬하고 적절한 실험 매개 변수를 결정함으로써 시작되며, 다음 발생을 계속하고 마지막으로 피팅 형광 복구 곡선.
photobleaching 후 다중 형광 복구 macromolecules의 확산 계수 (또는 유사한 전송 매개 변수)을 측정하는 데 사용되는 현미경 기술이며, 모두에 적용할 수있는
1. 광학을 맞춥니다.
MP - FRAP 실험을위한 주요 장비는 다음과 같습니다 모드 잠금 레이저 소스, Pockels 셀 (빔 변조에 대한), 펄스 발생기, 이색성, 객관적인 렌즈, 형광 방출 필터, 게이 티드 photomultiplier 튜브 및 데이터 기록 시스템 (광자 카운터 그리고 멀티채널 스케일러).
2. 안전 모니터 권한을 확인합니다.
3. 펄스 발생기와 다중 스케일러의 입력 매개 변수를 확인합니다.
4. 여기 채도에 대한 테스트합니다.
5. MP - FRAP 곡선을 복용 계속합니다.
6. 데이터 분석.
7. 대표 결과.
그림 1. 대표 표백제와 FITC - BSA에 대한 복구 곡선. 좋은 복구 곡선은 데이터의 후반에 대해보고하는 전체 복구에서 형광과 함께 강력한 표백 및 원활한 복구를 전시하고 있습니다.
그림 2. FITC - BSA를위한 표준화 복구 곡선 (적색)와 관련된 최소 제곱 적합 (블랙). 이 적합 문헌과 일치 52.9 um2 / s의 확산 계수를 산출.
photobleaching 후 다중 광자 형광 회복의 능력은 3D 해상도 두꺼운 샘플을 탐사하는 기능에있다. 1990 년대에 개발 이후, MP - FRAP은 세포 기관, 전직 생체내 두꺼운 조직 슬라이스하고, 생체내 조직과 interstitium에의 확산 계수 (또는 유사한 전송 매개 변수)를 결정하는 데 사용되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 실험 매개 변수를 설정 데이터를 복용하고, 복구 곡선을 분석, MP - FRAP 실...
이 작품은 호프 학술 상 국방 시대의학과 (제 W81XWH - 05-0396)과 에드워드 B. 브라운 III에 의생명 과학 수상의 퓨 학술 의해 투자되었다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
FITC-BSA | Invitrogen | -- |
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