KLRG1 Tetramer의 생산을위한 프로토콜

요약

이 프로토콜은 KLRG1 리간드의 분석을위한 강력한 도구입니다 KLRG1 tetramer의 생산을 설명합니다.

초록

킬러 세포 렉틴 같은 수용체 G1 (KLRG1)은 C 타입 렉틴 같은 superfamily에 속하는 유형 II의 transmembrane의 당단백질 수용체 억제합니다. KLRG1는 단량체로서 이황화 결합 homodimer로 모두 존재합니다. 이 잘 보존되어 수용체가 가장 성숙하고 최근에 활성화된 NK 세포에서뿐만 아니라 효과기 / 메모리 T 세포의 일부에서 발견됩니다.

KLRG1 tetramer뿐만 아니라 다른 방법을 사용하여, E -, N - 및 R - cadherins은 KLRG1 리간드로 확인되었습니다. 이러한 칼슘 ^{2 +에} 의존 세포 - 세포 부착 분자는 세포 - 세포 상호 작용, transmembrane 도메인과 굴지의 cytoskeleton에 연결된 세포질 도메인에 대해 책임을 다섯 cadherin의 반복을 포함하는 세포외 도메인에 구성되어 있습니다.

KLRG1 tetramer의 생성은 KLRG1 리간드의 식별에 필수되었습니다. KLRG1 tetramer 또한 면역 반응 및 조직 무결성을 규제의 역할 cadherin과 KLRG1 재생을 명료하게하다 수있는 유일한 도구입니다.

프로토콜

포함 기관의 준비

1. TB 4 X 500 ML flasks의 예방 각각 KLRG1 플라스미드 구조를 표현하는 박테리아의 야간 문화와 50 μg / carbenicillin과 chloramphenicol의 ML을 포함. OD 600 nm의에서 0.6 A를 도달하면, 37에서 0.4 M IPTG의 추가와 함께 유도하고 떨고 추가 4 시간 동안 문화를 품어 ° C.
2. resuspension 버퍼 산도에서 수확한 세포를 Resuspend = 8.0 (50 MM 트리스 - HCL, 25 % (W / V) 자당, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM DTT). 참고 : 알약이 단계에서 냉동 수 있습니다.
3. 폴리 프로필렌의 비커에 세균성 resuspensions의 더 이상 60 이상 ML을 풀. 필요는 TE 버퍼 산도 8.0 60 ML에 적응 절반 속도로 혼합물을 저어하는 경우.
4. 혼합물을 교반하려면 드롭 현명한 추가 라이 소 자임 (최종 = 1 MG / ML), MgCl2 (최종 = 5 ㎜), 2 MG DNAse 나는 50 % 글리세롤 75 MM NaCl, 트리톤 - X100 (최종 = 1 %), DTT를 (들어 최종 = 10 ㎜).
5. 1.5 분 얼음 솔루션을 Sonicate 4에서 10 분, 5,000 RPM에서 lysates을 원심 ° C.
   1. 뜨는을 가만히 따르다.
   2. 세척 버퍼 산도 15 ML 추가 = 8.0 (50 MM 트리스 - HCL, 0.5 % 트리톤 X - 100, 100 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM DTT).
   3. 펠렛가 완전히 resuspended 때까지 얼음, 1.5 분 솔루션을 sonicate.
   4. 4 10 분 5,000 RPM에서 샘플을 원심 ° C.
   5. 세탁 5 회 반복합니다.
6. TE 버퍼 4 ML에서 트리톤 X - 100, 원심 분리기 및 resuspend없이 세척 버퍼와 5B를 반복합니다.
7. 30-100 MG / ML의 농도에 젖은 무게 포함 기관의 슬러리 및 TE 버퍼에 저장을 가져가라.

KLRG1의 Refolding

1. 버퍼 산도를 refolding 1 L 만들기 = 8.0 (0.4 M 아르기닌 - HCL, 0.1 M 트리스 산도 8-8.3, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.2 MM PMSF, 3 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 테아제 억제제의 알약, 5 MM의 GSH와 0.5 MM의 GSSG)과 오한 4 ° C 감동하면서.
2. 접는 혼합물에 주입에 대한 포함 시체를 준비 : 이것은 단백질의 최종 농도가 2 3 μm의 될 수 있도록 0.25 0.5 μm의 농도로 각 5 10 주사를 만들기 위해 이상적입니다.
   1. 10 MM β - 메르 캅 토 에탄올과 7 M GnHCl에 포함 기관 슬러리의 50 MG의 볼륨을 용융.
   2. 유지 37 포함 기관 / GnHCl 혼합 ° 30 C - 40 분 및 와동 매 5 분 (슬러리가 완전히 녹아되면 취소가됩니다) 전체 융해를 보장합니다.
   3. 4 microcentrifuge 30 분 최대 속도로 원심 분리기 ° C와 15 ML의 원심 관에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. 작은 거무스름한 펠릿 중 하나를 전송하지 마십시오.
3. 사출 버퍼 (3 M GnHCl, 10 MM의 NaAcetate, 산도 4.2,10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 볼륨을 조정하십시오.
4. 희석 포함 단체 1 ML 매 시간마다 주사. 주입하면, 높은 속도로 저어 각 드롭 사이 이초와 드롭하여 희석 포함 단체 드롭 1 ML를 추가합니다. 주입이 완료되면 낮은 속도로 저어.
5. 4 낮은 속도로 감동 밤새 계속 ° C.

Refolding 반응 농도

1. Millipore의 프로토콜에 따라, Amicon를 사용하여 사전에 필터링 (0.22 μm의이 여과) refolding 반응의 제 1 L를 집중 셀 및 ~ 10 ML에 YM10 NMWL 10K의 ultrafiltration 막 (Millipore)를 만들어 냈다.
2. 사용 Centriplus YM - 10 10K MWCO (Millipore).을 ≤ 2 ML에 집중

KLRG1 tetramer의 정화

1. 4 AKTAFPLC를 설정 ° C GE 헬스케어 설명서에 따라.
2. Sephacryl S - 200 60분의 16 고해상도 20 MM의 HEPES에서 열 (GE 헬스케어) 150 MM NaCl을 사용하여 크기를 제외 크로마 토그래피에 의해 KLRG1의 모노머 양식을 정화. (그림 1 참조).
3. Centriplus를 사용하여 한 ML에 집중 YM - 10 10K MWCO (Millipore).
4. KLRG1 단량체를 biotinylate하는 욕망의 프로토콜에 따라 비라 효소를 사용합니다.
5. 무료 비오틴은 2와 같은 크기 배제 크로마 토그래피에 의해 제거됩니다.
6. KLRG1 분자는 4 배 초과 어금니 PE 복합 streptavidin (BD Biosciences)와 KLRG1 단량체를 혼합하여 tetramerized 있습니다.

대표 결과

의 악타 FPLC 크기 배제 크로마 토그래피에서 그림 1. 대표 긍정적인 결과 KLRG1를 refolded. 그래프는 단량체의 분리 (83.52 ML), 이합체 (56.36 ML) 및 refolded KLRG1의 multimer (36.26 ML) 양식을 보여줍니다. 94.25 ML에있는 정상은 버퍼 교환을 나타냅니다.

토론

이 프로토콜에서는, 그것은 biotinylate, 정화하는 방법을 표시하고, tetramerize KLRG1입니다. KLRG1 tetramer는 유동세포계측법로 KLRG1 리간드 레이블을 사용할 수 있습니다. refolding 조건이 각각의 단백질에 대해 경험적으로 테스트해야되지만, 다른 C - 타입 lectins은 유사한 프로토콜을 사용 tetramerized 수 있습니다. 프로브, 고아 C - 타입 렉틴 수용체에 리간드로 tetramerized 단백질을 사용하면 잠재적으로 식별 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BirA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free	Reagent	Roche Group	11 836 170 001	or equivalent
Amicon Stirred Cell	Equipment	EMD Millipore	Model #8400	or equivalent
YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane	Filtration Supply	EMD Millipore	13642
15 ml YM10 concentrator	Filtration Supply	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	Equipment	GE Healthcare	18-1900-26
Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column	Equipment	GE Healthcare	17-1166-01
Strepavidin PE	Reagent	BD Biosciences	554061	or equivalent