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이 동영상은 늦게 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 Fura - 2를 사용하여 칼슘 수준의 neurite의 파생물 및 이미징을 보여줍니다.
이 비디오에서는, 우리는 늦은 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 절차는 번데기 형성 후 70-78 시간에 동물의 두뇌의 제거와 함께 시작됩니다. 고립된 두뇌는 혈청이없는 성장 매체에 여러 세척 다음 papain의 짧은 부화 후 표시됩니다. coverslip에 대한 미디어의 5 UL 드롭의 각 두뇌의 기계적 분리의 과정을 그림입니다. 포스트 mitotic의 뉴런의 axons과 dendrites이 분리되는 동안 소마 근처에서 털을 깎으하지만 뉴런은 도금 몇 시간 이내에 프로세스를 생성하기 시작합니다. 이미지 2 일에서 살고 문화를 보여줍니다. 뉴런은 문화의 첫 번째 주 동안 프로세스를 정교로 진행합니다. 특정의 연결 인구는 같은 GFP 또는 RFP 같은 형광 마커의 조직 구체적인 표현을 드라이브에 GAL4 라인을 사용하는 문화에서 확인할 수 있습니다. 전체 셀 녹음은 교양 뉴런은 기능, 자발적으로 적극적인 cholinergic 및 GABAergic 시냅스를 형성 증명하고있다. 짧은 비디오 세그먼트는 교양 뉴런의 접시에 자발적인 칼슘 과도 및 니코틴 evoked 칼슘 반응을 모니터하기 위해 칼슘 표시기 색소로 Fura - 2를 사용하여 교양 뉴런의 칼슘 역학을 보여줍니다. 이러한 pupal 뇌 문화 유전 및 약리 도구 중앙 시냅스 형성과 기능에 영향을 내장하고 외부 요인을 식별하는 데 사용될 수있는 유용한 모델 시스템입니다.
culturing의 하루 전에 준비 :
culturing의 날에
나도 층류 흐름 후드의 효소 솔루션 (ES)를 준비
II. DDM2 미디어 만들기
culturing의 당일 : DDM2를 만들기 위해 다음과 같은 보충제를 추가
DMEM의 10 ML은 culturing 전에 보충제를 추가합니다 :
참고 : 계획 모두 문화 (각 두뇌 개인 35mm 페트리 접시에 하나 coverslip, 1.5 미디어 MS / 문화 도금)에 대한 충분한 DDM2 확인
단계 III - VI는 한 nonsterile 실험실 벤치에있을 수있는 45 분 이내에 완료해야합니다.
III. Pupae 콜렉션
참고 : 우리가 일반적으로 번데기 형성 (APF) 이후 55-78시간 사이 pupae의 두뇌를 사용합니다. neurite 가지의 전반적인 수준이 가장 오래된 pupae에서 약간 낮은 상태에서 머리 캡슐이 붕괴하는 경향 때문에 이것은 젊은 pupae에서 두뇌를 해부하다하는 약간 어렵습니다. 캔턴 - S wildtype 스트레인에서 다음 단계가 다른 작은 안료와 약간 붉은 갈색 빛을 아르 색소 눈이 인정하고 있습니다.
IV. 해부 현미경으로 잘린
해부 현미경으로 머리에서 두뇌의 V. 제거
VI. 광학 엽 (叶)의 제거 및 효소 처리
무균 층류 후드 안쪽 - 조직이 공기에 노출되어있는 모든 단계의 나머지 단계에 대한 층류 후드에서 수행되어야합니다.
VII. 세탁
VIII. 해부 현미경으로 분쇄 및 도금
IX. 수유 셀
그들이 neurites을 확장하고 기능적인 시냅스 연결을 형성 어디 배아 / 출생 후의 설치류 동물의 두뇌에서 수확 뉴런은 기본 세포 배양 재배하실 수 있습니다. 이러한 문화의 준비를위한 방법은 잘 구축하고 있으며 설치류의 연결을 문화의 연구 버렸네 형성과 기능의 조절 (뱅커와 고슬린, 1991)에 관련된 유전자와 환경 요인을 식별하는 중요한 역할을했습니다. 인류의 다양한 곤충 뉴런도 문화의 성장 수 있지만, 문...
이 작품은 DKOD에 NIH 부여 NS27501에 의해 지원되었다. 이 작품에 대한 추가 지원은 HHMI 교수 프로그램을 통해 DKOD 지원하는 UC 어바인에 부여에 의해 제공되었다.
코팅 Coverslips : 60mm 배양 접시에있는 autoclaved coverslips 놔. 절약의 Pipet 5 UL 각 coverslip의 중심에 A / Laminin 믹스. 2 시간 37 C 인큐베이터에 놓습니다. autoclaved 물을 각각 100 UL과 배 coverslips 린스. 멸균 파스퇴르 pipet에 연결된 진공을 사용합니다. 헹굼 마지막 동안, 집게로 coverslip을 선택하고 양면을 건조. 35mm 페트리 접시에 coverslip을 전송합니다. 한달에 최대 상온에서 보관하십시오.
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