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이 문서는 분리를위한 방법과 culturing 퀘일 또는 닭고기 HH14를 제공합니다 - 밸브 endocardial 세포와 HH25 밸브 쿠션 mesenchymal 세포.
배아 심장 밸브의 올바른 형성과 기능은 개발 진행을 위해 중요합니다. 초기 배아 심장은 myocardium 둘러싸인 endocardium의 U - 모양의 튜브입니다. myocardium secretes 심장 젤리, 방실 (AV) 접합 및 유출 트랙트 (OFT) 루멘으로 hyaluronan 풍부한 젤라틴 매트릭스. 단계에서 HH14 valvulogenesis는 endocardial 세포의 일부가 mesenchymal 변환 (EMT)에 endocardial myocardium의 신호를 받아야 받게하고, 심장 젤리를 침공 때 시작됩니다. HH25 단계에서 밸브 모양의 쿠션을 완전히 mesenchymalized, 그리고 그것은 결국 심장의 밸브 모양의 장치와 septal을 형성하고이 mesenchyme집니다. EMT 및 세포 분화의 과정을 시작하고 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 심각한 선천성 심장 때문에 결함들의 연결 중요합니다. 본 연구에서는 우리는 prevalvular 쿠션의 두 가지 세포 phenotypes 아르 사전 EMT endocardial 및 사후 응급 mesenchymal 세포를 분리하는 방법을 제시한다. 사전 EMT endocardial 세포 또는 myocardium없이 교양 수 있습니다. 포스트 EMT 유명 쿠션 mesenchymal 세포 내부 기계 제약이나 스트레스없는 콜라겐 젤을 배양해 수 있습니다. 체외 모델에서 이러한 3D 주요 밸브 모양의 morphogenic 이벤트를 모방하고 초기 늦게 무대 valvulogenesis의 메커니즘을 deconstructing하는 데 유용합니다.
1. 준비
2. 사전 EMT Endocardial 전지 격리와 문화
3. 포스트 EMT AV 쿠션 Mesenchymal 세포 분리 및 문화
4. 대표 결과
그림 1 :. 배아의 예 (A) HH14 - 퀘일 배아, 그리고 (B) HH25 닭 배아가 여기에 표시됩니다.
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그림 2 : 문화의 2 시간 후에 HH14 밸브 endocardial explants (A) myocardium 선물로, 또는 (B) myocardium 제거와 함께..
그림 3 :. HH14 밸브 endocardial explants가 (A) myocardium 선물로 세포의 많은 mesenchymal 변화에 endocardial 받아야과 문화 48 시간 후 스핀들 모양, mesenchymal 표현형 있습니다. (B) myocardium가 세포의 제거되면 문화의 48 시간 후 조약돌 모양, endocardial 표현형를 유지합니다.
그림 4 :. 콜라겐 젤의 HH25 밸브 mesenchymal 세포 세포 즉시 시딩 후 반올림됩니다.
그림 5 :. 문화 HH25 mesenchymal 세포 (A) 제약 콜라겐 젤 문화 48 시간 후 HH25 mesenchymal 세포가 확산 시작됩니다. (B) 칠일 해방 후 시딩 및 6 일 후에 스트레스없는 콜라겐 젤의 HH25 세포는 원래 면적의 약 50 % 젤 압축된있다.
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무대 HH14에서 endocardial 세포 분리를위한 방법 - 원래 런얀 및 Markwald 개발한 마음은 시작과 배아 EMT 2 조절 요인을 연구하기 위해 체외 환경에서 제어를 제공합니다. HH14 - myocardium하지 않고 교양 endocardial explants가 biomechanical 또는 생화 학적 개입없이 EMT를 받아야하지 않습니다. myocardium가 explant에 남아있다면 그것은 mesenchymal 변화를 받아야하는 endocardial 세포의 하위 ?...
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승모판 07CVD04 :이 연구는 하트웰 재단, 미국 심장 협회 (과학자 개발 권한 부여 # 0830384N) 및 재단 Leducq에 의해 지원됩니다.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | |
Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | |
Sterile transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | |
4-well culture plates | Nalge Nunc international | 176740 | |
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalge Nunc international | 566-0020 | |
Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR international | 25384-342 | |
Laboratory tape | VWR international | 89097-920 | |
Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | |
10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | |
M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | |
Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | ||
Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
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