반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

요약

우리는 체세포 핵 전송 (SCNT)를 통해 epigenetic 프로그래밍이 사전 정의된 T 세포 수용체 (TCR) specificities와 마우스 모델을 생성하는 도구로 사용할 수 여기를 보여줍니다. 이러한 transnuclear 생쥐는 내생 모터의 제어하에 자신의 내생 로커스에서 해당 TCR을 표현.

초록

같은 T 세포와 같은 Lymphocytes은 어떤 특이성 ¹ 수용체를 생성, 유전자 V (D) J 재조합을 받고있다. 에 대한 유전자 변형 쥐 뜯어 항원에 특정한 T 세포 수용체 (TCR)가 T 세포 개발 및 기능을 연구하기 위해 필수적인 도구가되었습니다. 그러나, TCRs는 대개 피할 높은 친화력과 T 세포에 대한 선택 반복 항원 자극, 다음과 같은 장기적인 문화 이후 관련 T 세포에서 격리됩니다. TCR의 임의 게놈 통합 α -와 β - 체인 및 비 내생 발기인의 표현이 표현 수준과 속도론의 차이가 발생할 수 있습니다.

체세포 핵 송금을 통해 Epigenetic 프로그래밍 관심의 세포에서 배아 줄기 세포와 마우스를 생성하는 도구를 제공합니다. epigenetic 자국이 재설정하는 동안 따라서, SCNT가 알려진 특이성의 T 세포에 적용되었을 때, 이러한 유전자 V (D) J의 rearrangements는 SCNT - 배아 줄기 세포 (ESCs) 및 그들에서 파생 마우스로 전송됩니다. Toxoplasma gondii 우리에 대해 미리 정의된 specificities와 T 세포가 실험적으로 도입 유전자 수정하지 않고, 그들의 내생 loci에서 특정 TCR을 표현 마우스 모델을 생성하는 데 사용할 수있는 것을 증명하고있다. 이러한 transnuclear 모델 얻을 수있는 상대 간편하고 속도가 다른 질병 모델의 건설에 대한 약속을 보유하고 있습니다.

프로토콜

이 방법에 보고된 연구에 사용된 Kirak 외., 과학 328 (5975), 243-248 (2010)가 .

1. 기증자 세포 분리

특정 T 또는 B 세포가 transnuclear 마우스 모델을 생성하기 위해 기증자 세포로 사용할 수 있습니다 전에 쥐를 관심의 병원체와 감염이나 관심의 항원과 예방 접종을해야합니다. Toxoplasma gondii 우리가 특정 CD8 + 세포를 사용했기 때문에 다음과 같은 프로토콜은 개인적인 관심에 따라 적응 이러한 세포와 요구의 생성 및 절연을 설명합니다.

1. 마우스 뇌 homogenate (40)에서 파생된 Cysts는 BL / 6 H - 2 ^B와 H - 2 ^D 제한 CD8 + T 세포 모두의 고립을 가능하게 X Balb / C F1 (B6CF1) 마우스로 내부 peritoneally를 주입하고 있습니다.
2. 면역 반응의 정상에 감염된 마우스 euthanized이며, 비장 고립 6 ML 적혈구 세포 (RBC) 용해 버퍼를 포함하고있는 그릇에 배치.
3. 두건의 살인 사건이 은폐 슬라이드의 서리 낀 측면을 사용하여 비장이 신중하게 지상과 RT에서 5 분 RBC의 용해 버퍼에서 incubated입니다.
4. 14 ML PBS를 추가, 50 ML 팔콘 튜브와 300g에서 5 분 원심 분리기에 셀 스트레이너 (40 ~ 70 μm의)를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다.
5. 뜨는 제거, 세포 펠렛은 1.5 ML Eppendorf 튜브에 1 ML PBS 및 전송에 resuspend. 300g에서 5 분 원심 분리기와 나중에 뜨는를 제거합니다.
6. , 50 μL PBS에 세포 펠렛을 Resuspend 관심의 세포 유형 (예 인 경우에는 3 번 CD, B220, CD8 및 CD4)를 식별 찬란 표시된 항체를 추가하고, 찬란 MHC - I tetramer (CD4 T 세포에 대한 MHC - II tetramer) 로드된 표시 4 30 분에 대한 세포 현탁액과 부화 관심 펩타이드 ° C.와 함께
7. 1 ML PBS, 3 ML PBS에서 300g, resuspend 펠렛에서 5 분 원심 분리기를 추가하고, 튜브에 세포 스트레이너 (40 ~ 70 μm의)를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다.
8. (그림 1B) stringently 성문을 설정하여 FACSorting을 수행합니다.

2. 체세포 핵 전송

체세포 핵 이전을위한 몇 가지 프로토콜이있다. 사람은 여기 Metaphase - II에서 체포 oocytes을 사용하게하고 Cytochalasin B. 따라서 기증자의 세포를 사용하여 두 번째 meiotic 부문의 억제가 G0/G1 단계에있는 필요합니다 설명했다.

1. oocytes의 준비
   1. BDF1 배경의 여성 생쥐는 오후 5시과 오후 7시 사이에 마우스를 따라 5IU PMS와 내부 peritoneally를 주입하고 있습니다.
   2. 약 47시간 후, 각각의 마우스는 5IU HCG와 내부 peritoneally를 주입합니다.
   3. HCG 주사 같은 날에 oocytes의 문화 요리 (KSOM - AA가 기름 방울 이하)을 준비하고 인큐베이터 37에 그들을 배치 ° C 5 % CO _2. 또한 수은을 로딩하여 SCNT (핵의 제거를위한 7μm 4 또는 림프구 핵의 핵 이전에 대한 5μm)에 필요한 바늘을 준비합니다.
   4. 쥐를 안락사와 HCG 후 13h (약 오전 8시)에 대한 oviducts을 분리. HCZB 1-2 방울의 oviducts를 수집합니다.
   5. 한 - 바이 - 하나 M2 W / Hyaluronidase을 포함하는 드롭으로 oviducts 이동합니다. 닉은 forcep과 함께 신중하게 수란관하고 드롭에 oocyte - 적운 - 복잡한 이동합니다. 모든 oocyte - 적운 - 단지가 고립되어 있고, 요리가 37 incubated 있습니다 ° C. 후
   6. 2-5 분 (정확한 시간은 Hyaluronidase의 배치에 따라 다름) oocytes를 수집 후, HCZB 및 플레이트 그들 KSOM - AA의 방울로에 씻으십시오.
2. oocytes의 핵의 제거
   1. SCNT 접시를 준비하기 위해 페트리 접시의 뚜껑을 사용합니다. 현미경 및 micromanipulator를 설정합니다.
   2. 핵의 제거와 함께 시작하기 전에 PVP에서 핵의 제거 바늘 (7 μm의)를 씻으십시오.
   3. 핵의 제거를위한, Cytochalasin B (5 μg / ML)로 HZCB의 드롭으로 oocytes의 그룹 (10-30)를 놓으십시오. 수평 라인 - 업 oocytes (5 분 min.) 잠복기 동안.
   4. 한 oocyte을 가지고 개최 바늘 앞에서 그것을 놓으십시오. 진공을 적용하여 잡고 바늘에 oocyte을 수정. 핵의 제거의 바늘을 사용하여 염색체 스핀들 - 복합 (CSC, 종종 "핵")를 3시 위치에까지 oocyte를 켜십시오.
   5. 압전 - 펄스는 oocyte를 손상하지 않고 신중하게 조나 pellucida 침투 사용합니다. Metaphase - II 스핀들에 인접한 바늘의 개방 장소와 진공을 적용합니다. "핵"는 천천히 바늘로 이동해야하고, 완전히 제거되면 멤브레인 자체가 봉쇄해야합니다.
   6. KSOM - AA 방울로 다시 enucleated oocytes를 전송하고, 그들에게 여러 번 씻는다. 전자를 반복oocytes의 새로운 그룹과 핵 단계. 모든 계란이 enucleated 또는 오전 11시에 대한 때까지 때까지 계속합니다.
3. 핵 전송
   1. 핵 전송, 교환 핵 전송 바늘 (4 ~ 5 μm의)와 PVP로 씻어와 핵의 제거 바늘 (7 μm의).
   2. , PVP와 드롭으로 관심의 세포를 (예 : CD8 + T 세포) 장​​소 잘 섞어 10 분 최소 품어.
   3. Cytochalasin B (2.5 μg / ML)로 HCZB의 드롭으로 enucleated oocytes의 그룹 (10-30)를 놓으십시오. 핵 전송 바늘을 사용하여 라인 업 oocytes 가로 (5 분 min.) 잠복기 동안.
   4. PVP - 세포 현탁액에서 기증자 세포를 들고 및 및 아웃 바깥 막가 (막과 cytosol의 조각이 표시되어야합니다) 분해 때까지 그것을 대기음. 필요한 경우 압전 - 펄스는 적용할 수 있습니다. 핵이 고립되면, 바늘에 약간에게 위로 이동하고 10-30을 때까지 핵을 데리러 진행합니다.
   5. 정렬 enucleated oocytes를 포함하는 드롭로 이동합니다. 진공을 적용하여 들고 바늘 한 oocyte을 수정. 핵 전송 바늘 (핵 될 멀리 열한다) 조나 pellucida에 인접하고 바늘이 조나 pellucida를 통과하기 전까지는 압전 - 펄스를 적용 플레이스. 신중하게, 바늘의 끝에 하나의 핵으로 이동 바늘 끝이 삼분의이 안에 때까지 oocyte에 바늘을 밀어. oocyte 막의 약간은 바늘에 있도록 작은 부정적인 압력을 적용합니다.
   6. oocyte 실제로 "열기"때 그것은 유일한 시간이기 때문에 다음 단계는 매우 중요합니다. , 압전의 단일 펄스를 적용 긍정적인 압력을 적용하여 바늘의 핵심을 밀어 조심스럽게 팁이 oocyte의 1 / 3에 대한되도록 바늘을 다시 끌어와 다음 적용을 부정적인 압력을하고 바늘을 다시 끌어 계속 oocyte을 봉쇄. 각 oocyte이 단계를 반복합니다.
   7. 그룹의 모든 oocytes이 핵을받은 후, 그들은 KSOM - AA 미디어의 세탁 및 양식입니다. 모든 oocytes이 절차를 반복합니다.
   8. 마지막 그룹은 30 분 최소 KSOM - AA의 문화를했습니다 후 SCNT - 배아는 SrCl2를 포함하는 CA - 무료 정품 미디어의 방울로 전송됩니다.
   9. 활성화 6 시간 후, 의사 pronuclei의 양을 (PPN) - 긍정적인 SCNT - 배아가 결정됩니다. 그들은 blastocyst 단계에 도달하기 전까지 배아는 다음 세탁 및 KSOM - AA에서 양식하는 것은 추가 3.5 일 방울.
   10. 약물 또는 화학 물질을 선택 (예 : Trichostatin 등)이 활성화 및 문화 미디어에 추가할 수 있습니다.

배아 줄기 세포의 3.Derivati​​on

SCNT - blastocysts은 의사 임신 여성 (또한 직접 또는 한 단계 복제라고도 함)로 그들을 전송하거나, 배아 줄기 세포를 (또한 간접 또는 두 단계의 복제라고도 함) 파생하는 데 사용할 수 있습니다. 그것이 훨씬 더 ES 세포를 생성하는 효율적인 것이므로, 우리는 두 단계 절차를 선택합니다. 과학자가 직접 복제에 관심이 경우에는 제 5에 설명한 바와 같이, blastocysts은 의사 임신 여성에 직접 전송할 수 있습니다.

배아 줄기 세포의 유도를 설명하는 많은 프로토콜이 있습니다. 여기에서 설명한 사람은 피더 세포 및 태아 송아지 혈청을 이용하여 표준 기술입니다.

1. 핵이 완료된 후 두 번째 날, ES 세포 유도를위한 96 U - 잘 접시를 준비합니다.
2. 10 분 최소 품어 96 U - 잘 플레이트의 각 우물에 다행 100 μL를 추가하고 나중에 그것을 제거합니다.
3. 해동 피더 세포와 ESD 매체에 따라 볼륨에 resuspend, 25cm ² 면적에 상응하는 등 피더 세포가 10 ML ESD 매체와 세포 현탁액 200 μL에 resuspended 아르는 젤라틴 - 처리 자의 각에 추가됩니다.
4. 37 보육과 문화에 접시를 넣어 ° C 5 % CO _2.
5. 3.5 일 후에 배아는 blastocyst 단계에서해야합니다.
6. 몇 방울의 ES 세포 매체와 산성 thyrode을 도금하여 살균 박테리아 요리를 준비합니다.
7. blastocysts 먼저 일반 ES 세포 매체를 포함 방울로 KSOM - AA 방울에서 전학을 두 번 세탁하고 있습니다.
8. 조심스럽게 산성 thyrode 한방울로 blastocysts 그룹을 (5-10 blastocysts) 전송 및 조나 pellucida가 해산 때까지 거기에 계속.
9. blastocysts은 다음 ES 매체와 드롭으로 전송 번 씻어 다음 피더 - 코팅 96 U - 잘 플레이트 (물론 하나에 하나 blastocyst)에 배치됩니다.
10. 배아는 그들을 방해하지 않고 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기에서 5~7일에 대한 양식입니다. 이것으로 배아 시간을 제공합니다피더 레이어 ttach, 그리고 가지를 형성합니다.
11. 각 우물에 ESD 매체 도금 모이통에 의해, 24 잘 접시를 준비, 예를 들어 12 ML ESD 매체 ^50cm이 피더의 동등한 resuspend, 각 우물에 세포 현탁액 500 μL를 추가합니다.
12. 조심스럽게 배아와 96 U - 잘 판에서 ESD 매체를 제거, 250 μL Hepes (또는 PBS)으로 두 번 각 잘 씻고, 50 μL 트립신을 추가하고 37 약 5 분 품어 ° C.
13. 가지는 단일 세포 현탁액, 37에서 24 잘 판과 부화로 전송 ° C, 5 % CO _2.로 나빠진 때까지 여러 번 위아래로 피펫
14. ESC의 유래가 성공했다면 ESC의 식민지가 7~10일 후 표시됩니다.

4.Blastocyst 주입

blastocysts의 주입은 유전자 변형 마우스 모델의 어떤 종류를 생성하는 루틴을 기술입니다. blastocysts 및 의사 임신 여성에 후속 송금의 주입이 잘 초과 수 있어야함을 언급하는 것이 중요합니다.

1. PMS와 HCG와 국무 여성 마우스는 섹션 2.1에서 설명한. HCG 주사는 남성 생쥐 (한 여자와 케이지 당 한 남성 마우스)와 함께 여성 쥐를 넣어 후에.
2. 그 다음날, 플러그에 대한 여자를 확인하십시오. 이 0.5dpc (일 게시물 성교)로 계산됩니다.
3. 수정된 배아는 다음 추가 3 일간 KSOM - AA 섹션 2.1에서 설명한하고, 교양 등 수란관에서 격리됩니다.
4. blastocyst 사출 (3.5dpc)의 당일 ES 세포를 준비합니다.
5. ES 세포에서 매체를 제거, 37, Hepes (또는 PBS)으로 두 번 씻어 트립신을 추가하고 5 분 품어 ° C.
6. ES 매체, 접시에 접시, 37에서 45-60 분 품어 ° C 5 % 피더 세포 (피더 세포가 빠르게 ES 세포보다 준수)의 양을 줄이기 위해 CO _2.와 Resuspend trypsinized 세포
7. 튜브에 세포 스트레이너 (40 ~ 70 μm의)를 통해 세포 현탁액을 전송하고, 1000rpm에서 5 분 원심 분리기.
8. 필요까지 얼음에 500 μL ES 매체와 저장소에 뜨는, resuspend 세포 펠렛을 제거합니다.
9. PVP와 HCZB를 포함하는 도금 방울에 의해 살균 세균 접시의 뚜껑을 준비합니다.
10. , 수은과 장착 위치에 놓는과 PVP로 씻는하여 15 μm의 바늘을 준비합니다.
11. HCZB와 드롭에 blastocysts (10-30 blastocysts)의 그룹을 장소, HCZB 다른 드롭으로 5-50 μL ES 세포 현탁액을 (농도에 따라 다름) 추가합니다.
12. 사출 바늘로 ES 세포를 (50-100 셀) 픽업.
13. blastocysts와 드롭로 이동합니다. 수평 blastocysts을 정렬하고, 진공을 적용하여 잡고 바늘로 하나를 수정.
14. 내부 세포 덩어리 (ICM)가 9시 위치에까지 주사 바늘을 사용하면 blastocyst을 켜십시오.
15. 3시 방향에서 분사 바늘을 플레이스, 바늘의 끝에 아무 ES 세포가 없다는 것을 확인하고, 주사 바늘이 조나 pellucida과 blastocoel에 trophectoderm를 통해 침투까지 압전 - 펄스를 적용합니다.
16. ES 세포는 ICM에 집중하므로, 몇 ES 세포를 (5-15 셀) 출시. 그룹의 모든 blastocysts은 ES 세포로 주입 때까지 계속합니다.
17. blastocysts 중 한 그룹이 완료되면 KSOM - AA에 두 번 그들을 씻어 모든 blastocysts가 주입되기 전까지는 그들 KSOM - AA와 드롭 유지.

5. 배아 전송

의사 - 임신 여성에 배아의 전달은 매우 신중하고 연구자의 기관의 지침에 따라 실시해야 수술을 나타냅니다.

1. 여성받는 쥐를 마취시키다 오른쪽 아래 사분면을 면도하고, 소독.
2. 사용 가위는 피부를 열고 피부에서 복막을 분리.
3. 복막 (붉은 반점)를 통해 난소를 찾아서, 그리고 난소 가까이에있는 복막을 엽니다.
4. 포셉 사용하여 신중하게 수란관을 움켜잡고 자궁을 빼낸다.
5. 입 피펫에 연결된 모세관과 함께 약 10 blastocysts의 그룹을 선택하십시오.
6. 한 집게로 자궁을 수정, 작은 바늘로 그것으로 작은 전체를 펀치, 그리고 자궁의 루멘에 blastocysts과 모세를 삽입합니다.
7. 조심스럽게 자궁에 배아를 출시하고 모세관을 제거하십시오.
8. 복강으로 다시 자궁으로 밀어.
9. 복막의 가장자리를 찾아 몇 바늘로 닫습니다.
10. 몇 스테이 플스와 마우스의 피부를 닫습니다.
11. 포스트 수술 고통 들어, 체중의 MG 당 5 μg의 Carprofen을 관리할 수 있습니다.

그림 1. 체세포 핵 세포B6CF1 배경으로 미리 정의된 T 세포의 양도. SCNT blastocysts에서 파생된 CD8 + T 세포와 배아 줄기 세포에서 생성된 배아의 절대와 상대 번호.

그림 2. SCNT 배아 줄기 세포로 주입 키메라 쥐를 대표 흐름 cytometric 분석. 게이트 번호 (총 CD8 + T 세포 당 퍼센트) 키메라 생쥐의 특정 CD8 + T 세포의 존재를 나타냅니다.

토론

우리는 SCNT가 미리 정의된 특이성과 T 세포에서 transnuclear 마우스를 생성하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시합니다. 여기에 표시되지 않지만,이 기술은 또한 미리 정의된 특이성과 B 세포에서 transnuclear 마우스를 생성하기 위해 사용 가능해야합니다.

고려해야 할 중요한 한 가지는 감염이나 예방 접종 및 T 또는 관심있는 B 세포를 분리하는 데 사용되는 마우스의 변형과 성별입니다. T와 B 세포가 일반적으로 매우 낮은 프로그래밍 효율을 가지고 있기 때문에, 우리는 원하는 haplotype의 F1 하이브리드를 사용하는 것이 좋습니다. 기증자 세포는 또한 섹스를 결정하기 때문에, 우리는 T 또는 남성 생쥐의 B 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 오직 남자 키메라 마우스들이 번식을 쉽고 빠르게하고 남성 생쥐와 germline 통해 TCR이나 BCR 전송 거지.

함께 찍은, 우리는 SCNT를 통해 그 epigenetic 프로그래밍이 면역 분야에 대한 큰 이점이 될 것입니다 마우스 모델의 소설 유형을 생성하기위한 강력한 도구를 나타냅니다 생각합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Red Blood Cell lysis Buffer	Sigma-Aldrich	R7757
Cell strainer	BD Biosciences	REF 352340
Pregnant Mare Serum (PMS)	Calbiochem	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Calbiochem	230734
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272	Type IV-S
KSOM-AA	EMD Millipore	MR-106-D
HCZB	EMD Millipore	MR-173-D	Customized medium
Ca-free medium for activation	EMD Millipore	MR-174-D	Customized medium
SrCl2	Sigma-Aldrich	255521	100mM = 10x
AlbuMAX I	GIBCO, by Life Technologies	11020-021
PVP	MP Biomedicals	102787	Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	500μg/ml = 100x
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552	5mM = 1000x
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310
Holding needle	Humagen	MPH-SM-30
Injection and transfer needles	Humagen	4-15, 7-15, 15-15
Mouth pipette	Sigma-Aldrich	A5177
Scissors	Fine Science Tools	14088-10	or something similar
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	or something similar
Wound Clip Applicator	BD Biosciences	427630
Wound Clips	BD Biosciences	427630
Suture	Ethicon Inc.	K871H
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
FBS	Hyclone	SH30071.03	15%
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100x
Glutamin	MP Biomedicals	101806	200mM = 100x
Non-essential Aminoacids	GIBCO, by Life Technologies	11140050	100x
β-Mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	21985-023	5μl in 500ml
LIF	EMD Millipore	ESG1106	1000x
MEK inhibitor	Cell Signaling Technology	9900L	For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM)