Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

요약

spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 채용함으로써, 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 효율성의 픽셀 수준의지도 게이 oligomeric 단지를 형성하기 위해 가상 막 수용체를 표현하는 세포를 얻을 수있다. 효율성의지도 걱정부터, 우리는 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 정보를 추정 할 수 있습니다.

초록

정보가 모두 혜택을 산업용 애플 리케이션뿐만 아니라 기본적인 근본적인 생물 학적 지식을 향상을 축적하기 때문에 살아있는 세포의 단백질 상호 작용의 연구는 연구의 중요한 영역입니다. 전자 흥분 상태에서 기증자의 분자와 가까운 수용체 분자 사이의 포스터 (형광) 공명 에너지 전송은 (무서워) 자주 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 위해 이용되었다. 관심의 단백질은 형광 프로브의 두 가지 종류의 태그 및 생물 학적 세포에 표현됩니다. 형광 프로브는 다음 일반적으로 레이저 빛을 이용하여, 흥분되며, 형광 프로브에서 냄새가 나는데 형광 방출의 스펙트럼 특성을 수집 및 분석이다. 단백질 상호 작용의 정도에 관한 정보는 스펙트럼 방출 데이터에 포함됩니다. 일반적으로, 세포가 정확하게 세포 내에서 관심을 각 지역의 단백질 상호 작용의 범위를 정할 충분한 스펙트럼 정보를 축적하기 위해 여러 번 스캔해야합니다. 그러나 이러한 영역의 분자 구성은 전체 세포 이상의 평균 명백한 걱정 효율성의 정량 값의 공간적 결정을 제한, 인수 과정의 과정에서 변경될 수 있습니다. spectrally 해결 두 광자 현미경을 통해, 우리는 관심의 샘플 단 하나의 완전한 여기 스캔 후 spectrally 해결 이미지의 전체 집합을 얻을 수 있습니다. 이 픽셀 수준의 스펙트럼 데이터의지도 세포 전반에 걸쳐 효율성이 계산됩니다 무서워. 의 실험적 얻은 배포 oligomeric 단지에 걱정의 간단한 이론을 적용하여 세포 전반에 걸쳐 효율성이 무서워, 하나의 spectrally 해결 검사 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 및 구조 정보를 보여줍니다. 여기 형광 프로브의 두 가지 종류의 태그가 막 수용체 (멸균이 α - 계수 수용체)을 표현하는 생물 학적 세포 (효모 Saccharomyces cerevisiae) 준비 절차를 설명합니다. 또한, 우리는 spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 사용하여 형광 데이터를 수집에 관련된 중요한 요소를 설명합니다. 이 프로토콜의 사용은 그것에 붙어 형광 마커로 살아있는 세포에 표현할 수 단백질의 모든 종류의 연구를 확장할 수 있습니다.

프로토콜

1. 플라스미드 디자인

관심의 단백질은 다음 설명한 바와 같이, 두 가지 형광 레이블 중 하나에 융합하고 있습니다. 형광 라벨은 단백질 ^1의 게이 oligomerization에 관한 세포 내에서 단백질의 위치뿐만 아니라, 양적 정보에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 형광 공명 에너지 전달 (무서워) ^2-4 기술은 ^50-10 단백질 상호 작용에 대한 정보를 축적하는 데 사용됩니다. 안달는 에너지의 전송이 unexcited 분자 쌍극자 - 쌍극자 상호 작용이 ^11를 통해 (일반적으로 수용체, A라고도 함)에 광학 흥분 분자 (일반적으로 기증자, D라고도 함)에서 발생할 수있는 원리를 이용하는 경우 두 분자 서로 가까이 와서. 융합 단백질을 인코딩 plasmids를 디자인에서 두 가지 핵심 기능이 마음에 부담되어야, 다음과 같은.

1. 형광 태그 호환 쌍의를 선택하면 공부를 걱정에 최고 중요성이다. 기증자 태그의 방출 스펙트럼과 수용체 태그의 여기 스펙트럼과 레이저 펄스 스펙트럼의 중심 파장 및 여기 스펙트럼 사이에 큰 분리 사이의 파장에서 감지할 수있을 정도의 중복 : 이상적으로, 형광등 태그 조합은 두 기준을 충족해야합니다 수용체의 (즉, 대형 스톡 시프트). 기증자 ¹⁴ 노란색 형광 단백질 (YFP) ¹² 또는의 변종 수용체로 불리는 금성 ^15과 같이 GFP ₂ : 녹색 형광 단백질 ¹² 두 ^{변종은, 13은} 특히 이러한 기준을 충족하기 위해 적합합니다. 세룰리안 ¹⁶ 좀 더 겸손한 결과지만, 기증자로도 사용될 수 있습니다.
2. 양적은 이미지를 안달에서는이 분자 복잡한에 하나의 기증자가 더 경쟁이 하나 이상의 기증자 하나의 수용체를 포함하는 단지에있는 동일한 수용체에 에너지를 전송하는 기증자 사이에 발생하지 않도록 (평균) 한 번에 흥분하는 경우 가장 적합합니다 . 이것은 이론 및 데이터 분석 과정 ¹⁷ simplifications 발생합니다. 그 때문에, 신호 레벨은 일반적으로 낮다. 이 무마하기 위해, 관심있는 단백질의 표현 수준은 상대적으로 높은해야합니다. 높은 표현 수준은 세포에 단백질 유전자를 수행하는 플라스미드 높은 복사본을 사용하여 얻을 수 있습니다.

2. 효모 변환

그것은 관심의 단백질 구조를 표현 세포 인구의 비율을 최대화하기 위해 유리합니다. 이러한 목적을 위해, 우리는 두 가지 plasmids, 선택 마커 트립토판을 포함하는 하나 하나 마커 유라실과 트립토판 또는 유라실을 생성 수없는 효모 세포 (Saccharomyces cerevisiae의)의 auxotrophic 긴장을 변환. plasmids은 또한 두 개의 형광 프로브 중 하나를 사용하여 태그를 관심의 단백질을 표현할 수있는 세포에 대한 지침을 수행 유전자를 포함하고 있습니다. 변형 세포는 트립토판과 유라실 부족 견고한 중간 접시에 성장하고 있습니다. 세포의 적어도 세 가지 유형이 변화되어야합니다 관심의 단백질을 표현하는 세포가 형광 프로브, 수용체 형광 프로브와 태그만을 단백질을 표현 기증자 형광 프로브 및 세포와 태그만을 단백질을 표현하는 세포의 두 종류의 태그.

1. 고체 중간 번호판 (효모 질소 기지 W / O 아미노산, 1.6 g / L 효모 합성 중퇴 매체 W / O 유라실과 트립토판, 2 % [W / V] 포도당, 2 % [W / V]의 1.7 g / L 준비 변형 세포에 대한 성장 매체 셀 변환하기 전에 최소한 1 일 이상으로 사용되는 한천). 그들이 어떤 오염 물질의 무료 남아있는 경우 고체 중간 접시가 준비 후 2 개월간 위해 사용할 수 있습니다.
2. 각각의 플라스미드 쌍 변환하기 위해서는, erlenmeyer 플라스크에 YPD (10g / L Bacto 효모 추출, 20g / L Bacto 펩톤, 2 % [W / V] 포도당) 10 ML를 추가합니다. 변환하는 효모 세포의 auxotrophic 변형의 식민지로 YPD을 Incoluate.
3. 샘플에 궤도 소용돌이 치는 동작을 제공하는 연구실 쉐이크에서 효모 문화를 포함하는 erlenmeyer 플라스크를 삽입하고, 30 밤새 품어 ° C. 다음 아침, 정기적으로의 작은 볼륨을 제거하여 세포 배양의 성장을 모니터링 시작 문화와 광학 밀도 (OD)를 테스트. 세포 배양의 성장은 변화의 시간에, 0.5-1.0의 OD 즉, 중반 로그 단계에서해야합니다.
4. 각각의 플라스미드 쌍에 대한 살균 microcentrifuge 관에 plasmids 두 종류의 예금 5 μL을 변환해야합니다.
5. 각각의 플라스미드 쌍 변환하기 위해서는, 빈 microcentrifuge 관에 연어 정자 DNA (5 MG / ML) 5 μL를 추가합니다. 5 분 동안 끓는 물에 연어 정자 DNA를 포함하는 microcentrifuge 관 잠수함의 아랫부분. 터지는 조합에서 microcentrifuge 관 뚜껑을 방지하기 위해EN만이 잠수함 물속에 microcentrifuge 튜브의 절반 아랫부분. 끓는 물에에서 제거한 후 적어도 2 분 동안 얼음에 연어 정자 DNA를 포함하는 microcentrifuge 튜브를 놓습니다.
6. plasmids를 포함하는 각 microcentrifuge 관에 연어 정자 DNA의 5 μL를 추가합니다.
7. 그것이 중간 단계를 로그 (0.5 및 1.0 사이 즉, OD 읽기)에 도달했음을 확인하는 성장 효모 문화의 OD를 측정.
8. 2 분 동안 1000xg에서 효모 현탁액을 원심 분리기.
9. 뜨는을 붓고와 소용돌이 믹서를 사용하여 소독을 탈이온수에 누룩 펠렛을 resuspend.
10. 2 분 동안 1000xg 다시 한 번 현탁액을 원심 분리기.
11. 뜨는을 취소하고 TE에서 0.1M LiOAc의 솔루션 펠렛을 (1.02 g LiAc, 산도 7.4의 1M 트리스의 10 ML, 그리고 pH를 8.0 10 0.1 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) ML) resuspend. TE에서 0.1M LiOAc의 볼륨 YPD에서 원래 효모 문화 볼륨의 1백분의 1 ^일 동일해야합니다.
12. plasmids를 포함하는 microcentrifuge 튜브 각 세포 100 μL를 배포합니다. plasmids와 세포를 혼합하기 위해 부드럽게 각 튜브를 버려.
13. microcentrifuge 튜브 각 [W / V] 폴리에틸렌 글리콜 (PEG ₄₀₀₀₎ 솔루션 44% 400 μL를 추가합니다.
14. 부드럽게 세포 plasmids와 PEG ₄₀₀₀ 섞는다. 세포를 파괴하지 않도록하기 위해이 시점에서 소용돌이 믹서를 사용하지 마십시오. 부드럽게 혼합하려면 microcentrifuge 캡과 집게손가락과 엄지손가락 사이의 microcentrifuge 관의 하단을 잡고, 천천히 튜브를 반전하고, 다음 천천히 수직 위치로 다시 튜브를 가져와. 그 원통 축에 대해 튜브 90 ° 회전 천천히 다시 반전. 이 과정 세포 microcentrifuge 관 벽의 전체 면적 아래 슬라이드 있도록 여러 번 반복합니다.
15. 45 분 동안 30 ° 인큐베이터에서 microcentrifuge 튜브를 놓습니다.
16. 45 분 부화 후 인큐베이터에서 세포를 제거하고 14 설명된 부드러운 혼합 절차를 반복합니다.
17. 42 ° 물을 욕조에 microcentrifuge 튜브를 삽입하고 15 분 동안 품어. 다시 한번, 유일한 잠수함 물속에 microcentrifuge 튜브의 아래쪽 절반을.
18. 42 ° 보육 후 microcentrifuge 튜브에 소독을 탈이온수 1 ML를 추가합니다.
19. 5 초 동안 탁상 microfuge에 튜브를 원심 분리기. micropipetter를 사용하여 튜브의 표면에 뜨는를 제거합니다.
20. microcentrifuge 튜브 각 소독 탈이온수 100 μL를 추가하고 역전 프로세스를 사용하여 세포와 소독을 탈이온수를 섞는다.
21. 그 microcentrifuge 관에 추가된 특정 plasmids에 대한 선택 성장 매체 플레이트에 하나 microcentrifuge 관의 내용을 추가합니다. 4-6 멸균 유리 비즈 (1mm 직경)를 추가합니다. 세포가 한천 성장 매체의 표면에 걸쳐되는 순서대로 변형 효모 세포와 유리 구슬의 비말을 포함하는 접시를 흔들어. 변형 세포의 각 집합에 대해이 과정을 반복합니다.
22. 오일 - 3 30 ° 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 3~5일 후, 1-3 당연 직경의 여러 효모 식민지의 성장 매체의 표면에 표시됩니다. 이때 세포가 spectrally 해결 두 광자 현미경으로 몇 군데 준비하고 있습니다.

3. spectrally 해결 두 광자 현미경을 보정

이러한 연구에 사용되는 spectrally 해결 두 광자 현미경은 ^{19 일} 다른 ¹⁸ 자세히 설명되었습니다. ~ 750-830 nm의 파장에 이르기까지의 femtosecond 펄스를 생성 사파이어 레이저 : 간단히, 높은 전력 고체 연속 파장 레이저는 모드 잠금 티를 펌프하는 데 사용됩니다. 레이저는 샘플에 회절 - 제한된 장소로 높은 NA 현미경의 목적으로 초점을 맞추고 있습니다. 여기는 두 광자 여기의 낮은 확률에 의한 광선의 초점 가까운 지역에서 발생합니다. 직교 컴퓨터 제어 검사 거울 쌍을 두 개의 서로 다른 방향 (프로토콜에 걸쳐 x와 y 방향으로 함)에있는 샘플의 비행기 내에서 광선의 초점을 번역하는 데 사용됩니다. 샘플의 조명 voxel에서 백 전파 형광 방출은 빛을 EM - CCD 배열의 픽셀에 사건을 내리는 전에 방출의 경로에 위치 전송 격자에 의해 스펙트럼 구성 요소로 분산됩니다. 따라서 광선의 초점 지역 내의 형광 분자 / 분자의 전체 스펙트럼 프로필 CCD 배열의 1 차원 (Y 방향)을 따라 얻어진다. 두 검사 거울 중 하나의 움직임을 사용하여 레이저 초점의 위치는 Y 방향에 수직으로 라인을 따라 샘플 내에서 스캔 수 있습니다. 이 단일 라인 스캔, 형광 분자 레스의 스펙트럼 프로파일 동안 CCD 카메라의 셔터 개방을 유지함으로써검사의 전체 라인을 따라 iding은 예제를 통해 레이저 광선 중 하나의 수색에 수집하고 있습니다. 세포 내에서 다른 Y 위치에서이 자연의 여러 라인 스캔을 축적하면 샘플 내에 거주하는 형광 단지 다수의 스펙트럼 프로파일을 제공합니다. 라인 스캔에서 얻은 이미지는 서로 다른 파장 ^{18 19} 샘플의 여러 XY 형광 강도 공간지도를 제공하기 위해 복원됩니다. 정확하게 재구성하고 XY 형광 강도 공간지도에 해당하는 실제 파장을 계산하기 위해서는 라인 스캔 프로토콜은 잘 특징 형광 방출 스펙트럼과 샘플을 사용하여 보정해야합니다.

1. spectrally 해결 두 광자 현미경은 위치의 숫자에 대한 관심의 예제를 통해 여기 빔의 초점을 스캔하여 몇 군데 셀에 올리고머의 단지에 대한 스펙트럼 정보를 축적.
2. 직교 스캐닝 미러의 두 사람은 두 개의 서로 다른 방향으로 예제를 통해 레이저 광선의 초점을 변환하는 데 사용됩니다. 스캔 미러의 움직임은 컴퓨터 제어와 CCD 카메라에서 형광 강도 데이터의 추출과 동기화됩니다.
3. 라인 스캔에서 빛의 특정 파장에 대응하는 형광 강도 공간지도를 복원하실 수 있습니다. 정확하게 XY 형광 강도 공간지도를 재구성하고 이러한지도의 각에 해당하는 실제 파장을 계산하기 위해서는 라인 스캔 프로토콜은 플루오레신 솔루션을 사용하여 보정해야합니다.
4. 보정 절차를 시작하려면 센터 기증자 태그의 최대 여기 파장, GFP ₂ 2X는 800 nm의 파장의에서 여기 스펙트럼. 센터 여기 스펙트럼을하려면, 그룹 속도 분산을 수정할 수있는 레이저 캐비티 내에있는 프리즘을 번역. 프리즘은 선형 전동 무대를 제어하는​​ 컴퓨터에 장착합니다.
5. 컴퓨터 프로그램을 사용하면 카메라는 어두운 노이즈를 줄이기 위해 자사의 최저 온도 달성하기 위해 CCD 칩의 온도를 낮출 수있는 CCD 칩에 명령을 보내기에 인터페이스입니다.
6. 현미경 슬라이드에 플루오레신 솔루션의 피펫 10 μL. 샘플의 얇은 층이 균일 coverslip과 현미경 슬라이드 사이의 지역에 분산되도록 coverslip로 커버.
7. coverslip의 표면에 침지 기름의 작은 방울 플레이스
8. 이제 XYZ 번역 단계 현미경 슬라이드를 고정하고 수동으로 광학 축 방향으로 무대 움직임을 제어하는 선형 액츄에이터를 조정하여 광학 축 방향으로 슬라이드 / 스테이지 번역. 현미경의 목적은 침지 기름의 드롭 접촉에 와서까지 슬라이드 / 스테이지 번역.
9. CCD 배열을 때리는 방출 표시등이 실시간으로 컴퓨터 화면에 표시되도록 데이터 수집의 비디오 모드로 전환, 카메라를 제어하는​​ 컴퓨터 프로그램을 사용합니다. 천천히, 레이저 광선의 초점 현장에 샘플을 가져 광학 축 방향으로 변환 단계를 제어하는​​ 마이크로 미터를 조정합니다.
10. 플루오레신 샘플 초점이 때, 방출은 CCD 배열에 날카로운 라인으로 나타납니다. CCD 배열에서 카메라를 제어하는​​ 컴퓨터 프로그램을 사용하여 컴퓨터에 픽셀 농도의 기록을 다운로드합니다. 이미지 J의 강도 값의 다운로드 매트릭스를 열고 형광등 지역을 통해 라인을 그리기로 CCD 배열에서 위치의 함수로 픽셀 강도를 측정합니다. 이미지 J 명령 플루오레신 샘플의 방출 스펙트럼을 설명하는 줄거리를 만드는 방법 → 플롯 프로필을 분석하십시오.
11. Y 방향의 레이저 초점의 움직임, CCD의 스펙트럼 차원 따라 정확히 하나의 픽셀에 의한 형광 스펙트럼의 피크 움직임의 예제 결과 이내에 그 인접 Y 위치를 제어하는 거울의 증분 매개 변수를 조정 배열입니다. , 예제에서 두 개의 서로 다른 Y 위치에 대한 플루오레신 스펙트럼의 강도 값 이미지를 다운로드 이미지 J와 함께 강도 이미지를 열고, 그리고 이미지 J 커서를 사용하여 형광 스펙트럼의 각 피크 픽셀 위치를 찾아 이것을 모니터합니다.
12. CCD 오픈 셔터 떠나는, X 방향의 예제를 통해 레이저 초점을 검사합니다. 스캔 라인을 따라 각 voxel의 방출 빛이 CCD 배열에 따라 사건을 가을한다.
13. 이 라인 스캔 얻은 CCD 배열에서 데이터를 저장하고 다음 CCD 배열의 픽셀을 선택 취소합니다.
14. 이 섹션의 11 단계에서 결정된 금액으로 Y 방향의 레이저 초점의 위치를 이동합니다.
15. 다시 한번 CCD AR의 셔터를 열어두고, 예제를 통해 X 방향으로 레이저 빔을 스캔레이와 데이터를 저장합니다.
16. 물리 영역까지이 줄을 스캔 절차를 반복합니다 ~ 하나의 생물 학적 세포의 크기 50 % 이상 큰이 레이저 빛으로 조명했습니다.
17. 행 특정 라인 스캔 이미지의 번호와 파장 사이의 관계는 서로 다른 파장 다중 XY 형광 강도 공간지도를 얻기 위해 이미지를 재구성하는 데 사용해야합니다. 특정 파장 (λ _J)의 XY 형광 방출 이미지를 얻으려면,이 파장에 해당하는 첫 번째 라인 스캔에서 얻은 이미지에 행 번호를 찾으십시오. 그런 다음 후속 라인 스캔 이미지의 인접한 행은 특정 파장에 대한 형광 방출 이미지의 다음 행에 해당합니다. 그 파장에서 시료의 형광 강도 XY 공간지도를 얻기 위해이 파장에 해당하는 모든 이미지 행을 스택. 다른 모든 얻을 파장에 대해이 절차를 반복합니다.
18. 각 XY 형광 강도 공간지도와 관련된 파장을 계산하려면, 배경 이미지 인덱스 (J)의 함수로 각 복원 이미지의 표준 형광 강도를 수정 결정합니다. 카메라 화소 스펙트럼 차원의 위치와 방출 광자의 파장 사이의 관계는 대략 선형이므로 복원 XY 형광 강도 공간적지도 이미지와 해당 파장 사이의 관계는 선형 다음과 같이 계산됩니다 :
    m의 값을 대변하는 사람이 어디에 :
    위의 형식주의에서 기호 λ _j는 J의 ^차 재건축 이미지의 파장을 나타냅니다. λ _맥스와 λ의 값은 _½ 플루오레신 샘플의 방출 스펙트럼에서 추출한 각각의 fluorescing 샘플의 형광 강도는 최대의 최대 반은 어떤의 파장에 대응하고 있습니다. 이미지 인덱스 J _맥스와 j는 각각 _½ 최대 형광 강도와 최대의 절반을 보유 복원 이미지에 일치합니다.

4. 관심 생물 학적 샘플에 대한 데이터 수집

1. 귀하의 샘플에 대한 데이터를 수집하려면 먼저 변형 효모 식민지와 보육 접시에서 제거합니다. 적어도 세 종류가 있어야 변형 세포의 전체 너비 반 최대 (FWHM) :
   1. 관심의 단백질을 표현하는 세포가 형광 프로브 두 가지 유형의 태그
   2. 기증자 형광 프로브와 태그만을 단백질을 표현 세포, 그리고
   3. 수용체 형광 프로브와 태그만을 단백질을 표현 세포.
2. microcentrifuge 관 100 MM의 KCl 100 μL를 추가합니다. micropipette 팁을 사용, 기증자 및 수용체 형광 프로브를 모두 태그 단백질을 표현 세포의 접시의 3-5 효모 식민지를 긁어하고, 이들 세포와 함께 100 MM KCl의 예방.
3. 세포 현탁액의 10 μL를 제거하고 새로운 현미경 슬라이드에 분배, coverslip으로 비말을 커버하고 coverslip의 표면에 기름의 비말을 넣으십시오.
4. 현미경 목표에 도달에서 레이저 빛을 차단하는 레이저 빔의 경로에있는 셔터를 수동으로 닫습니다.
5. 현미경의 목적은 침지 기름의 드롭 접촉에 와서까지 XYZ 번역 단계 현미경 슬라이드를 고정하고 광학 축 방향으로 슬라이드 / 스테이지 번역.
6. 샘플의 다양한 분야의 이미지가 심각하게 때문에 방출 경로에 전송 격자의 존재를 흐리게합니다. 따라서 전송 격자 앞에 광학 경로에 작은 FWHM와 대역 통과 필터를 놓습니다. 넓은 필드 조명 조명 켜고, 데이터 수집의 카메라 비디오 모드로 이동합니다. 세포가 초점으로 데려 때까지 카메라 화면의 세포의 이미지를 보는 동안 천천히 광학 축 방향으로 변환 단계를 번역
7. X 또는 Y 방향 레이저 빔 초점의 위치에 하나의 세포를 가지고하기 위해 어느 무대 번역.
8. 넓은 필드 조명 소스를 끄십시오. 방출 경로에서 대역 통과 필터를 제거합니다.
9. 동시에 CCD 배열에서받은 신호를 보는 동안, 짧은 시간 (<1 초)에 대한 레이저 광선을 차단을 해제하십시오. 형광 신호를 레이저 광선은 세포에 따라 사고하는 시간 동안 CCD 배열에 감지되면이 세포의 전체 형광 데이터 수집 스캔을 수행합니다. 이것은 CA에서 결정 같은 검색 매개 변수 라인과 Y의 증가의 구체적 숫자를 사용하는 중요libration 절차는 이전에 보여주었다.
10. 기증자 태그와 수용체 태그 모두에 부착된 단백질을 표현하는 세포의 수많은 세포 위치와 형광 데이터 수집 프로세스를 반복합니다.
11. 두 수용체와 태그 단백질을 표현하는 세포의 형광 이미지를 축적 후, 수용체 형광 프로브와 태그만을 단백질을 표현 기증자 형광 프로브 및 세포와 태그만을 단백질을 표현하는 두 세포에 대한 전체 프로세스를 반복합니다.
12. 제 3에 설명된 절차를 사용하여, 데이터의 각 집합에 대한 spectrally 해결 XY 형광 강도 공간지도를 얻기 위해 모든 스캔을 재구성.

5. 이미지 분석

XY 형광 강도 공간적지도, fluorescing 생물 세포의 단일 검사에서 결과의 각 픽셀은 특정 픽셀에 해당하는 여기 voxel에 거주하는 분자 단지의 전체 스펙트럼 프로파일을 포함하고 있습니다. 관심의 단백질이 서로 상호 작용하는 경우,이 스펙트럼 프로파일은 기증자와 수용체 형광 프로브를 모두에서 신호의 혼합물을 포함합니다. 관심의 단백질 사이의 상호 작용의 성격을 결정하기 위해, 세포에서 이러한 단백질 단지 다수의 스펙트럼 프로파일은 샘플링해야하며 명백한는 (E _{응용 프로그램)의} 효율성을 걱정, 흥분 상태의 비율로 정의 각 픽셀의 걱정을 통해 수용체 형광 프로브로 전송되기 기증자 형광 프로브의 계산해야합니다.

1. 오직 기증자 형광 프로브와 태그 단백질을 표현하는 세포에 대한 섹션 4에 설명되어있는 복원된 이미지의 각 배경 - 수정 형광 강도를 결정하고 최대값을 정상화. 이러한 복원 이미지를 각 표준 형광 강도 값의 컬렉션은 기증자 프로브의 측정 방출 스펙트럼에 해당하는 별도의 파장 (λ _J)에 해당하기 때문에, 나는 (λ _J) ^D.
2. 수용체 프로브의 측정 방출 스펙트럼을 얻기 위해서만 수용체 형광 태그 태그 단백질을 표현하는 세포에 대해 1 단계를 반복, 내가 ^A (λ _J). 수용체 프로브는 그것이 거의 직접적으로 레이저 소스를 사용하여 흥분하지 그러한 선택 있기 때문에 수용체에만 샘플에서 냄새가 나는데 그 신호가 세포 고유의 autofluorescence 신호 크기의 순서에 가능성이 낮은 것입니다. 따라서, 이러한 방식으로 계산된 측정 수용체​​ 형광 스펙트럼은 진행하기 전에 autofluorescence의 기여를 제거하는 수정해야 할 수 있습니다.
3. 1 단계와 2 단계에서 얻은 표준 스펙트럼을 사용하여, spectrally 관계 I (λ _J) = K ^검사를 사용하여 수용체 형광 프로브 태그 기증자 형광 프로브 및 단백질에 태그가 모두 단백질을 표현 세포의 형광 방출 스펙트럼의 각 픽셀을 분해 난 ^D (λ _J) + K ^AD I (λ _J) 전 (λ _J) 형광 스펙트럼을 측정 각각의 특정 픽셀을 나타냅니다. K ^검사 및 K ^AD의 값은 acceptors의 존재와 각각 기증자 ^5의 면전에서 acceptors에서 기증자의 형광 방출에 비례합니다.
4. 수식을 사용하여 각 화소에있는 세포에 단백질의 상호 작용을지도 명백한 걱정 효율을 계산 . 여기, Q ^D와 Q는 기증자 형광 프로브 및 수용체 형광 프로브의 양자 수율은 각각 있으며, w ^D 및 W는 ^{각각 19, 20} 표준 기증자와 수용체 방출 스펙트럼의 integrals 수 있습니다.
5. 마지막으로, 특정 E _{애플 리케이션의} 가치가 발생하는 횟수가 E _{애플 리케이션의} 특정 값을 역모를 꾸몄다는 각 픽셀에 대해 E _애플 리케이션의 계산된 값을 사용하여 히스토그램을 만듭니다.

6. 히스토그램 분석

E _{응용 프로그램} histograms에서 정량적 정보를 추출하기 위해 각각의 히스토그램은 이론적으로 다음과 같은 공식에 따르면, 가우스 함수의 합계로 적합합니다 :
,
_제가 진폭 어디, _{내가 할} 표준 편차를 σ, 그리고 E의 _0i은 가장 가능성이 I ^ith 가우스 함수의 효율성을 무서워. 다른 올리고머 크기S 및 구성들을 ^{한 17} 사이의 전자 _0i과 다른 상관 관계의 서로 다른 숫자 (N)로 이어집니다. 예를 들어, 마름모 모양의 tetramer를위한 다섯 봉우리는 표 1에 나와있는 표현에 의해 주어진, 예측하고 있습니다.

다섯 가우스 피크 중심 값의 각과 pairwise 사이의 표 1. 관계는 마름모 모양의 tetramer에 대한 예측 효율성을 무서워.

E _P에 해당하는 한 - - 나머지 네 가지는 E _P의 가치부터 계산하는 동안 그것은 하나 E _0i 값이 피팅 데이터의 과정에 익숙해 져야 할 것을 의미합니다.

1. 올리고머 모델을 가정하고 전자 _{애플 리케이션} histograms ¹ 피팅에 사용되는 Gaussians의 수를 식별합니다. E _{P, i를} 조정하여 히스토그램에 맞게, 그리고 _i를 σ. histograms의 상대 처분이 모델에 의해 고정됩니다. 적합의 치 광장 또는 다른 장점 - 오브 - 적합한 기능을 최소화합니다.
2. 또 다른 가능성이 올리고머 모델과 단계를 반복 번호 1을 가정합니다.
3. 최고 사용하는 매개 변수의 개수에 대한 데이터에 맞게 모델을 선택합니다. 그것은 통계 시험 (예 : 자유도의 수 당 치 광장 등)를 사용해야 할 수도 있습니다.

대표 결과

그림 1에 설명된 무균이 α - 계수 (Ste2p) ^{21, 22을} 표현하는 효모 세포에서 수행 spectrally 해결 두 광자 현미경 측정에서 계산된 결과 K ^검사, K ^광고 및 E _{애플 리케이션} 공간지도를하고 있습니다.

그림 1. 멸균이 α - 요소 수용체를 표현하는 효모 세포는. 기증자 (K ^DA)와 수용체 (K ^AD) 신호의 2 차원지도는 spectrally 해결 두 광자를 사용하여 촬영한 이미지의 각 픽셀 위치에 적용된 스펙트럼 deconvolution 절차에서 얻은되었습니다 멸균이 α - 요소 수용체 (Ste2p)를 표현하는 효모 세포의 현미경. 형광 강도는 자신의 가치와 규모가 삽입된 페이지로 표시됩니다에 따라 잘못된 색상을 할당됩니다. 명백한 안달 효율성의 2 차원지도는 K ^검사 및 K ^광고 이미지를 사용하여 계산되었다.

히스토그램 플롯은 그림 1에 표시된 세포의 전자 _{애플 리케이션지도에서} 추출한 값을 사용 준비가되었습니다. 그림 1 그림 세포의 측정 E _애플 리케이션 _값 (원)에 해당하는 장착되어 히스토그램 플롯은 그림 2에서 그림. 붉은 실선은 개별 가우스 함수 (녹색 고체 라인)의 합계를 사용하여 측정 데이터에 가장 적합한을 나타냅니다.

그림 2. 무균이 α - 요소 수용체를 표현하는 효모 세포에 대한 전자 _{응용 프로그램} 값의 히스토그램 플롯은. 그림 1 그림 세포에 대한 전자 _애플 리케이션의 측정 값 (원)에 해당하는 히스토그램 플롯이 표시됩니다. 개인 가우스 함수 (고체 녹색 라인) (고체 빨간색 선) 측정된 값을 시뮬레이션 표현하고 있습니다. 가우스 함수 매개 변수는 다음과 같습니다 E ₀₁ = 16.7; ₁ = 118.9; ₁ = 3.2 σ, E ₀₂ = 25.1; ₂ = 100.0; σ ₂ = 4.6; E ₀₃ = 32.6; ₃ = 202.6; σ ₃ = 4.6; E ₀₄ = 40.1; ₄ = 92.6, ₄ = 3.7 σ, E ₀₅ = 50.1; ₅ = 16.0도, ₅ = 7.9을 σ.

가우스 사이의 관계는 표 1에서 주어진 그림 2의 히스토그램에 표시되는 데이터에 맞게 필요한 것을 의미합니다. 가우스 함수 사이의 번호와 상관 관계는 마름모 모양의 tetramer의 올리고머의 단지에 대한 기대 E _애플 리케이션 _값 사이의 숫자와 상관 관계에 해당합니다. 따라서, 그것은 Ste2p 올리고머 복합은 생체내 ¹⁹ 마름모 모양의 tetramer의 형태를 가정 spectrally 해결 두 광자 측정에서 분명합니다.

토론

이 프레 젠 테이션에서, 우리는 생체내에 단백질 올리고머 복합에 대한 크기와 구조 정보를 확인하는 방법을 설명 하였다. 표시 데이터가 효모 세포에 표현 특정 막 수용체 (예 : Ste2p)에서 얻은 반면, 방법은 그것이 세포의 종류,하는 유일한 규정에 표현 단백질의 어떤 유형에 적용할 수있는 모든 포괄되는 단백질 적절한 형광 마커가 추가됩니다. 이 프로토콜에 향후 수정 시간 의존 단백질 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptone	Fisher Scientific	BP1420
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422
Polyethlyene Glycol 4000	Hampton Research	HR2-605
Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids	Fisher Scientific	DF0335-15-9
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma-Aldrich	Y2001
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Agar	Fisher Scientific	S70210
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500
Potassium Chloride	Acros Organics	424090010
Leucine	Fisher Scientific	BP385
Histidine	Fisher Scientific	BP382
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43	Nikon Instruments
Spectrally resolved two photon microscope