흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

요약

프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.

초록

대부분의 미생물 세포는 무료 생활 미생물에 비해 생리와 병리 학적 특성을 변경하지 biofilms로 정의 고착의 미생물 커뮤니티를 형성하는 능력이 있습니다. 자연 Biofilms 종종 제대로 정의된 조건 ¹ 아래 조사하고 거주하기가 어렵습니다. 투명 하층을 사용하면 그것은 장치에 간단한 biofilms가 실시간으로 비파괴 방식으로 검사 수있는 시스템이 가능합니다 : 여기 우리는 미생물 biofilms의 체외 3D 연구에 대해, 플로우 셀 모델 시스템의 조립 및 작동을 보여주 잘 정의된 조건 하에서 높은 재현성 ^2,3 생성.

시스템은 biofilm에 대한 성장 챔버 역할 흐름 세포로 구성되어 있습니다. 흐름 세포는 연동 펌프를 통해 매체를 플라스크에서 영양분과 산소와 함께 제공하고 소비 매체는 폐기물 용기에 수집됩니다. 흐름 시스템의 건설 흐름 챔버에서 자란 세포의 최소한의 방해와 예, 항생제의 영양분과 행정의 지속적인 공급이 가능합니다. 또한, 흐름 세포 내에서 유동 조건 전단 응력에 노출 biofilm의 연구를 수 있습니다. 풍선 달리 흐름 세포의 biofilm 구조를 방해 할 수있는 튜브에서 장치 경계 공기 방울을 트래핑.

흐름 전지 시스템은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)와 호환되며 따라서 미생물 biofilms을 개발하는 방법에 대해 매우 상세한 3 차원 정보를 제공할 수 있습니다. biofilm의 세포는 형광 프로브 또는 CLSM 분석과 호환 단백질이 표시하실 수 있습니다. 이것은 온라인 시각화를 가능하게하고 개발 biofilm의 틈새 시장의 조사를 허용합니다. 미생물 상호 관계, 항균 대리인 또는 특정 유전자의 표현의 조사는 흐름 전지 시스템의 조사 수있는 많은 실험 설정을합니다.

프로토콜

1. 모든 구성 요소와 흐름 전지 시스템의 조립

조립 플로우 시스템이 포함됩니다 : autoclavable 튜브, 버블 트랩, 중간 / 폐기물 용기 및 그림 1에 표시된 흐름 세포를. 이러한 모든 부분이 실험 사이에 활용할 수 있습니다.

그림 1. 플로우 전지 시스템 설치 (설치의 필수 구성 요소). 중간 병, 연동 펌프, 버블 트랩, 흐름 전지, 폐기물 용기, 각종 커넥터의 상호 튜브의 다양한 섹션 : 흐름 전지 시스템은 여러 구성 요소로 구성되어 있습니다. 그림은 친절 런 Lyngklip에 의해 제공됩니다.

2. 흐름 전지의 조립

1. 흐름 세포 (그림 2A)은 주사기 (그림 3)를 사용하여 실리콘 접착제의 얇은 차선과 함께 처리됩니다.
2. 실리콘 라인 (그림 3)의 위에 커버 전표를 놓습니다. 유리 커버 풀렸는데은 P.위한 하층으로 사용됩니다 녹농균이라는 박테리아 PVC 커버 풀렸는데이 S. 신청하는 동안 cerevisiae의 biofilm.

그림 2. 플로우 셀 및 거품 트랩 ² 도식 그림. A) 흐름 세포 B) 버블 트랩, DTU 시스템 생물학의 생산에 사용되는 치수에 대한 상세한 설명입니다. 존 와일리 & 아들 주식 회사 (DTU 시스템 생물은 이전과 같이 그림에 묘사된, Biocentrum 자격이되었다)의 허가 Reprinted

그림 3. 유리 하층의 첨부 파일에 대한 실리콘 접착제 응용 프로그램 라인의 일러스트. 표시된 커버 유리의 흐름 세포에 부착하는 실리콘 접착제 위에 배치됩니다.

3. 흐름 세포 뒤집어 아래 커버 슬립 면을 평평한 표면에 놓으십시오. 흐름 세포의 기본에 커버 슬립을 밀어 흐름 세포의 뒷면에 가볍게 누릅니다. 흐름 세포 뒤집어 및 실리콘에 의해 봉인되지 않은 영역에 대한 검사. 주사기의 손잡이 (피스톤) 부분은 부드럽게 함께 유리와 흐름 세포를 눌러 도구로 사용할 수 있습니다.

3. 중간 병

1. 중간 병 속에 들어있는 먹이의 실리콘 튜브 (2mm 내경)을 놓고 다른 끝에 스트레이트 커넥터를 삽입합니다.
2. (중간 내용에 대해 "미디어"단락을 참조) 병에 미디어를 추가
   금속 호일과 커넥터와 병 커버하고 매체를 압력솥. autoclaving 때 공급 튜브의 끝 부분이 중간 병 또는 사이펀 효과의 액체 수준 이상의 고정되어 있는지 확인이 매체 병을 비어 있습니다.

4. 버블 트랩, 플로우 셀 및 펌프 연결

그림 1의 개요에 따라 모든 튜빙을 조립. Marprene 튜브가 적용되는 연동 펌프를 통해가는 부분을 제외하고 실리콘 튜브를 사용하십시오.

1. 모든 개별적인 흐름 방으로 매체 병에서 튜브를 연결하기 위해서는, 실험에 적용 인레츠의 필요한 번호로 튜브를 분할. (그림 1, T - 커넥터를 참조) 펌프의 Marprene 튜브로 공급 튜브의 연결 튜브의 바람직한 숫자를 만들기 위해 T - 커넥터를 사용하십시오. 그것은 일반적으로 시스템의 결함의 경우에는 구성 요소의 식별을 촉진하기 위하여, 시스템 전반에 걸쳐 튜브 및 흐름 세포와 같은 순서 순서를 유지하는 것이 좋습니다.
2. 스트레이트 커넥터를 사용하여 펌프의 튜브를 Marprene 각 개별 먹이 튜브 (직경 2mm)을 연결합니다. 중간 실리콘 튜브 (직경 1 ㎜)를 통해 버블 트랩에 Marprene 튜브 (그림 2B)을 연결합니다. 펌프가 거품 트랩의 가장 높은 부분의 입구에 연결되어 있는지 확인합니다.
3. 흐름 세포 입구 (직경 1 ㎜)로 버블 트랩의 결과 콘센트에 튜브를 연결이 tubings의 길이가 흐름 세포가 공촛점 현미경 (일반적으로 1m)의 단계로 이동하실 수 있는지 확인하십시오.
4. 버블 트랩 위에 플레이스 5 ML의 주사기합니다. 적합한 모자와 함께 정상을 닫습니다.
5. 흐름 세포 콘센트에 짧은 약 40mm의 조각 (직경 1 ㎜), 튜브를 연결하고 필요한 길이 (직경 2mm) 폐기물 튜브를 연결하는 직선 커넥터를 "감소"를 사용합니다. 쓰레기 용기에 쓰레기 튜브를 놓습니다.
6. 중요한 것은, 폐기물 컨테이너는 항상 절대 흐름 세포 수준 아래의 흐름 세포와 같은 수준에 배치해야합니다. 또한, 폐기물 튜브의 끝 부분은 흐름 세포를 다룰 때 플러시 - 다시 사이펀 효과로 인해을 피하기 위해 폐기물 액체의 기대 수준 이상의 고정되었는지 확인합니다.

5. 흐름 시스템을 살균 세탁

1. 버블 트랩 뚜껑을 제거하고 그들이 불임 유지하는 70 % 에탄올에서 그들을 놓으십시오.
2. 0.5 % (V / V) 물에 나트륨 차아 염소 산염을 사용하여 시스템을 채우기 위해 최고의 펌프 속도로 실행합니다.
3. 다시 버블 트랩이 완전히 채워진 경우에 버블 트랩 모자를 놓습니다.
4. 흐름 챔버에서 거품을 제거하는 흐름 세포를 누릅니다. 연약한 커버 유리를 손상하지 않도록 조심 해요.
5. 시스템 3 ML / H / 채널 (0.2 mm / s의 선형 유량)의 유량에 3-4 H에 대한 소독 수 있습니다.
6. 시스템 모든 차아 염소 산염을 씻어 2-3 번 씻으십시오. 멸균 물 시스템을 작성하고 빈. 버블 트랩은 각 씻어 사이에 완전히납니다해야합니다. 이것은 거품 트랩납니다 때까지 공기 펌핑하여이 작업을 수행할 수 있습니다. 비우는 후, 시스템을 충진하기 전에 버블 트랩에서 뚜껑을 제거합니다. 버블 트랩이 완전히 액체로 가득 후에 마개를 교체하십시오. 필요한 경우 반복합니다.
7. 박 이상 낮은 유량 (1-3 ML / H / 채널)에서 시스템을 통해 멸균 물을 실행하거나 다음 단계로 진행합니다.
8. 입구에 매체 병을 연결하고 실험이 수행됩니다 온도 낮은 유속 (3 ML / H / 채널)에서 하룻밤을 통해 매체를 사용하여 시스템을 플러시. 참고 : 시스템이 매체를 가득 전에 버블 트랩이 물을납니다해야합니다.

6. 흐름 세포의 접종

1. 하룻밤 문화에서 원하는 광학 밀도로 희석을 (P.의 녹농균이라는 박테리아 예 : 0.001 OD _600nm와 S. cerevisiae에 대한의 0.1 OD _{600nm)을합니다.}
2. 챔버을 채우기 위해 충분한 inoculum를 로드할 수 27G 바늘로 0.5 ML의 주사기를 사용합니다. 250 μL (그림 2., X 4mm X 1mm 40mm)이 작업에 지정된 크기를 갖는 유량 실 충분합니다.
3. 연동 펌프를 중지합니다.
4. 시스템에 흐름을 다시 막기 위해 흐름 세포 이어지는 실리콘 튜브를 고정.
5. 70 % 에탄올로 닦아하여 실리콘 튜브에 접종 사이트를 소독.
6. 실리콘 튜브에 바늘을 삽입하여 흐름 세포의 입구에 팁을 소개합니다. 천천히 (기포를 주입하지 않도록주의) 챔버에 inoculum를 주입.
7. 바늘을 제거하고 주사 사이트를 통해 실리콘 접착제를 사용하여 구멍의 즉각적인 씰링 다음 70 % 에탄올로 주입 사이트를 닦으십시오.
8. 흐름 전지를 통해 전원을 켜고 흐름 전지를 통해 흐름을하지 않고 1 시간 동안 미생물은 하층을 준수하자.
9. , 흐름 전지 돌려 매체 펌프 (3 ML / H / 채널)를 시작하고 실리콘 튜브에서 클램프 가져가라.
10. 이 시스템은 37, 부화를 위해 배치됩니다 ° C를 P.의 경우 녹농균이라는 박테리아 30 ° C S.의 경우 cerevisiae.
11. 흐름 실에서 Biofilm 지금 CLSM에 의해 시각하실 수 있습니다.

7. 현미경에 대한 BIOFILM의 염색법

1. 적절한 얼룩의 희석 (예 : 1:1000 Syto 9 S. cerevisiae의 얼룩에 대한 라이브) 확인
2. 연동 펌프를 중지합니다.
3. 흐름 세포 이어지는 실리콘 튜브의 클램프.
4. 70 % 에탄올로 닦아하여 실리콘 튜브에 접종 사이트를 소독.
5. 챔버를 채울 정도로 얼룩 솔루션을 로드할 수 27G 바늘로 0.5 ML의 주사기를 사용합니다. 250 μL는 여기에 사용되는 유량 실 충분합니다.
6. 실리콘 튜브에 바늘을 삽입하여 흐름 세포의 입구에 팁을 소개합니다. 천천히 챔버에 얼룩 솔루션을 (거품을 주입하지 않도록주의) 주입.
7. 바늘을 제거하고 사출 사이트의 즉각적인 씰링 다음 70 % 에탄올로 주입 사이트를 닦으십시오.
8. 15 분 유동하지 않고 흐름 전지를 남겨주세요.
9. 클램프를 벗어 (3 ML / H / 채널)의 흐름을 시작합니다
10. CLSM 데이터를 수집

토론

우리는 biofilm 조사에서 강력한 도구를 나타내는 플로우 전지 시스템를 증명하고있다. 공촛점 현미경의 3D 이미지와 결합 시스템은보다 전통적인 현미경 기술에 의해 미생물 biofilms를 분석의 다른 방법에 비해 장점 범위 있습니다. 이 시스템은 지역 사회의 방해없이 미생물 biofilm 커뮤니티를 생활의 3D 시각화 수 있습니다. 가벼운 현미경은 biofilm의 틈새에 대한 자세한 정보를 제공하지 않습니다과 전자 현미경의 biofilm의 nanoscale 해상도를 제공하는 동안, 그것은 라이브 셀 이미징을 허용하지 않습니다.

우리가 이전에 여러 항생제 ^5-8 (그림 4A)에 민감한 박테리아 세포, 세포 성분의 분포의 공간적 분포를 elucidated있는 설명 유동 채널 시스템을 사용하여, 예를 들어 DNA ^9-11와의 운동성이있는가 아닌 운동성이있는 세포의 분포 박테리아 커뮤니티 ^4,6,9 (그림 4C)에서 동일한 종. 우리는 흐름 전지 시스템은 효모 biofilms의 측면을 연구하는 데 사용할 수있는 것을 다할. 이것은 fungicides뿐만 아니라 효모 biofilm 개발에 관여 유전자의 식별과 같은 환경 요인에 대한 응답으로 효모 biofilm의 spatio 시간적 분포 수 있습니다. 효모는 운동성이있는과 비 운동성이있는 세포로 구별하는 것으로 알려져 아니지만, biofilm의 다변화의 다른 측면은 효모에서 pseudohyphal 세포에 대한 형태학의 변화와 haploid에서 diploid 세포로의 전환으로 공부를 할 수 있습니다.

우리는 여러 미생물 종의 준수와 여러 얼룩 기술과 함께 사용할 수있는 시스템을 보여주었다. 같은 GFP 등 다양한 얼룩 프로브 및 형광 단백질의 다양한, 개발 biofilm의 특정 틈새 조사를 활성화하고 항균 대리인 또는 기타 환경 요인의 효과를 분석 효율적인 도구입니다. 얻은 수있는 정보는 매우 상세한있다 (그림 4)와 biofilm의 기능은 같은 COMSTAT ^12,13와 같은 컴퓨터 프로그램과 계량 수 있습니다.

전체 프로토콜의 가장 중요한 측면은 그것이 시간이 많이 걸리는 과정이라는 사실이다. 또한 세포가 아닌 형광등, 투명 표면에 성장 수 있어야한다는 제한 사항입니다. . 시스템이 경험 연구원으로 높은 처리량 검사에 적합하지 않습니다 : 형성된 biofilm이 공촛점 현미경, 몇 백 micrometres ¹⁴ 제한됩니다 조사 수있는 깊이를 사용하여 분석하기 때문에 디자인에 고유의 추가 기술 한계가 있습니다 차례 준비하는 데 몇 일이 소요될 수 있습니다 실험마다 대부분의 약 15 개 채널에서 처리할 수 있습니다. 그러나, biofilm 연구 관련 간주되는 항생제 또는 돌연변이가 처음에는 가장 흥미로운 후보가 흐름 전지 시스템으로 전송되기 전에 이러한 크리스탈 바이올렛 얼룩 같은 다른 방법으로 검사를 대량 수 있습니다. 커버 유리 시트는 매우 얇은하고 쉽게 휴식, 그리고 시스템을 다룰 때주의한다. 또한 튜브는 실험의 실행 기간 동안 매일 검사해야한다 단지 상류 흐름 세포의 유입 튜브에 상당한 "다시 성장은"발생할 수있는. 이러한 오염 물질은 멸균 기술을 사용하여 흐름 세포의 입구 측면에서 실리콘 튜브의 여러 센티미터를 제거하여 해결하실 수 있습니다.

그림 4) 사일 오래된 PAO1 -. 죽은 얼룩 (붉은 얼룩) B)는 3 일의 3D 프레 젠 테이션을 이전 P. 대한 Colistin 및 Propidium 요오드화물과 24 시간의 치료를 GFP의 biofilm 녹농균이라는 박테리아 PAO1 (P.의 녹농균이라는 박테리아 야생 타입) - GFP biofilm ⁶ C) PAO1의 3D 사진 프레 젠 테이션 - PAO1 야생 유형 YFP (노란색) D와 CFP 필라 돌연변이 (블루)) 오일 오래된 PAO1 - GFP biofilm은 3D로 표시 그림 E) 26 H S. cerevisiae (CEN.PK 배경으로 PTR3 돌연변이) biofilm은 Syto - 9 ¹⁵ 물들다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
P.의 녹농균이라는 박테리아 매체
A10	G / L
(NH 4) 2 SO4	2.0
나 2 HPO 4 X 2 시간 2 O	6.0
KH 2 PO 4	3.0
NaCl	3.0
압력솥
일박 삼식제
MgCl 2 6H 2 O	0.20
1 ML 1 M CaCl 2	0.01
100 μL / L 추적 금속 (P. 녹농균이라는 박테리아 - biofilms를위한) 4
압력솥
1시 10분의 비율 A10 및 FB를 섞는다.
원하는 농도에 탄소 소스를 추가합니다.

S. cerevisiae의 합성 전체 (SC) 매체
	G / L
아데닌 황산염	0.02
L - 트립토판	0.02
L - 히스티딘 - HCL	0.02
L - 아르기닌 - HCL	0.04
L - 메티오닌	0.02
L - 티로신	0.05
L - 류신	0.06
L - 이소 류신	0.06
L - 라이신 - HCL	0.05
L - 페닐알라닌	0.05
L - aspartic 수 소산	0.10
L - 글루탐산	0.10
L - 발린	0.15
L - 트레오닌	0.20
L - 세린	0.40
효모 내셔널로겐 기지 W / O 아미노산과 암모니아 (Bacto)	1.6
유안	5.0
NaOH	6.0
Succinic 산성	10.0
압력솥
포도당 (별도 autoclaved)	0.20