생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

요약

과일 파리, Drosophila melanogaster의 조기 개발이 잘 이미징 방식에 적합 세포 모양의 변화의 숫자에 의해 특징입니다. 이 문서 Drosophila의 배아 라이브 공촛점 이미징에 필요한 기본적인 도구와 방법을 설명하며, cellularization라는 세포 모양의 변화에​​ 초점을 맞출 것이다.

초록

개발 Drosophila melanogaster의 배아는 공촛점 이미징 살고 매우 의무가 아르 셀 모양 변경 번호를 겪습. 파리에서 셀 모양 변경은 더 높은 유기체에있는 사람들에게 유사하며, 그들은 조직 morphogenesis 운전. 그래서, 많은 경우에 그들의 연구는 인간의 질병 (표 1) ^1-5 이해에 대한 직접적인 의미가 있습니다. 하위 세포 규모에서 이러한 세포 형태의 변화는 유전자 발현의 신호 전달, 세포 극성, cytoskeletal 개조 및 멤브레인 인신 매매에 이르기까지 활동의 제품입니다. 따라서 Drosophila의 배아들은 조직 morphogenesis 관련된으로 세포 모양의 변화를 평가할 수있는 상황뿐만 아니라를 제공뿐만 아니라 모양 세포 그 하위 세포 활동을 연구하기 위해 완전히 생리 환경을 제공합니다.

프로토콜 이미지 cellularization라는 특정 세포 모양의 변화를 위해 설계되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. Cellularization는 극적인 플라즈마 막 성장의 과정이며, 그것은 궁극적으로 세포 배반엽에 syncytial 배아를 변환합니다. mitotic주기 14 계면에서 즉, 플라즈마 막 동시에 기본 상피 세포의 시트를 생성하기 위해 ~ 6000 cortically 고정 핵의 각 주위 invaginates. 이전 제안을 카운터, cellularization는 마이 오신 - 2 수축성 ⁶ 주도 아니지만, 대신에 주로 내부 매장 ⁷ 막의 exocytosis에 의해 연료입니다. 따라서 cellularization는 cytokinesis 또는 가로 - 가느다란 관 (T - 가느다란 관) 근육의 morphogenesis로 플라즈마 막 invagination 또는 확장을 필요로 세포 모양의 변화 동안 멤브레인 인신 매매를 공부하고있는 훌륭한 시스템입니다.

이 프로토콜은 쉽게 파리 배아의 다른 세포 형태 변경의 이미지에 적용하고, 그러한 배아 컬렉션의 무대를 변경하거나, 특정 방향 (테이블에있는 배아를 탑재 "배아 접착제"를 사용하는 것과 약간의 adaptations을 필요로됩니다 1) ^8-19. 모든 경우에 흐름은 기본적으로 (그림 1)과 동일합니다. 복제 및 Drosophila transgenesis에 대한 표준 방법은 그린 형광 단백질 (GFP) 또는 그 변종에 융합, 관심의 단백질을 표현 안정적인 비행 주식을 준비하는 데,이 파리들은 배아의 재생 소스를 제공하고 있습니다. 또는 형광 단백질 / 프로브 직접 간단 마이크로 사출 기술을 통해 ^90-10 플라이 배아에 도입하고 있습니다. 그런 다음, 발달 행사 및 몇 군데으로 세포 모양의 변화에​​ 따라 태아가 수집되고 해부 현미경의 형태로 개최하고, 마지막으로 위치 및 공촛점 현미경에서 시간 저속 영상에 대한 마운트.

프로토콜

1. 엠브료 컬렉션 컵 조립

1. 가능한 한 매끄러운로 가장자리를 만들고 레이저로 100 ML 트라이 - 옥수수 비커의 바닥을 잘라. 이 절대적으로 필요한 것은 아니지만, 컵, 당신은 또한 상단에서 세 모서리를 장식하는 경우 처리하기가 쉽습니다.
2. 와이어 메쉬 (6cm X 6cm)의 정사각형을 잘라. 미리 예열 뜨거운 접시에, 내부 퓸 후드, 레이어 강력 알루미늄 호일의 조각 위에 와이어 메쉬의 광장. 단단히 뜨거운 메쉬에 컵 컷 아래쪽 가장자리에 밀어. 몇 초 동안 잠깐 만요, 지금 첨부 메쉬와 컵 리프트. 호일도 경우엔 그냥 풀어 껍질.
3. 하룻밤 잔 쿨. 미세 입자 사포와의 날카로운 가장자리에서 초과 가위로 메쉬와 모래를 제거합니다.

2. 애플 쥬스 아가르 번호판 확인

1. 6L 플라스크에 100g BD Bacto 아가르 및 3L 증류수를 결합. 느린 배기 설정 30 분 한천을 압력솥.
2. 저어 바있는 2L 플라스크에 100g의 자당, 1L 사과 주스, 그리고 6g P - Hydroxybenzoic 산성이 결합되어 있습니다. 뜨거운 접시에 감동하면서 끓는 수있는 솔루션을 열. 2 개 이상 분 동안 끓여하지 마십시오. 사과 주스의 혼합물은 냉각 후 한천로 저어 바와 함께 추가할 수있게 해줍니다. 완전히 섞는다.
3. 60x15 mm 배양 접시에 쏟아져 전에 60 ° C 물 목욕 시원하고에 결합 솔루션을 허용합니다. 또한, 연동 펌프는 한천을 분배하는 데 사용할 수 있습니다. 접시는 최소한 4 시간 동안은 상온을 하다니 수 있습니다. 4 얜 젖은 종이 수건과 저장소의 계층 ° C.와 Rubbermaid 용기에 스택

참고 :

• 가을이나 겨울에는, 그것은 한천에 물을 추가 100 ML을 추가할 필요가있을 수도 있습니다.
• 배양 접시의 브랜드는 중요하다! 만이 BD 팰컨 요리 트라이 - 옥수수 비커에 맞게. 특정 주문 정보는 아래의 자료 테이블에서 찾을 수 있습니다.

3. 배아의 컬렉션 컵에 GFP의 파리를 추가

1. 병를 설정하여 컬렉션의 필요에 따라 GFP의 주식을 확장 이전 영상 약 이주 날아. 파리 한 병 50 여성 30 남성 최소 하나의 배아 수집 컵 채우기 위해 일반적으로 충분 그 이상입니다. 최고의 부설 들어, 파리 (이후 부화 미만 오일 IE) 새로 eclosed해야합니다.
2. 대략 동등한 부품 레드 스타 활성 건조 효모와 증류수와 작은 잔을 작성하여 붙여 효모를 확인하고 효모가 해산 때까지 저어. 붙여넣기가 젖어 땅콩 버터의 대략적인 일관성해야합니다. 더 많은 효모 또는 물이 일관성을 변경 추가할 수 있습니다. 효모 붙여넣는 4에서 몇 일 동안 사용할 수 있으며, 저장해야합니다, 보상 ° C.
3. 효모 붙여넣기가 준비되면, 4 사과 주스 플레이트를 제거 ° C 저장합니다. 사과 주스 효모 붙여넣기와 접시, 그리고 그들이 22-25에 따뜻한 있도록 리크 ° C, 달걀이 누워 권장합니다.
4. 다음 반으로 다시 반으로 원형 필터 종이를 접으십시오. 8~9cm 직경을 장식하고, 쿼터 서클에서 아코디언 폴드합니다. , 동그라미를 펼쳐 그것을 반전하고, 그것이 메쉬를 접촉하기 전까지 컬렉션 컵에 넣습니다. 이 가을과 파리 호감하지 않도록 종이 컵에 안전 있는지 확인합니다. 여과지는 선택 사항이지만, 짝짓기를위한 환영 환경을 제공 않으며, 컵에 습도를 유지하고 있습니다.
5. 재고의 이름과 날짜와 한 잔 라벨. 부드럽게 컵 위에 거꾸로 병을 흔들어하고, 즉시 준비된 사과 주스 플레이트와 컵 커버하여 병 컬렉션에서 대회에 파리를 전송합니다. 고무 밴드와 컵 접시를 고정합니다. 직접 조명과 함께 지역의 컵 메쉬 사이드를 설정합니다. 파리는 어둠 속에서 잘하다하지 않습니다 그림자가 컵에 떨어지는 일은 없을 있는지 확인합니다.
6. 필요에 따라 사과 주스 플레이트를 변경합니다. 두 시간 컬렉션, 상온에서, 이미지 cellularization을 위해 잘 작동합니다.

4. 장착 챔버 준비

1. 배아의 장착 챔버를 준비하려면, 2~3cm 긴 양면 테이프의 조각을 잘라 슬라이드에 배치, 테이프 및 슬라이드의 긴 축을 정렬. 그들의 가장자리가 정렬되었는지 확인하고, 두 번째 2~3cm에게 양면 테이프 및 레이어 그 테이프의 다른 조각 위에 긴 조각을 잘라.
2. 면도날을 사용하여 슬라이드의 긴 축에 테이프와 직각의 중심에 간격이 삭감 약 3mm합니다. 채널을 만들기 위해 인하 사이의 테이프를 제거합니다. 채널에 할로 카본 27 오일의 Pipet 놓습니다. 배아가 마운트 위치를이 채널입니다.

참고 :

• 만이 ½ 인치의 스카치 양면 테이프는 배아를 수용할 수있는 권리 두께입니다.
• 할로 카본 27 오일 산소 침투성이며, 배아 탈수를 방지하면서 있도록 산소 교환이 가능합니다. 의 굴절률로 인해, 할로 카본 27 오일도 준비에 이상적입니다및 이미징 배아.

5. Dechorionate 태아

1. 수집하고 dechorionate 배아하려면, 완전 잠수함 전체 표면을 위해 사과 쥬스 한천 플레이트에 충분히 50 %의 표백제를 부어. 배아들이 chorion에서 출시하는 등 전송 빛으로 자이스 혈구 검색 V8로, 해부 현미경을 사용하여보세요. 마자 chorion가 풀리고, 몇 배아 (30~60초)에서 출시로 셀 스트레이너에 표백제 및 배아를 부어.
2. 물총 병의 증류수로 즉시 적극적으로 스트레이너의 배아를 씻으십시오. 종이 타올에 DAB 거르는. 어떤 분홍색이 dabbing 후 수건에 볼 수있다면, 물을 배아 닦고 계속합니다.
3. 깨끗한 사과 주스 플레이트 (NO 효모 붙여넣기로)에 10-50 배아를 전송하기 위해 촉촉한 페인트를 사용하십시오. 종이 타월의 찢어진 가장자리로 물을 멀리 윅하고, 즉시 할로 카본 27 오일을 소량으로 배아를 커버.

참고 :

• Clorox의 표백제를 사용하지 마십시오. 대신, <6 % 나트륨 차아 염소 산염이다 오스틴의 A - 1 상업용 표백제와 같은 브랜드를 사용합니다.
• 오버 표백 또는 rinsing 불충분이 불규칙 cellularization와 죽이 배아 발생합니다.

6. 스테이지 및 마운트 태아

1. 전송 빛의과 해부 현미경을 사용하여 번호판의 배아 단계로 Bownes ²⁰ 형태학의 지침을 따르십시오. 포셉를 사용하여 장착 챔버의 채널에, Bownes 4 단계에 해당하는, 5 mitotic주기 11 또는 12 배아를 전송합니다. 아래 지느러미 및 복부 측면의 가시 성과 측면 사이드와 라인의 배아를 마련. 태아도 쉽게 혼자 기름이 방향으로 정렬됩니다. 커버 슬립 아래 적용되면 그들은 산소 자신의 이웃을 박탈하므로 군중의 배아 함께하지 마십시오. (그들 사이 배아 길이의 절반 남겨주세요.)
2. 채널의 한쪽에 양면 테이프에 미끄럼 25x25 mm 커버 중 하나 가장자리를 놓는다. 채널을 커버하는 커버 슬립을 놓습니다. 공기가 아래에 잡힌 경우, 커버 슬립의 가장자리에 할로 카본 27 오일의 작은 금액을 적용합니다. 모세관 현상은 채널에 기름을 끌어와 공기를 밖으로 밀어 것입니다.

참고 :

• 준비 배아에 대한 또 다른 훌륭한 자원은 다음과 같습니다 캄포스 - 오르테가, JA 및 Hartenstein, V. (1985). Drosophila melanogaster의 배아 개발. 스프링거 - Verlag, 베를린. 이 책은 더 이상 게시되지 않습니다 있지만, 사용하는 사본은 Amazon.com에 정기적으로 사용할 수 있습니다.
• 아껴서 할로 카본 27 석유를 사용하십시오. 이것은 장착이 쉽게됩니다. 또한 다음과 같은 이미징 단계에있는 현미경 목표에 기름 흘러 우연히 방지할 수 있습니다.

7. 이미지 태아

1. 여기 어떻게 진행 과정이 영상되는 세포 모양의 변화, 그리고 주소되는 질문에 의해 결정됩니다. 모든 형상 변경, 중 직립하거나 거꾸로 현미경에 장착 챔버 장소 전염 빛을하여 배아를 찾아, 그리고 관심 영역에 집중할 수 공촛점 이미지로 전환합니다. 같은 니콘의 MicroscopyU (에서 논의된 것과 공촛점 현미경에 대한 모범 사례를 준수 http://www.microscopyu.com/articles/confocal ). photobleaching 및 phototoxicity을 방지하기 위해, 가능한 한 작은 레이저의 파워로 생활 배아를 노출 특히 엄격한한다.
2. cellularization 들어, 자이스 혈구 710 레이저 스캐닝 공촛점 현미경에 이미지는 C - 고차 색지움 40x/1.2 W 코어의 목표를 ​​사용합니다. 이 현미경은 18-20에서 ° C.를 이르는 온도, 온도 제어 방 안에 보관되어 있습니다 온도 제어가 절대적으로 필요하지 않다지만, 그것은 현미경에보다되며 이미지가 더 일관성 수 있습니다. 배아의 중앙 근처에 하나의 비행기로 우리는 정기적으로 이미지, 단면의 플라즈마 막 invaginations (그림 2)를 수행합니다. 단순히 invagination 역학에 따라 들어, 30~60초 간격은 시간이 오래 경과 이미징을위한 충분한 있으며, 태아는 산소 부족이라는 명백한 증거와 함께> 90 분간 영상을 견딜해야합니다.
3. 이미지를 인수 후, 그들은 ImageJ (라고 국립 보건원에서 프리웨어를 포함하여 이미지 분석 패키지의 임의의 숫자를 사용 분석할 수 http://rsbweb.nih.gov/ij을 ). 데이터는 다음 영화 (영화 1), 시퀀스 (그림 2) 또는 kymographs ^21로 제시하실 수 있습니다.

참고 :

• 물이 침수 C - 고차 색지움 40x/1.2 W 코어의 목표는 배아 근처 이미징 수성 샘플 깊은 조직 이미징에 대한 aberrations을 제한 높은 개구로 인해 중간 섹션에 적합하고, 높은 해상도와 높은 형광 신호를 제공합니다. 또한,이 목표매우 긴 작동 거리 (220 μm의)을하고 있습니다. 그러나, 다른 물 또는 글리세린 침지 목표는 관심의 세포 모양의 변화는 배아의 표면 근처에 몇 군데 있습니다 특히면, 잘 수행합니다.

8. 다른 방법 : "배아 - 접착제"로 마운트 태아

1. cellularization 이외의 이미지 셀 모양 변경하려면, 그것은 쉽게 혼자 기름에 유지되지 않는 특정 방향으로 배아를 마운트 할 수 있습니다. 이렇게하려면, 이전에 설명한 것과 다른 장착 방법을 사용합니다. 섬광의 약병에 헵탄 250 μL와 양면 테이프 20cm를 결합하여 "배아 - glue"를함으로써 시작합니다. 섬광 nutator에 유리병이나 회전 플랫폼을 장소, 하룻밤 섞는다.
2. 배아 접착제에 노란색 피펫 팁을 찍어, 그리고 접착제의 흔적을 떠나, 슬라이드 따라 팁을 추적. 헵탄가 증발하는 동안, 당신은 한천의 블록에 필요한 방향으로 배아를 개최 맞춥니다. (몇 군데로 배아 표면 한천 직면한다 기억하십시오. 예를 들어, 복부 고랑 형성하는 동안 이미지 셀 모양 변경하려면, 한천을 향한 그들의 복부 측면과 배아를 탑재합니다.)
3. 접착제로 슬라이드를 반전하고, 부드럽게 한천 블록에있는 태아에 대한 접착제의 흔적을 누르십시오. 이제 다시 슬라이드를 반전. 배아는 해당 방향에 갇혀 것입니다. 배아의 양쪽에 양면 테이프 두 레이어를 추가, 할로 카본 27 기름을 커버하고 coverslip을 적용합니다. 위에서 설명한대로 이미지와 함께 진행합니다.

9. 대표 결과 :

태아가 건강하고 이미징 최적있다면, cellularization은 50-60분을해야하고, 플라즈마 막 invaginations은 진입 약 40 미크론을해야합니다. 배아는 이상 - 표백, 산소 phototoxicity에 의해 박탈되거나 손상된 경우에는, 다음 invagination도 특히 몇 군데 지역에서 느리거나 중단됩니다. 배아 건강 악화는 종종 그러한 변경 개발, 애벌레로 부화에 실패 결과. 따라서, 영상 후 분석 배아 건강에 엄격한 테스트에, humidified 챔버에 슬라이드를 유지하고 다음날 부화 살펴보십시오.

그림 1. 배아 컬렉션에서 이미지로 워크플로우. 프로토콜의 흐름은 네 가지 주요 단계로 세분 수 있습니다. 첫 단계에서 모든 개인 용품 및 구성 요소가 준비하고 있으며, 다음 배아 수집 컵, 사과 주스 한천 플레이트와 GFP 파리는 배아 부설 환경을 만들어 함께 부착 할 것입니다. 두 번째 단계에서 사과 주스 한천 플레이트에 누워있는 계란과 배아가 수집됩니다. 세 번째 단계에서 배아가 플레이트에서 제거됩니다, 공연 및 장착 챔버로 이송. 네 번째 단계에서는, 탑재 배아는 공촛점 현미경에 몇 군데 있습니다.

그림 2. cellularization 시간 - 저속 영상의 대표 데이터입니다. 태아는 지느러미 (D)와 명확하게 보이는 복부 (V) 측면과 함께 탑재하고 있으며, 단면의 플라즈마 막 invaginations를 수행하기 위해 중간 몇 군데 있습니다. 여기에 표시된 배아는 표현 GFP - 마이 오신 - 2 플라즈마 막 invaginations의 끝을 집중 탐사 ^6. 따라서 시간이 지남에 따라이 프런트의 ingression를 추적하면 플라즈마 막이 invaginates 속도를 제공합니다. 0시 분 시점은 cellularization의 발병에 해당합니다. 곧 56:00 분 시점 이후 gastrulation은 배아의 복부 측면에 시작합니다. 바 40 미크론이다.

영화 1. cellularization 시간 - 저속 영상의 대표 영화.이 영화는 2 그림에 해당합니다. cellularization의 전체 과정을 기록하기 위해 영상은 pseudocleavage 퍼로우 회귀를 캡처, 이전 mitotic주기 13에서 시작하고, gastrulation 운동은 태아의 복부 측면에서 볼 때까지 계속되었습니다. 이미지는 한 분 간격으로 수집되었다. 농도는 쉽게 gastrulation의 움직임을 볼 수 있도록 포스트 인수를 증가했다.
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발달 행사 및 타이밍 *	관련 셀 모양 변경	질병이나 인간의 건강에 대한 링크	라이브 영상과 함께 최근 참고 문헌
의사 - 절단의 고랑 형성 (4; 90분 PF)	Cytokinesis	Polyploidy 및 암 진행 1	Mavrakis 외. 2009 8 카오 외. 2010 년 9
Cellularization (5; 130분의 PF)	Cytokinesis	Polyploidy 및 암 진행 1	카오 외., 2008 10 Sokac & Wieschaus 2008 11
복부 고랑 형성, Mesoderm의 invagination (6; 180분 PF)	혀끝의 수축, 상피 - mesenchymal 전환	암 전이 2	폭스 & Peifer, 2007 12 마틴 외. 2009 13
Germband 확장 (7; 195분의 PF)	수렴 확장	신경 튜브 결함 3	Bertet 외., 2004 14 블렝큰쉽 외., 2006 15
Tracheogenesis (11; 320분의 PF)	상피 튜브 형성 및 분기	Angiogenesis 4	Caussinus 외., 2008 16 제바 이스 & 카사노바, 2010 17
도설 폐쇄 (14; 620분 PF)	혀끝의 수축	상처 치유 5	Gorfinkiel 외. 2009 18 솔론 외. 2009 19

세포 모양 변화 표 1. 예로는 생활 플라이 배아에서 몇 군데
* Bownes 단계 번호와 시간 이후의 수정 (PF), 각 이벤트가 시작될 때, 캄포스 - 오르테가, 1985에 따라 나열되어 있습니다.

주식 플라이	레이블	원본 참조
스파이더맨 GFP (95-1)	플라즈마 막	모항 외., 2001 22
Resille - GFP (117-2)	플라즈마 막	모항 외., 2001 22
GAP43 - 비너스	플라즈마 막	Mavrakis 외. 2009 8
스파게티 스쿼시 - GFP (Sqh - GFP)	마이 오신 - 2	Royou 외., 2002 6
E - cadherin - GFP (Ecad - GFP)	셀 - 셀 분기점	오다 외., 2001 23
GFP - Moesin	F - 굴지	Kiehart 외., 2000 24
Utrophin - 비너스 (Utro - 비너스)	F - 굴지	Sokac 외., 발표되지 않은 결과

파리 배아의 이미징 세포 모양의 변화에 대한 표 2. 유용 주식

토론

프로토콜은 여기에 개발 비행의 배아에서 세포 모양의 변화 다수의 라이브, 공촛점 이미징을 허용합니다 설명했다. 이미지에 대한 GFP 주식은 개별 연구소 (표 2)에 의해 준비하지만, 많은 이러한 주식은 인디애나 대학 (블루밍턴에서 같은 Drosophila 증권 센터로 센터에서 공개적으로 사용할 수있는 수 http://flystocks.bio.indiana.edu )과 파리통 예일 대학 (앳 증권 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
Cover slips 25x25	Fisher Scientific	1 2-524C
Squirt bottles (H2O)	Fisher Scientific	02-897-11
50 ml Falcon tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Bulbs for small pipets, 1 mL	Fisher Scientific	03-448-21
Scintillation vials with caps	VWR international	66021-533
Tri-Corn Beakers, 100 mL	Electron Microscopy Sciences	60970
BD Falcon Petri dish 60x15mm	Fisher Scientific	08757 100B
BD Falcon Cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Yellow pipet tips	Rainin	L200
Stainless steel mesh, 304, 12x24	Small Parts, Inc.	CX-0150-F-01
Glass 5¾ inch Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20B
P4 Filter paper	Fisher Scientific	09-803-6F
Rubber bands	Office Max	A620645
Scotch double-sided tape, ½ inch	Office Max	A8137DM-2
Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2	Jerry’s Artarama	56460
Dumont #5 Forceps High Precision Inox	Electron Microscopy Sciences	72701-DZ
Razor blades	VWR international	55411-050
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	H 8773
Heptane	Fisher Scientific	H360-1
BD Bacto Agar	VWR international	90000-760
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
p-Hydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	H5501
Red Star Active Dry Yeast	LeSaffre	15700
Paper towels, C-fold	Kleenex
Heavy duty aluminum foil	Reynolds Wrap
Bleach	Austin’s A-1 Commercial
100% Apple juice	Ocean Spray or Tree Top