Polyimide 기반 Microelectrode를 사용하여 자유롭게 이동 마우스의 고밀도 뇌파 레코딩

요약

이 문서에서는, 우리는 수술 절차를 설명하고 마우스 모델에서 고밀도 encephalography (EEG)의 취득에 마우스 두개골에 울트라 얇은 polyimide 기반 microelectrode 배열 (PBM - 배열)의 주입을위한 도움말을 취급.

초록

뇌파가 (뇌파) 대규모 수준의 연결 인구의 평균 전기 활동을 나타냅니다. 그것은 널리인지 신경 과학의 비침 투 뇌 모니터링 도구뿐만 아니라 신경에 간질과 수면 장애에 대한 진단 도구로 활용됩니다. 그러나, 뇌파 리듬 생성의 기본 메커니즘 면사포 아래로 계속됩니다. ¹ EEG 고해상도 마우스 최근에 도입 polyimide 기반 microelectrode (PBM - 배열)은 마우스 모델은 복잡한 뇌파 생성 과정의 분석을 위해 포함된 풍부한 유전자 자원을 바탕으로 뇌파 신호에 neurophysiological 질문에 대답하기 위해 실험 중 하나입니다. 마우스 두개골에 nanofabricated PBM - 배열의이 응용 프로그램은 유전자 변형 생쥐의 대규모 두뇌 활동을 수집하기 위해 효과적인 도구이며 행동과 함께 특정 뇌파 리듬에 신경 상호를 식별하는 숙박이 가능합니다. 그러나 자사의 울트라 얇은 두께와 bifurcated 구조 PBM - 배열의 취급 및 이식에 문제의 원인이됩니다. 제출 비디오, 마우스 두개골에 PBM - 배열의 주입을위한 준비와 수술 단계를 단계별로 설명하고 있습니다. 이식의 연구자가 성공 도움을 취급하고 수술 팁도 제공됩니다.

프로토콜

1. 개요

C57BL/6J - 129S4/SvJae 하이브리드 마우스 (12 ~ 15 주를 넘어서는 안 됨)는 마취제 (120 MG / kg IP) 및 xylazine (6 MG / kg, IP) 칵테일과 함께 anesthetized 있습니다. 타일​​이나 발가락이 곤란는 마취의 깊이를 검사하기 위해 수술을 앞에. 마우스는 stereotaxic 장치 (데이비드 Kopf 계측기, 모델 902, 칼리프, 미국)에 의해 고정됩니다. 두피가 통증 감소에 대한 lidocaine 치료에서 두개골을 노출 25mm 관한 정중선에 베인 수 있습니다. 두개골에있는 모든 잔해는 두개골에 전극의 이행을 향상시키기 위해 호수 - 절어 목화 팁에 의해에서 소멸됩니다. bregma와 람다 지점 표시와 같은 수평면에서 설정합니다. polyimide microelectrode 기반의 배열은 (PBM - 배열)은 수직으로 정중선은 두개골의 정중선에 부합되도록 배치됩니다. bregma 지점이 PBM - 배열의 앞쪽에의 5 ^{일 층의} 중간에 위치해야합니다. 두 개 또는 세 microscrews는 치과 시멘트와 전극의 위치를​​ 보호하기 위해 두개골의 가장자리에있는 NULL 공간에서 사용됩니다. PBM - 배열 커넥터를 propping을 위해, 우리는 머리의 중앙에 걸어 위치, 치과 시멘트로 커버. 치료 후, 베인 피부 봉합하고, 적어도 오일은 복구를 위해 제공됩니다. 복구 동안 생쥐는 음식과 물을 무료로 접근할 수있는 개인의 새장 안에 보관되어있다. 복구 후, 뇌파 기록이 수행됩니다. 동물의 치료, 수술 및 기록 절차는 한국 실험 동물 관리 규정 및 관련 지침 법 1992에 따라 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 대한 지침에 따라되었습니다. 최 의해 설명된대로이 원고의 PBM - 배열을 조작했다. 동부 표준시. 알. ¹ 비디오 PBM - 배열 같은를 사용하는 개발자에게 문의하시기 바랍니다.

2. 절차

1. 살균 수술 악기와 stereotaxic 장치를 준비합니다.
2. 마취 (120 60의 복용과 함께 예를 들어, 마취제 / xylazine MG / kg IP, repectively)와 마우스를 마취. 타일​​이나 발가락이 곤란는 마취의 깊이를 검사하기 위해 수술을 앞에.
3. 마우스의 귀 운하에 귀 막대를 배치하고 위치에 그것을 강화하여 stereotaxic 장치에 마우스를 탑재합니다. 눈은 수술 조명에 의해 건조에서 눈을 유지하기 biocompatible 젤리 (예, 석유 젤리)으로 덮여 수 있습니다. 70 % 에탄올로 마우스의 머리를 보습 후, 머리를 잘라 털이 면도.
4. 두피와 25mm에 대해 머리를 절개. 지금은 2 %의 작은 금액을 적용하는 추천 것은 두피 아래에 하이드로 클로라이드를 lidocaine. 절개 크게 뜨고 마이크로 클램프와 피부 (파인 과학 도구 (미국), 주식 회사, 18052-03, 칼리프, 미국) 핀치.
5. 생리 - 젖었 면화 면봉은 두개골에 PBM - 배열의 이행을 강화와 함께 두개골에 남아있는 조직 파편을 닦아주십시오. 멤브레인의 잔류물을 제거하는 과산화수소를 사용하면 효과적입니다.
6. 두개골에 bregma 및 람다 포인트를 찾아, 그리고 석유 기반의 마커 펜으로 그들을 표시합니다. 의 수직 정중선은 그림 1에 표시된 두개골의 정중선에 부합되도록 PBM - 배열을 놓으십시오. 수돗물 중 하나를 드롭과 PBM - 배열의 앞쪽에의 5 ^{일 층의} 중간에있는 bregma를 놓습니다. 측면에 중간 신중하게 잘 준수를위한에서 면봉 필름 전극. 두개골에 필름 전극 스틱 어깨를 도와주기 위해, 영화 전극이 두개골에서 완전히 건조되어야합니다. 필름 전극은 반 데르 Waals의 힘에 의해 두개골에 고정으로 남아 있습니다. 전극을 다시 위치하면 수돗물의 또 다른 드롭 찢어진되는 전극을 방지하기 위해 필요합니다.
   
   그림 1. (왼쪽) 마우스 두개골에 PBM - 배열입니다. PBM - 배열의 anterio - 후부 축 bregma (BP)과 람다 포인트 (LP) 사이의 라인을 일치합니다. 마우스 뇌 표면 (오른쪽) putative 전극 위치. 마우스의 해부학 stereotaxic 측정에 따라 표시됩니다 브룩 헤 이븐 국립 연구소와 전극 위치에서 생산 성인 C57BL/6J 마우스 뇌의 3 차원 MRI 디지털 아틀라스 데이터베이스에서 세그먼트입니다. 그라운드 (G) 및 참조 (참조) 전극은 오른쪽 그림에서 표시됩니다.
7. 두개골의 빈 공간을 적어도 세 위치를 마크하고 지원 microscrews의 위치를​​위한 치과 드릴을 사용하여 그 위치에 구멍을합니다. 이러한 microscrews은 기둥의 역할을 가지고 있으며 기계 두개골에있는 치과 시멘트를 지원합니다. 추가주의 시추하는 동안 필요합니다. 마우스 두개골이 얇은 레이어로 구성되어 있기 때문에, 출혈이 시추하는 동안 쉽게 발생할 수 있습니다. 출혈이 발생하면 천공을 중단하고 구멍에 hemostatic 가루 소량을 적용합니다.
8. PBM - 배열 앵커 나사, 그리고 두개골의 나머지 부분을 커버하기 위해 치과 아크릴 시멘트 (네덜란드, 자체 경화 꼭지점 - 치과, 꼭지점)이 적용됩니다. 아교를 바른와 점성 C에서 치과 시멘트 준비ondition.
9. 강력한 접착제를 (예를 들어, Loctite, 헨켈 Loctite 사, 더블린, 아일랜드)를 사용하여 머리의 중앙에 지지대와 같은 딱딱한 막대를 놓습니다. 커넥터 비행기의 뒷면에 양면 접착 테이프를 넣어. 잘난 체의 끝에 연결하는 PBM - 배열 커넥터의 위치를​​ 조작. 두개골과 커넥터 사이의 수직 거리는 5mm 이상되어야합니다. 커넥터 비행기와 더 나은 접착을위한 강력한 접착제를 사용하여 스틱의 팁을 스틱.
10. 치과 시멘트가 완전히 치료되어 있는지 확인합니다. 다음 두개골을 통해 치과 아크릴 시멘트와 두개골에 커넥터를 확보하기 위해 커넥터 비행기의 뒷면을 적용합니다.
11. 마이크로 클램프를 제거합니다. 봉합사는 멸균 봉합 섬유로 피부를 베인. 장치에서 마우스를 제거합니다. 당신은 노출된 두개골을 방패에 추가 치과 아크릴 시멘트를 적용할 수 있습니다. 시멘트 및 봉합 피부 주위에 항생제 (fucidin 연고, 동 무 약학, 한국)을 적용합니다.
12. 원래 몸무게 (약 5~7일) 복구까지 소독을 새장에 마우스를 놓습니다. 그것은 어떤 케이지 친구를 소개하지 않는 것이 좋습니다.
13. 복구 후, 자신의 새장에 다채널 뇌파 증폭기 시스템 (Synamps ^2, 노스 캐롤라이나, 미국)의 headbox에 경량 인쇄 회로 기판 (PCB) 커넥터로 마우스를 연결합니다. 그것이 리게하지 않도록 연결하는 라인을 신중하게 다루어야하는 경우도 있습니다.
14. 요법 이니, 1 시간 후, 뇌파 기록을 수행합니다. 4.4 스캔. (노스 캐롤라이나, 미국) 인수 소프트웨어는이 실험에 사용되었다. EEG 마우스의 전형적인 시간 추적 설정은 그림 2에 표시됩니다. 이것은 마우스의 동작을 관련된 비디오를 기록하는 것이 좋습니다.
15. 획득 신호가 지형 뇌지도를 생성하는 MATLAB (MathWorks, 내틱, MA, 미국)에 의해 분석하실 수 있습니다. 마우스 뇌의 EEG 전력지도 샘플 topographies는 그림 3에 표시됩니다.

3. 대표 결과

위의 수술 절차가 올바르게 수행하는 경우, 40 채널 뇌파 마우스 레코딩이 성공적으로 나쁜 채널없이 수행됩니다. 다음 그림은 대표적인 원료 EEG 흔적 및 지형지도를 보여줍니다.

그림 2. γ - butyrolactone (GBL, 50mg/kg, IP) 주사에 의해 유발되는 뇌파가 발생 부재 발작의 샘플 추적. 레드 막대가 부재 발작하는 동안 스파이크 - 웨이브 및 배출 (SWDs)를 나타냅니다. 수평 및 수직 축 각각 시간과 전압을 나타냅니다. 숫자는 채널 몽타주가 그림에 정의된 다음과 같습니다. 1 (오른쪽).

그림 3. 지형지도는 2-6 Hz에서 전력 분포를 나타냅니다. colorbar의 가치는 권력지도의 색상 규모를 나타냅니다. 크게 γ - butyrolactone (GBL, 50mg/kg, IP), 대형 frontoparietal 피질 영역의 힘으로 유도 스파이크 - 웨이브 및 배출 (SWDs) 동안 GBL 분사 (베이스 라인)하기 전에 전원에 비해 증가.

토론

우리가 자유롭게 쥐를 이동에 고밀도 뇌파를 얻기위한 수술 및 녹화 절차를보고합니다. 이 방법은 우리가 자연 리듬 ^1,2 또는 이벤트와 관련된 뇌 활동의 분자 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 모델에서 뇌 기능지도를 얻을 수 있습니다.

PBM - 배열에있는 모든 채널의 취득은 매우 어려운 것입니다 그러나 모든 채널에 대해 보안 담당자를 만들고, 전체 뇌 매핑을 얻기 위해 필요한 조건입니다. 두개골에 채널의 일관된 접촉을 유지하려면 다음 절차가 중요하다 볼 수 있습니다. 우선, 두개골에있는 모든 조직 파편이 떨어져 두개골에서 전극을 설정할 수 있습니다. 따라서 그것은 소독 솜 면봉 모든 조직 파편을 제거하고 두개골 표면을 건조하는 것은 매우 중요합니다. 둘째, 두개골 표면에 집중 PBM - 배열의 능력은 반 데르 Waals의 힘입니다. 그것은 하나가 두개골에 PBM - 배열을 적용하기 전에 물을 계층을 구축하기 위해 두개골에 수돗물 한 방울을 적용하는 제안입니다. 셋째, 치과 시멘트의 오른쪽 점도가 매우 중요합니다. 너무 콧물있다면, 그것은 PBM - 배열에 따라 절연 층을 만들 수 있습니다. 너무 밀도 경우 치과 시멘트는 쉽게 그 자체의 무게로 인해 두개골에서 다투지 않습니다. 마지막으로, 적어도 세 지원 microscrews는 단단히 두개골에 바운드 치과 시멘트를 만들기 위해 두개골에 이식한다. 지원 microscrews은 치과 시멘트를 개최하고 장기적인 학습을 위해 필수적이며, headstage을 확보.

PBM - 배열의 응용 프로그램은 그 크기와 무게로 인해 성인 쥐 만성 공부로 제한됩니다. 경험을 바탕으로, 25g 이상의 무거운 마우스 사용이 적합합니다. 추가 응용 프로그램으로, 우리 PBM - 배열의 지점 사이의 NULL 공간을 통해 하나가 기록 또는 자극의 목적으로 보조 전극을 소개합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
γbutyrolactone	Sigma-Aldrich	H7629-500G