전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

요약

여기 게는 stomatogastric의 신경절의 뉴런에 대한 자세한 활동의​​ 신속하고 고해상도 형광 전압에 민감한 염료를 영상에 대한 방법론을 제시한다.

초록

뉴런의 전압에 민감한 염료 영상은 네트워크의 연결을 구성하는 방법에 대한 이해를위한 주요 방법이며 어떻게 참여 뉴런의 동시 활동이 네트워크의 핵심 기능의 출현에 이르게한다. 여기서 우리는 게 stomatogastric 신경절에서 확인된 패턴 생성 뉴런이 기술의 응용 프로그램의 방법론을 제시한다. 우리는 형광 전압에 민감한 염료 디 - 8 - ANEPPQ 이러한 뉴런의 로딩을 설명하고 어떻게 이미지 MiCAM02 고속 및 고해상도 CCD 카메라 이미징 시스템을 사용하여 염색로드 뉴런의 활동를 보여줍니다. 우리는 MiCAM02 이미징 시스템과 관련된 BVAna 이미징 소프트웨어를 사용하여 기록된 이미지 데이터의 분석을 보여줍니다. 게 stomatogastric 신경절에서 여러 뉴런의 세부 활동의 동시 전압에 민감한 염료 영상은 전통적인 전기 생리학 기법 (세포내 및 세포외 레코딩)하는 방법 중앙 패턴 발생기 신경 네트워크 작업에 대한 이해를 위해 급격하게 새로운 기회를 열어 함께 적용.

프로토콜

1. 크랩 Stomatogastric 신경계의 준비

성인 암 pagurus L.는 (- 12 ° C 10) 로컬 소스 (뉴캐슬 대학 해양 연구소를 도브)에서 얻은 및 필터링, aerated 바닷물에 보관했다. 절개 전에 40 분 - 동물 20 얼음에서 그들을 포장하여 anesthetized되었습니다. 우리는 고립 stomatogastric 신경 시스템 (STNS ^1)를 사용합니다. 냉장 호수 (10-13 ° C)와 함께 - STNS은 (12 ML / 분 7) 실리콘 엘라스토머 늘어선 (ELASTOSIL RT - 601 바커, 뮌헨, 독일) 페트리 접시에 넘어뜨린 지속 superfused되었습니다. , MgCl _2, 26, CaCl _2, 13, KCl, 11, trisma 기지, 10, maleic 산성, 5 NaCl, 440 : 생리 식염수는 (mMol * L - 1)로 구성되어. 13 ° C와 산도 7.4에서 - - 7.6 살린은 11 일정한 온도에서 보관되었다.

stomatoastric 신경절 (STG)의 desheathing 포함한 STNS의 해부와 준비의 세부 단계는, Guttierez 및 Grashow ¹ 조브 문서에 제공됩니다. 모든 실험은 24 ^일 1986년 11월 (86/609/EEC)의 유럽 사회 이사회에 따라 진행되었다. 그림 1A는 STNS 및 그림 1B의 구조 다이어그램의 뉴런은 신경의 후부 부분에서 평면 반원으로 배열하는 데 일반적인 desheathed STG를 보여줍니다 보여줍니다.

모델링 점토로, STNS있는 페트리 접시는 이미징 현미경의 운영 플랫폼 (올림푸스, 일본 도쿄 BW51 WI)에 고정됩니다. 모두가 현미경 단계와 현미경은 광학 녹음하는 동안 운동 유물을 방지하기 위해 (Scientifica, 어크필드, 영국)의 진동 절연 테이블에 장착됩니다. stomatogastric 신경절 (STG)에서 생성된 모터 패턴은 세포 음반 ^2-4을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 이것은 다음 단계로 이루어집니다 :

1. 석유 젤리 기반 원통형 구획은 전기 욕조 (페트리 접시는 이미징 현미경의 운영 플랫폼에 배치되기 전에 이것은 해부 무대에서 수행에서 신경을 분리하는 기본 모터 신경 (lvn)의 섹션 주위에 내장되어 있습니다 ).
2. 이 스테인레스 스틸 와이어 전극 중 하나가 다른 하나는 기준 전극으로 목욕에,이 구획에 있습니다.
3. 차동 신호는 기록 여과 및 교류 차동 증폭기 (Univ. 카이저슬라우테른, 독일)와 증폭됩니다.
4. 신경절의 모터 활동은 오실로 스코프를 (DL708E, 요코, 도쿄, 일본)를 사용하여 모니터링하고 추가로 데이터 수집 보드 (CED 전원, 1401, 캠브리지 전자 디자인, 캠브리지, 영국)와 스파이크 2 v6.10를 사용하여 기록됩니다 소프트웨어 (캠브리지 전자 디자인, 캠브리지, 영국). 파일 스파이크 2 v6.10 (캠브리지 전자 디자인, 캠브리지, 영국)을 사용하여 분석하고 있습니다.

2. 다이 솔루션의 준비

우리는 긍정적인 전류 펄스를 사용하여 microelectrodes을 통해 염료의 로딩을 용이 이중 긍정적인 요금을 가지고있는 형광 전압에 민감한 염료 디 - 8 - ANEPPQ (Bioscience 캠브리지) ^5를 사용. 염료 솔루션은 가능한 한 많은 빛으로부터 보호되어야합니다. 염료 솔루션은 다음과 같은 준비가되어 있습니다 :

1. 염료 5 MG는 DMSO (Invitrogen) 용액에 F - 127 Pluronic의 산 1 ML과 혼합됩니다.
2. 녹아 염료를 포함하는 플라스틱 약병은 회전 / 시그마 Microcentrifuge 1-14의 분 (시그마, Osterode, 독일) microelectrode을 방해할 수 있습니다 큰 염료 입자를 분리하기 위해 12,000에서 20 분 centrifuged입니다.
3. 염색 용액의 표면에 뜨는 (톱 200 μL)이 pipettor를 사용하여 구분하고 별도의 플라스틱 약병에 저장됩니다. 두 튜브는 빛에 노출을 방지하기 위해 알루미늄 호일에 싸여있다.
4. 염료 솔루션은 -20 ° C.에 멈춰버립니다
5. 전에 염료 솔루션을 사용 10-15분에 대한 따뜻한 (25 ° C) 물 속에 폐쇄 및 포장 병을 배치하여 녹아있다.

3. 샤프 Microelectrodes를 사용하여 세포 주입에 의한 염료 중

우리는 염색과 뉴런을 로드할 수 날카로운 microelectrodes를 사용합니다. 우리가 MiCAM02 이미징 시스템 (SciMedia, 도쿄, 일본) ^6을 사용하는 염료 로딩을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 이미징 시스템을 두 개의 CCD 카메라를 가지고 : HR 카메라는 1.4 MS되고있는 최고의 시간적 해상도를 가진 더 나은 공간 해상도를 제공하는 큰 센서 칩 (6.4 mm X 4.8 mm)를 가지고, HS 카메라는 작은 (2.9 mm에게 X 2.1 mm)를 가지고 있지만 최선의 시간적 해상도 0.7 MS를 가지고 빠르게 영상을 허용 빠른 센서 칩. 염료 로딩의 단계는 다음과 같습니다 :

1. Microelectrodes이 함께 가져온하는 P - 97 플라밍 - 브라운 (셔터 인 스트 루먼트, 노바토, CA, 미국) 길이 10cm를 사용하여 전극 풀러, 필라멘트 (GB100TF 8P, 과학 제품, Hofheim, 독일)와 1mm 외경 유리 튜브. 전극의 저항을 가지고 행진25 범위 - 3M KCl 40 MOhm (해당 당기 매개 변수 설정이 전극 풀러의 제조 업체에서 제공하는 피펫의 요리책을 따르십 경우).
2. 냉동 염료 솔루션은 용융하고 그것의 매우 작은 금액은 microfil 바늘 (MicroFil - 34G, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 미국) -로 빨아 빨아 염료가 microfil 바늘의 2 / 3 ^차 주위를 채우고 .
3. microfil 니들의 염료 솔루션은 microelectrode의 일각에 주입합니다. microelectrode은 15 분 동안 어두운 상자에 배치됩니다.
4. microelectrode는 3M KCl 솔루션 backfilled입니다. 전극은 다음 microelectrode의 행동 모세관 힘의 흡입에 의한 전극의 좋은 팁을에 도달하기 위해 염료 솔루션을 수 있도록 다른 10-20분에 대한 어두운 전극 보관 상자에 다시 배치됩니다.
5. 준비 microelectrode는 전극 홀더에 위치하고 세포내 앰프의 headstage (IA - 251A, 워너 인 스트 루먼트 주식 회사, 햄든, CT, 미국)에 고정됩니다.
6. 세포 증폭기는 microelectrode로 현재 펄스를 운전하는 펄스 신호를 제공하는 데이터 수집 보드에 연결됩니다.
7. microelectrode는 microelectrode의 속이는 사람을 (PatchStar, Scientifica (주), 어크필드, 영국)를 사용하여 STG 신경 세포의 세포막에 부드럽게 배치됩니다. 10X 목적의 작동 거리 (UMPLFL10XW, NA 0.30, WD 3.3mm, 올림푸스 주식 회사, 도쿄, 일본) 이후 이미징 현미경은 아주 작은이고, microelectrode는 경사 위치에 위치 (30 ° 정도)과 운동해야 오른쪽 위치로 microelectrode의 현미경 목표의 다시 초점을 microelectrode 이동의 여러 단계가 필요합니다. microelectrode를 시작하려면은 그 끝은 STG 위에 그러한 위치에 이동합니다. 전극 팁 초점이 나타날 때까지 현미경 목표가가 낮아됩니다. 그렇다면 그것은 더욱 저하하지만 microelectrode을 만지는만큼 않습니다. 그것은 목표의 초점을 다시 나타날 때까지 microelectrode이 저하됩니다. 뉴런이 목표의 초점 평면에 명확하게 나타날 때까지이 단계를 반복합니다. 그것이 만지는하고 부드럽게 선택한 STG의 신경 세포의 세포막을 피어 때까지 microelectrode이 저하됩니다. 이것은 오실로 스코프를 사용하여 모니터링할 수 있습니다.
8. 세포내 전극은 그 활동을 프로필과 활동 및 세포 전극 ^2,3,7에서 기록된 STG 활동 사이의 관계를 주어진 신경 세포를 식별하기 위해 선택한 STG의 신경 세포의 활동을 기록하는 데 사용됩니다.
9. 세포 증폭기는 현재 분사 모드로 전환합니다 1 초 동안 마지막으로이 microelectrode로 현재는 주입과 일초 간격으로 구분되는 microelectrode에 긍정적인 현재 단계 NA 10 주입 30 분 동안 사용됩니다. 기록된 신경 세포에 주입 전류 드라이브 적극적으로 청구 염료 분자. 장비를 사용할 경우 여러 개의 뉴런이 동시에 주입 수 있습니다.
10. 사출 기간에 및 사출의 종료 후 10 분 신경 세포 내에 염료의 확산을 확인합니다. 필터 큐브 MSWG2을 통해 (와,이 작업을 수행하기 위해 우리는 초저 파급 할로겐 광원 (Moritex, 도쿄, 일본 HL - 151)에 의해 10X 객관적이고 조명과 MiCAM02 이미징 시스템 (SciMedia 주, 도쿄, 일본)을 사용 480-550 nm의 여기 필터, 올림푸스 주식 회사, 도쿄, 일본). 이미징 시스템은 192 X 128 픽셀 해상도, 40 MS 이미징 시간 'hbin'모드, 그리고 이미지 세션 당 10 프레임으로 HR 카메라를 사용하도록 설정되어 있습니다. 염색 작성에 성공하면 영상이 microelectrode의 위치 주변의 신경 세포의 염색 패치를 표시해야하고,이 염색 패치 10 분 후 30 분 후에 촬영한 이미지 사이에 성장한다. 염료의 확산은 30 분 후에 부족한 경우 더 주입 시간이 부여됩니다. 또한, 새로운 염료 전극을 사용할 수 있습니다.
11. 전극이 신경 세포에서 철수되고 신경 세포는 적어도 20~30분 기분 전환을 위해서 남아 있습니다. 이 시간 이내에 다음 신경 세포가 색소를 주입 수 있습니다.

4. 염색 뉴런의 이미징

단일 뉴런의 활동은 염료 작성 절차 후 몇 군데 있습니다. 또는 두 개 이상의 뉴런이 이미지를 여러 STG의 뉴런의 동시 활동을 가득 수 있습니다. 원칙적으로 많은 그리고 아마도 모든 STG 뉴런은 염료로 가득 수 있습니다. 뉴런의 이미지는 HR 카메라를 사용하여 MiCAM 02 이미징 시스템으로 이루어집니다. 다음과 같이 이미지의 절차는 다음과 같습니다

1. 현미경 목표가 변경되고 높은 광 전송 효율 20x 목적 (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0.95, WD 2.0mm, 올림푸스 주식 회사, 도쿄, 일본)은 이미징 데이터 수집에 사용됩니다. 이 목표는 또한 10X 객관적이고이 뉴런의 상세한 이미지를 제공하는 높은 배율을 제공 것이 훨씬 더 빛을 수집합니다. 바인 염료 로딩의 소량이 이미 우리가 염료에 의해 뉴런으로 인해 발생할 수 있습니다 잠재적인 사진 손상을 줄일 수 이미징에 대한 낮은 빛의 강도를 사용할 수 또한이 목표와 함께 볼 수 있다고 g 불이 더 효율적인 것을 의미합니다.
2. 현미경의 운영 단계는 몇 군데가 의미하는 뉴런의 목적의보기의 분야에 있고 목표가 그들에 초점을 맞추고 있습니다 그러한 위치입니다.
3. 세포외 녹음 데이터는 또한 아날로그 입력 채널을 통해 MiCAM 02 이미징 시스템으로 공급됩니다. 이것은 분석 단계에서 광학 신호와 대응하는 모터 패턴이나 extracellularly 기록 스파이크의 관련된 비교적 쉽게 사용할 수 있습니다.
4. MiCAM 02 시스템은 2.2 MS 이미징 시간 1.5 MS 이미징 시간 48 X 32 픽셀 해상도를 가진 96 X 64 픽셀 해상도를 사용하도록 설정되어 있습니다. 뉴런의 염색이 매우 강한되지 않은 경우 두 가지 경우 모두에서 'hbin'설정을 사용할 수 있습니다.
5. 가벼운 수준은 사진 변조와 기록 뉴런의 사진 손상을 방지하려면 (뉴런에있는 색소 즉, 여전히 이미징에 대한 충분한 형광을 생성한다) 가능한 한 낮게 설정되어 있습니다.
6. 실내 조명 및 모든 나머지 광원이 꺼져 있습니다. 또한, 검은 커튼이 외부 소스에서 빛의 노출을 방지하기 위해 녹음 장비 주위 닫힙니다 수 있습니다.
7. 길이 16초 - 이미지 세션 4 사이로 설정되어 있습니다.
8. 염색 뉴런의 자발적인 활동은 여러 이미지 세션을 통해 기록됩니다.

5. 광학 이미징 데이터 분석

MiCAM 02 이미징 시스템과 관련, 영상 자료를 분석하기 위해 우리는 BVAna 소프트웨어 (SciMedia 주, 도쿄, 일본 버전 10.08)을 사용합니다. 소프트웨어는 이미지 데이터의 시각화를 지원하고뿐만 아니라 분석 도구의 범위를 제공합니다. 데이터 분석 및 해석의 단계는 다음과 같습니다 :

1. 관심 적절한 원형 지역은 각각 기록 뉴런에서 선택됩니다. 일반적으로 우리는 2를 사용 - 48 X 32 픽셀 해상도 뉴런, 그리고 6 조사에 대한 관심을 3 픽셀 반경 지역 - 96 X 64 해상도에서 뉴런을 조사에 대한 관심의 8 픽셀 반경의 지역.
2. 데이터의 시간적 스무딩는 염료가 데이터에 형광 (낮은 배경 가치의 상대적으로 낮은 금액을 생성 이것을 나타냅니다 특히, 필요할 수 있습니다, 그것은 사용하는 낮은 조명 수준 또는 낮은 수준의 염색 로딩 원인일 수 있습니다, 예를 들어 기록된 신경 세포의 neurite에서). 일반적으로 이러한 경우에 우리는 3 관자놀이 케어를 사용 - 5 시간 단위.
3. 광학 녹음 이외에 우리는 이미징 시스템의 아날로그 입력을 표시하는 선택하여 세포 녹음을 표시합니다.
4. 광학 데이터와 아날로그 입력의 시각화에 대한 매개 변수는 컴퓨터 화면에 표시되는 모든 레코딩을 볼 수 있도록 적절하게 설정해야합니다.
5. 뉴런, lvn에서 세포외 기록, 그리고 이전 세포내 기록을 바탕으로 신경 세포의 분류 광학 녹음 고려, 이것은 신경 세포의 신원을 확인하고에서 기록된 신경 활동의 활동을 연관 수 있습니다 신경.
6. 이것은 광학 녹음이 명확하게 보여줄 것으로 기대하고, 여러 개의 유사한 이벤트, extracellularly 기록 스파이크와 또 다른 뉴런의 활동에 의해 발생 억제 후 시냅스 후보로 subthreshold 이벤트에 해당하는 신경 활동을 통해 평균의 필요없이. 것입니다
7. BVAna 소프트웨어의 데이터 내보내기 기능은 관심이 선택한 지역과 또한 lvn에서 녹음을 포함하고있는 아날로그 입력에 대한 계산 광학 녹음을 수출하는 데 사용할 수 있습니다. 내보낸 데이터 처리 및 추가 다른 데이터 분석 소프트웨어뿐만 아니라 (가장 간단한 경우는 예를 들어 Microsoft Excel에서이 (마이크로 소프트, 레드 몬드, WA, 미국) 추가 시각화 및 데이터 처리를 위해 사용될 수있다)를 사용하여 분석하실 수 있습니다.

6. 대표 결과

lvn의 기록과 함께 STG 게의 pyloric 중앙 패턴 발생기에, 그림 2는 두 뉴런 (PD, pyloric 확장시키는 신경 세포 LP, 측면 pyloric 신경 세포)의 동시 녹음을 보여줍니다. 그들의 세포 기록을 바탕으로 식별 LP와 PD 뉴런의 광학 녹음이 표시되는 LP와 PD 뉴런에 해당하는 세포 레코딩 잘 실제로이 일치합니다. 신경절 및 세포외 기록 사이트 간의 axonal 전송 지연으로 인해 스파이크 봉우리의 광학 및 lvn 녹음 사이의 일관성 12 MS의 지연 (그림 2 삽입된 페이지 참조)이 있습니다. 발표 자료는 또한 기록 뉴런의 스파이크에 해당하는 소마의 신경 활동이 명확하게 감지할 수있다는 것을 보여줍니다.

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그림 1. stomatogastric 신경계 (STNS)의) 도식 다이어그램. 코그, commissural 신경절, OG, 식도 신경절, STG, stomatogastric 신경절, 미역, stomatogastric 신경, lvn, 측면 심실 신경. B) 게 stomatogastric 신경절 (STG) - 이미지 STG 뉴런의 반원의 사후 배치를 보여줍니다.

그림 2. 함께 lvn의 기록과 동시 PD의 단일 스위프 기록 및 LP 신경 세포. 데이터는 광학 및 신경 녹음 잘 일치하고 우리가 신경을 형성 기록 스파이크에 해당하는 신경 활동을 확인할 수 보여줍니다. 광학 및 전기 기록된 활동 사이의 일치를 보여주는 그들의 평균 - 모두 광학 및 전기 기록 - 삽입된 페이지는 LP 액션 잠재력 여러 감시 장치의 오버레이를 보여줍니다. 우리의 광학 녹음 방식은 우리도 PD와 LP 뉴런 ¹⁴ 특성 느린 막 잠재적인 변경 사항을 기록할 수있는 데이터의 낮은 주파수 구성 요소를 필터링하지 않는다는 사실 때문에.

토론

전통적인 전기 생리학 방식 (내부 및 세포외 전극 녹음)와 함께 신경을 STG의 전압에 민감한 염료 영상 ^{8,9 어떻게이} 작은, 잘 알려진 여전히 복잡한 신경 시스템 작동의 향상된 이해를하실 수 있습니다. STG는 중앙 패턴 발생기 (CPG)의 연결을 네트워크 ^{10, 11,} 따라서 STG의 응급 기능적 특성에 대한 이해도 방법을 일반적으로 이해하기 위해 도움이 될 것입니다 (이것은 pyloric 및 위장 밀 리듬 네트워크를 포함)의 프로토 타입입니다 CPG 네트워크는 네트워크 수준의 기능을 생성합니다. CPG 네트워크 또한 높은인지 기능 ¹³ 모터 제어 ¹² 중요한 역할을, 따라서 그들의 응급 속성의 이해는 신경 과학의 여러 분야에서 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MiCAM02	SciMedia		Imaging system
BVAna v.10.08	SciMedia		Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system
HL-151	Moritex, Tokyo, Japan		Ultra-low ripple halogen light source
BX51 WI	Olympus Corporation		Upright microscope for epifluorescence imaging
20x imaging objective	Olympus Corporation	XLUMPLFL20XW/0.95	NA 0.95, WD 2.0mm
10x imaging objective	Olympus Corporation	UMPLFL10XW	NA 0.30, WD 3.3mm
Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter	Olympus Corporation	MSWG2
Antivibration table	Scientifica Ltd	63-534
PatchStar electrode manipulator	Scientifica Ltd	PS-7000C	Micro-electrode manipulator
CED Power 1401	Cambridge Electronic Design		Data acquisition board
DL708E Oscilloscope	Yokogawa		Intracellular amplifier
AC differential amplifier	University of Kaiserslautern, Germany		Extracellular amplifier
P-97 Flaming – Brown type electrode puller	Sutter Instrument Co.		Electrode puller
Sigma Microcentrifuge 1-14	Sigma-Aldrich		Centrifuge
Genex Pipettors Mline	Scientific Laboratory Supplies LTD	PIP7774	PIP7774
Glass micropipette with filament	Science Products	GB100TF 8P	Glass for micr–lectrodes
MicroFil – 34G	World Precision Instruments, Inc.		Microfil needle
Spike 2 v6.10	Cambridge Electronic Design		Electrophysiology software
Di-8-ANEPPQ	Cambridge BioScience	BT61014	Fluorescent voltage sensitive dye
F-127 Pluronic Acid, DMSO	Invitrogen	P-3000MP	Solvent
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Crab saline component
CaCl2 . 2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	Crab saline component
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	Crab saline component, electrolyte solution
MgCl2 . 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Crab saline component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	Crab saline component
Maleic acid	Sigma-Aldrich	M0375	Crab saline component
Elastosil RT-601	Wacker, Munich, Germany		Lining of Petri dishes