Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

요약

효모에서이 프로토콜에서 유전자 발현 ( Saccharomyces cerevisiae) 변경 과산화수소의 추가 (H에 의해 유도된 산화 스트레스에 노출 후 ₂ O ₂), 산화 요원.

초록

이 프로토콜에서는 효모 (Saccharomyces cerevisiae의)에서 유전자 발현이 변경됩니다 과산화수소의 추가 (H ₂ O _2), 산화 대리인에 의해 유도된 산화 스트레스에 노출 후. 실험에서 효모는 배 포도당을 포함한 1/2X YPD의 국물에 48 시간 동안 성장합니다. 문화 제어 및 치료 그룹으로 분할됩니다. 실험 문화 0.5 MM 행크스의 H ₂ O ₂ 치료하면 1 시간 (HBSS) 살린 버퍼. 컨트롤 문화는 HBSS로 처리됩니다. 총 RNA는 두 문화에서 추출되고 다단계 프로세스를 통해 비오틴 - 표시 cRNA 제품으로 변환됩니다. 최종 합성 제품은 UVM Microarray 핵심 설비로 이동 및 Affymetrix의 효모 GeneChips에 hybridized입니다. 그 결과 유전자 발현 데이터는 생물 정보학 데이터 분석 소프트웨어로 업로드됩니다.

프로토콜

1. 에서 총 RNA를 분리 Saccharomyces cerevisiae 효소 용해를 사용하여

1. RNase 써 (앰비온)를 사용하여 RNase없는 작업 영역을 준비합니다.
2. 10 U / UL의 최종 작업 솔루션을 만들기 위해 직접 lyticase의 약병에 RNase없는 물 1 ML 추가하여 새로운 작업 lyticase 시약을 준비합니다. 잘 소용돌이하고 완전한 혼합을 확보하기 위해 여러 번 반전. 이 10 단위 / μl 솔루션은 12 시간 동안 안정합니다.
3. 얼음에 Qiagen DNase 키트 및 저장소를 사용하여 신선한 DNase I 솔루션을 준비합니다.
4. 라벨 1.7 ML의 microcentrifuge 관 귀하의 식별 정보와 함께. 튜브에 해당 효모 문화의 1.5 ML을 전송합니다.
5. 상온에서 2 분 동안 5,000 XG (약 4분의 3 전체 속도)에서 튜브를 원심 분리기. 조심스럽게 micropipette를 사용하여 (방해 펠렛없이) 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.**** 4 단계를 반복합니다 .****
6. 펠렛, 소용돌이, 2 분 동안 5,000 XG에 원심 분리기 1000 μl DEPC 물을 추가합니다. 뜨는 폐기하십시오. 효모 펠렛에서 가능한 액체의 많은를 제거합니다.
7. 섞어 누룩 펠렛과 와동에 다음을 추가합니다.
   
8. 상온에서 30 분 알을 품다.
9. 부드럽게 소용돌이 관에게 spheroplasts를 생성하기 위해 10 분마다 있습니다. Spheroplasts는 부드럽게 처리할 수 있어야합니다. 전체 spheroplasting을 관찰하기 위해 현미경으로 효모를 검사합니다. 현미경 슬라이드에 누룩을 조사한 결과, 완벽한 분야를 (심지어는 신진 전지) 팽창과 양식에 누룩을 일으킬 SDS 0.1 %의 작은 금액을 추가합니다. 이것은 세포 벽이 소화되어있다는 것을 나타냅니다.
10. 튜브와 와동 350 μl B - RLT 버퍼를 추가 노골적인 협상을 1 분. vortexing하면서 튜브가 단단히 뚜껑을 누른 상태 났고요 확인이 종료되었습니다. 이 절차는 spheroplasts을 lyse 것입니다.
11. 튜브와 간단히 와동 250 μl 100 % 에탄올을 추가합니다. 침전물은 에탄올의 추가 후 양식지만, 이것은 RNA의 수집에는 영향을 미치지 않습니다.
RNA 모집 : 라벨 귀하의 신분증과 RNeasy 스핀 컬럼 micropipette를 사용하여 스핀 컬럼에 10 단계의 솔루션의 모든 전송 주의깊게 informationand. pipet 팁과 실리카 막 만지지 않도록주의하십시오. 튜브를 닫고 최고 속도로 15 초 동안 원심 분리기. 예제에서 RNA는 스핀 열의 실리카 막을 준수합니다.
12. 컬렉션 튜브의 스핀 컬럼을 제거합니다. Pipet는 액체 통과 (모음 튜브에 액체) 다시 스핀 컬럼에 다시 원심 분리기. 수집 튜브를 무시 (유체를 통해 흐름) 및 새로운 2 ML 수집 관에 스핀 컬럼을 넣으십시오.
13. 스핀 컬럼에 350 μl RW1 버퍼를 추가합니다. 이 솔루션은 RNA를 씻은 후 소금과 해산 세포 파편을 제거하는 데 사용됩니다. 튜브를 닫고 최고 속도로 15 초 동안 원심 분리기.
DNA를 소화 : 원심 분리기에서 스핀 컬럼을 제거 튜브 뚜껑을 열고 스핀 열 막의 중간에 DNase I 솔루션의 80 μl를 추가합니다. 이 단계는 예제에서 gDNA를 소화합니다. 열 뚜껑을 닫고 15 분 동안 상온에서 알을 품다.
14. 새로운 두 ML 수집 관에 스핀 컬럼을 전송합니다.
청소 및 RNA를 씻는 : 스핀 컬럼에 350 μl RW1 버퍼를 추가하고 15 초 동안 최고 속도로 원심 분리기.
15. 수집 튜브를 취소하고 새로운 2 ML 수집 관에 스핀 컬럼을 넣으십시오.
16. 실리카 막의 RNA를 씻어 스핀 컬럼 500 μl RPE 버퍼를 추가합니다. 최고 속도로 15 초 동안 튜브와 원심 분리기를 닫고.
17. 수집 튜브를 취소하고 새로운 2 ML 수집 관에 스핀 컬럼을 넣으십시오.
18. 스핀 컬럼에 다른 500 μl RPE 버퍼를 추가하여 다시 실리카 막 씻으십시오. 튜브를 닫고 최고 속도로 15 초 동안 원심 분리기.
19. 잔여 액체가 실리카 막에서 제거하기 위해 1 분 최대 속도 microcentrifuge에 새로운 두 ML 수집 관과 원심 분리기에 스핀 컬럼을 놓습니다.
RNA 복구 : 샘플 정보로 분​​류되었습니다 새로운 1.7 ML의 microcentrifuge 관에 RNeasy 스핀 컬럼을 전송합니다. 새로운 튜브의 뚜껑이 앞으로 몇 단계에 열려진 채로 남겨질됩니다.
20. 조심스럽게 pipet 30 μl RNase없는 물 직접 센터에 실리카 막의. (그림 참조) pipet 팁과 실리카 막 만지지 말아요. 이 단계를 수행 가까이보세요. pipet 안내를 양손을 사용합니다. 물이 골고루 멤브레인에 분산되어 있는지 확인하십시오.
21. 1 분간 실온에서 스핀 컬럼을 품어. 30 초 최고 속도로 원심 분리기.
22. 조심스럽게 위의 단계 22와 같은 스핀 칼럼의 실리카 막의 중심에 다시 1.7 ML 튜브에서 발견되는 30 μl를 전송합니다. 같은 1.7 ML 수집 관에 다시 컬럼을 놓고 실온에서 1 분 알을 품다. 최고 속도로 1 분 원심 분리기. 이 두 용출은 RNA의 최대한의 금액이 막에서 발견한 것을 처리됩니다.
23. 라벨 두 가지 새로운 1.7 ML의 microcentrifuge의 사용자 식별 정보와 튜브 이러한 튜브 중 하나 회복 RNA 샘플의 모든 전송합니다.
24. 다른 레이블 관이 샘플 중 4 μl를 전송합니다. 이 샘플은 Nanodrop 부량와 RNA 질적 평가 (이것은 연구소 참여의 사이트에서 수행 RNA 정량 및 정성 분석을 확인하는 것입니다)에 대한 UVM로 이송됩니다.
25. 얼음의 모든 샘플을 넣으십시오.
RNA의 양을 정함 : Eppendorf의 Biophotometer를 사용하여 1-50 희석에있는 분광 광도계의 RNA 샘플의 흡광도를 측정 (1μl 샘플 + 49μl H ₂ O).
26. E - 젤 (Invitrogen) 전기 영동에 대해 1.2 % 아가로 오스 프리 캐스트 젤을 사용하여 RNA의 품질을 평가해보십시오.
RNA 질적 분석 : E - 겔 전기 영동 장치를 설정합니다. 제조 업체의 절차에 따라 2 분 겔을 미리 실행합니다. 사전 실행 후, 겔 빗를 제거하고 잘 각 잘 각 샘플의 1μl 다음 각 물을 14 μl를 추가합니다. 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다. 하나의 잘 나중에 크기 비교 (BioL​​ine 쉬운 레더 나는 표준 또는 Novagen PCR 마커를 크기)에 적합한 크기의 DNA 사다리를 사용합니다. 각 차선에있는 샘플 기록합니다. 20 분 동안 젤을 실행합니다.
27. 젤 사진을 가져가라.

2. 먼저 스트랜드 cDNA 합성

1. 0.5 ML PCR 튜브 귀하의 식별 정보를 라벨. 위의 실험에서 결정 RNA의 농도에서, 3.0 UG를 얻을 수있는 샘플의 볼륨을 계산합니다. 튜브에이 금액을 전송합니다. 11.0 UL에 볼륨을 가지고 충분한 RNase 무료 물을 추가합니다.
2. 1.0 μl T7 oligo (DT)을 추가 _{24 시약. 모든 시약은 이전 것을 보장하기 위해이 단계 동안 pipet 팁 볼륨에 특히주의해야합니다. 와동 5 초 동안 최대 속도에서 튜브와 원심 분리기. 70 세트 thermocycler에 튜브를 삽입 ° C 10 분.}
하지만, 새로운 튜브의 첫 번째 스트랜드 마스터 믹스를 준비합니다. 다음과 같은 시약을 추가하시기 바랍니다 순서로, 와동 및 원심 분리기.


SGbuffer	10 μl
Lyticasesolution (10u/μl)	30 μl

2 μl 이하의 볼륨을 측정 P2의 micropipette를 사용하십시오.
28. 70 후 2 단계에서 ° C 배양이 완료되면 60 분 동안 42 ° C에서 thermocycler에 관과 부화 3 단계에서 만든 최초의 스트랜드 마스터 믹스 8 μl를 추가합니다. 첫째 스트랜드 합성 보육이 완료되면, 얼음 튜브를 놓으십시오. 이 부화하는 동안, 두 번째 스트랜드 마스터 믹스를 준비합니다.

3. 둘째 스트랜드 cDNA 합성

1. 새로운 튜브에 다음 두번째 스트랜드 마스터 믹스를 확인하십시오. 그 얼음 보관하십시오. 와동 및 사용하기 전에 모든 시약을 원심 분리기. 나열된 순서에 시약을 추가합니다.
   

먼저 스트랜드 마스터 믹스 :
FirstStrandBuffer5X	4 μl
0.1MDTT	2 μl
10mMdNTP	1 μl
SuperscriptII	1 μl

Ecoli DNA Ligase (10U/ul) Ecoli DNA 중합 효소 I (10U/ul) Ecoli RNase H (2U/ul)
29. 소용돌이 전속력으로 5 초 동안 튜브 및 원심 분리기.
30. 42 ° C 보육이 완료되면, RNA 및 첫번째 스트랜드 시약을 포함하고있는 샘플 튜브에 두 번째 스트랜드 마스터 믹스의 모든 130 μl를 전송. 상온에서 5 초 동안 와동 및 원심 분리기. 16 ° C thermocycler의에서 2 시간 동안 튜브를 품어.
31. 2 시간 보육의 끝에와 샘플 16 계속되는 동안 ° C, 튜브에 2μl T4의 DNA 중합 효소 시약을 추가합니다. 간단히 와동 및 NO 5 개의 추가적인 분 16 ° C에서 튜브와 부화를 원심 분리기. 더 후 5 분 잠복기하면 T4 효소의 3'to 5'exonuclease 활동에 의한 cDNA의 품질을 줄일 수 있습니다.
32. 5 분 부화 끝에, T4의 DNA 중합 효소 반응을 중지 10 μl 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. -20 ° C.에 튜브를 저장

4. cDNA를 Precipitating

1. 젤 튜브의 아래쪽에 있습니다 확보 1 분 최고 속도로 위상 잠금 젤 튜브를 원심 분리기. 와동 위상 잠금 튜브는하지 마십시오.
2. 의 162 μl 추가 바닥 층 산도에서 8.0 트리스의 내용을 (위의 실험에서 cDNA 합성 단계의 총 볼륨 믹스 5 초 동안 두 번째 가닥 cDNA 합성 반응 관과 와동의 내용 페놀 / 클로로포름 / Isoamyl 알코올 (PCI)를 버퍼 162 UL 있습니다. PCI 단계)는 수성 유기 혼합물의 동등 권이 필요합니다.
3. micropipet를 사용하여 위상 잠금 겔 튜브로 cDNA - PCI 혼합을 모두 전송합니다. 와동하지 마십시오 위상 잠금 겔 튜브.
원심 분리기.
4. 새로운 1.7 ML의 microcentrifuge 관을 라벨. 위상 잠금 겔 튜브에서 새로 표시 1.7 ML 튜브 가기 레이어를 전송하는 micropipet을 사용합니다. 가능한 레이어의 많은를 수집하려고합니다.
5. 1.7 ML의 microcentrifuge 관과 소용돌이에 다음을 추가합니다.
   

둘째 스트랜드 마스터 믹스
DEPC 워터	91 UL
배 둘째 스트랜드 버퍼	30 UL
dNTPs (10mM)	3 UL
1 UL
4 UL
1 UL

33. 밖으로 직면하고있는 튜브의 경첩이 달린 원심 분리기에 튜브를 삽입하고 실온에서 20 분 동안 최고 속도로 원심 분리기.
34. 부드럽게 cDNA 펠렛을 방해하지 않도록주의되는 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. 펠렛은 분홍색과 소금의 곡물과 그 경첩이 아래에있는 튜브의 측면에 약 크기한다. 얼음 플레이스 바로 다음 단계로 진행합니다.

5. cDNA 펠렛 청소

1. P1000 micropipet를 사용하여 조심스럽게 튜브의 표면에 뜨는 모두 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. 펠렛은 샘플입니다 기억!
2. 500μl 차가운 80 % 에탄올을 (-20에 저장된 추가 ^° 튜브에 C 냉동고). 부드럽게 튜브 뚜껑 천천히 여러 번 그것을 반전. 세심히 펠렛을보세요. 펠렛가 분리되면, 랙에 다시 튜브를 삽입하고 펠렛 바닥에 정착하자. 번갈아, 당신은 펠릿가 다운 튜브의 바닥에 다시 15 초 동안 최대 속도에서 튜브를 원심 수 있습니다.
3. P1000 micropipet를 사용하여 조심스럽게 에탄올이 펠렛을 방해하지 않도록 조심하고 제거합니다. 가능한 많은 액체의 제거를 활성화하기 위해 튜브를 팁.
4. 80 % 에탄올의 새로운 나누어지는로 2 단계와 3 단계를 반복합니다.
5. 마지막으로, P1000 micropipet를 사용하여 가능한 에탄올을 모두 제거합니다. 5 초 동안 최대 속도에서 튜브를 원심과 P20 micropipet를 사용하여 에탄올의 마지막 몇 microliters를 제거합니다. 목표는 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많은 에탄올로 제거하는 것입니다.
6. 나머지 에탄올을 증발시키는 10-20분위한 랙 또는 건조 상자에 열려있는 튜브를 놓습니다. 그것이 건조되면 건조 펠렛 쉽게 손실됩니다. 부드럽게 튜브를 처리하는 Becareful. 완료되면 뚜껑을 닫습니다. 그것은 튜브에 존재 확인 건조 펠렛을 시각화.
7. RNase없는 물과 얼음에 장소 튜브를 22 μl의 펠렛을 Resuspend.

6. InVitroTranscription (IVT)

1. 엔조 bioarray 키트는 cDNA에서 비오틴 분류 cRNA를 준비하는 데 필요한 모든 시약이 포함되어 있습니다.
   마스터 mixfor이 믹스를 준비하거나 클래스에서 사람을 지정합니다. 이것은 RNase가없는 지역에서 이루어져야합니다.
   

에탄올 (100 %)	405 UL
NH 4 OAc	80 UL
펠렛 페인트	1 UL

참고 : 샘플 더하기 하나의 번호에 대한 충분한 마스터 믹스를 준비합니다. 이것은 pipetting을 위해 충분히 확보합니다.
35. 0.5 ML PCR 튜브를 라벨. 튜브 및 pipet 최대에 다음을 결합하고 아래로 몇 번 혼합합니다. 튜브의 바닥에 대한 모든 시약을 5 초 최고 속도로 원심 분리기에 돌려.
    

	AMT / 샘플	# 샘플	종합
시약 1 [10X 반응 완충액]	4μl
시약 2 [10X Biotinnucleotides]	4μl
시약 3 [10X DTT]	4μl
시약 4 [10X RNase 억제제]	4μl
시약 5 [20x T7 RNA 효소]	2μl
총 볼륨	18 μl

36. ° C for16 시간 thermocycler에서 37에서 튜브를 품어. 반응이 완료되면, -20 ° C에서 샘플을 저장

7. Biotinylated cRNA 청소

1. 새로운 1.7 ML의 microcentrifuge 관에 전체 cRNA 샘플을 전송합니다. RNase가없는 물을 60 μl와 5 초 동안 350 μl RLT 버퍼와 와동을 추가합니다.
2. 다시 250 μl 100 %의 에탄올과 와동을 추가합니다.
3. RNeasy 스핀 열 레이블과 열 전체 cRNA 샘플을 전송할 수 있습니다. 실리카 막에 pipet의 끝부분을 만지지 않도록주의하십시오. 최고 속도로 15 초 동안 뚜껑과 원심 분리기를 닫습니다.
4. 컬렉션 튜브의 스핀 컬럼을 제거합니다. Pipet는 액체 통과 (모음 튜브에 액체) 다시 스핀 컬럼에 15 초 동안 다시 원심 분리기.
5. 스핀 열의에 새로운 두 ML 수집 관과 RPE 버퍼의 pipet 500 μl에 스핀 컬럼을 놓습니다. 튜브를 닫고 최고 속도로 15 초 동안 원심 분리기. 액체를 통해 수집 튜브와 패스를 폐기하십시오. 새로운 두 ML 수집 관에 스핀 열의를 놓습니다.
6. 스핀 컬럼에 다른 500 μl RPE 버퍼를 추가합니다.
7. 새 컬렉션 튜브에 스핀 컬럼을 전송 2 분 동안 최대 속도에서 열 "건조"스핀을 수행합니다.
8. 귀하의 식별 정보와 함께 새로운 1.7 ML의 microcentrifuge 관을 라벨. 이 튜브에 스핀 컬럼을 전송합니다.
Pipet 30 μl RNase없는 물. 최고 속도로 1 분 튜브와 원심 분리기를 닫습니다.
9. 조심스럽게 동일한 스핀 칼럼의 RNeasy 실리카 막의 중심에 다시 1.7 ML 튜브에서 발견되는 30 μl를 전송합니다. 같은 1.7 ML 수집 관에 다시 컬럼을 놓고 실온에서 1 분 알을 품다. 최고 속도로 1 분 원심 분리기. 이 두 용출은 cRNA의 최대한의 금액이 막에서 발견한 것을 처리됩니다.
10. 적절하게 새로운 1.7 ML의 원심 분리기 튜브 및 라벨이 깨끗한 비오틴 - 라벨 cRNA을 전송합니다.
11. RNA 격리 절차 동안 위에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하여 cRNA 농도를 결정합니다. 농도와 280분의 260 비율을 기록합니다.

8. 대상 준비에 대한 cRNA을 Fragmenting

1. 0.5 ML PCR 튜브 귀하의 식별 정보를 라벨. 튜브에 cRNA의 상당 금액의 5 UG을 전송합니다. 16.0 UL로 전체 볼륨을 가지고 다음 튜브에 배 조각 버퍼의 4.0 μl를 추가하는 정도로 RNase 무료 물을 추가합니다. 튜브의 총 볼륨은 20.0 UL해야합니다.
2. 소용돌이 10 초 튜브와 원심 분리기. thermocycler 30 분 94 ° C에서 튜브를 품어. 부화 다음 얼음에 넣어.

9. 아가로 오스 겔을 사용하여 조각난 및 조각 화되지 않은 cRNA를 평가

1. 1.2 % 아가로 오스 프리 캐스트 젤을 사용하여 E - 겔 전기 영동 장치를 설정합니다. 제조의 추천에 따라 2 분 젤 사전 실행
2. E - 젤 각 물론 물을 14 μl를 추가합니다.
3. 최대 각 잘하고 pipet 각 샘플의 2μl을 추가하고 아래로 잘 혼합합니다. 각 샘플의 조각과 조각 화되지 않은 cRNA 모두를 분석합니다. 인접 차선의 샘플 (조각과 조각 화되지 않은)로드하는 것이 좋습니다. 각 차선의 각 샘플의 신원을 기록합니다.
4. 젤 중 한 차선에 DNA를 사다리 (필자는 표준 또는 Novagen PCR 마커를 크기 BioLine 용이 레더) 4 μl 추가
5. 20 분 동안 젤을 실행합니다.
6. transilluminator에서 E - 젤 시각화. 겔 사진을 가져가라.

10. 효모 2.0 GeneChip에 하이브 리다이 제이션

대표 검색 결과 :

그림 1. 스캔 Affymetrix GeneChip 효모 이미지 (Affymetrix GeneChip 운영 소프트웨어 (GCOS))

Figure2. 2D 스캐터 플롯. 각 지점은 하나의 유전자를 나타냅니다. 보라색의 유색 인종 유전자는 붉은 색 유전자가없는 동안 differentially 표현 유전자를 나타냅니다. differentially 표현 유전자에 대한 설명은 해당 전설 표시하고 대부분이 예제에서 세포주기 조절에 관여하고 있습니다. (Affymetrix GeneChip 운영 소프트웨어 (GCOS))

그림 3.이 순서는 영향을받는 생물 학적 경로에 differentially 표현 유전자를 보여줍니다. 레드 스타와 함께 표시 유전자는 meiotic 경로에서 다운 - 규제 유전자를 나타냅니다. (주석, 시각화 및 통합 검색 (데이비드를 위해서도 데이터베이스)

그림 4. 대표 결과. 제어 및 처리 샘플은 0.05의 잘라 1.5 배 표정 변화가 잘려 P - 값과 비교했다. 이 음모는 친절 교육 목적으로 학생들에게 기증 Geospiza의 Genesifter 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다.

cDNA 혼합물	22μl
Enzomastermix [fromabove]	18μl
TotalVolume	40μl

토론

응용 프로그램 및 의의.

버몬트 유전학 네트워크 아웃리치 프로그램, 버몬트 대학에서, 주 (州)에 걸쳐 여덟 파트너 학사 학위 대학으로 본과 아웃리치를 실시하고 있습니다. VGN 아웃리치 코어의 목표는 경험 - 손을 사용하는 최첨단의 과학 기술 및 리소스에 대한 버몬트의 상태에서 학부생을 폭로하는 것입니다. 설명한 microarray 모듈은 2003 년 개발 이후 업그레이 드되었습니다. 이것은 미니 코스로 제공 또는 참여 기관에서 기존의 실험실 교과 과정에 통합되었습니다.

이 프로젝트는, 연구 대학 코어와 본과 대학 사이에, 교육 및 연구 협력을 추진하고 있습니다. 주 전역 Microarray 복지는 교육 과정을 향상 및 핵심 시설, 교수와 학생을위한 연구 및 네트워킹 기회를 만들었습니다.

학부 교수가 프로그램을 채택으로 그들은 적절한 Affymetrix의 GeneChips 사용 가능한 특수 효과가 제공하는 독특한 실험을 설계하는 것이 좋습니다. 실험실 매뉴얼, 참조 및 PowerPoint 프레 젠 테이션 포함하여이 모듈에 대한 모든 정보는 온라인 (버몬트 유전학 네트워크, 2008)입니다.

중요 단계

Spheroplasting : 현미경 성공 spheroplasting을 관찰하는 것이 중요합니다. 그것이 spheroids에서 발생하는 효모 붓기의 원인으로 SDS의 사용은 매우 유용합니다. 신진 세포뿐만 아니라 spheroids를 형성 것을 관찰하는 것이 중요합니다. 부분 spheroplasting이 관찰되면 lyticase있는 확장 치료를 권장합니다.

펠렛 청소 : 석출 반응 이후 에탄올 세척 단계 동안, cDNA 펠렛을 잃게하는 것은 매우 쉬운 그것이다. 펠렛에 극단적인 관심과 세심한주의가 필수적입니다.

멤브레인의 중심에 물을 적용 : 멤브레인에서 RNA의 용출 단계 동안, 그것은 "애송이"직접 실리카 막의 중심에 물을 30 μl하는 것이 중요합니다. 이것이 달성되지 않으면, 컬럼은 centrifuged 수 있으며 결과 elutant 다시 실리카 막에 다시 적용할 수 있습니다. 이것은 필요에 따라 여러 번 반복으로 수 있습니다.

수정 및 제품 요구 사항 :

1. 다른 RNA 청소 열이 대체하실 수 있습니다. 예 USB 준비 - 쉽고 Invitrogen 퓨어 링크 RNA 키트, 그리고 몇 가지 이름으로 오메가 RNA 청소 키트입니다.
2. Schizosaccharomyces pombe의 선택은 효모이다. Affymetrix GeneChip은 동일한 칩에 두 genomes를 포함
3. 각종 치료 및 시간 사용할 수 있습니다. 이것은 약물 치료, 온도 트리 트먼트, 안티 - oxidants 등 처리 시간도 조정할 수 있습니다 포함될 수 있습니다.
DNase 처리가 필요하지 않을 수 있습니다.
4. 이것은 동일한 30 μl 나누어지는와 컬럼에서 RNA의 이중 용출을 수행할 필요가 없습니다. 일단 거의 항상 충분합니다. 이것은 완전한 복구를 얻을 것을 막기 위해 제안합니다. 또한, 열에서 RNA를 elute하는 데 사용되는 물이 65 미리 가열 수 있습니다 ° C 더욱 실리카 칼럼에서 RNA를 복구하는 능력을 향상시킬 수 있습니다.
5. 많은 방법은 RNA를 정할 수 있습니다. Eppendorf과 Nanodrop는 사용하는 자신의 편의를 위해 선택과 정확도를 테스트하고 있습니다.
6. 아가로 오스 겔 전기 영동은 많은 표준 실험실 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다. E - 젤이 필요하지만 RNase 무료이​​며 겔 응고 대기 시간을 필요로하지 않기 때문에 바람직하지 않습니다.
주문 정보가 제공되었습니다. 그러나 대부분의 일반적인 시약은 여러 공급 업체로부터 주문하실 수 있습니다. 한 사이클 cDNA 시약은 별도로 구입하실 수 있습니다.
7. 이 다른 대상 준비 방법은 있지만 우리는이 한 학생에 대한 더 교육 기회를 제공 느낍니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spetrophotometer
Thermocyler
Microcentrifuge
소용돌이
휘저어 접시 (2)
P - 10 초의 pipettors
P - 20의 pipettors :
P - 200의 pipettors :
P - 1000의 pipettors :
카메라 및 transilluminator
E - 젤 장치 Invitrogen G6000 - 08
E - 젤 Invitrogen G6018 - 02
Axygen 1.7 ML. 맑은 Krackler 383 - MCT175C
Axygen 0.5 ML 맑은 튜브 Krackler 383 - MCT060C
Axygen 2ml 캡처 튜브 Krackler 383 - MCT200NC
의 박스 P - 100 ART 도움말 : CLP BT200
의 박스 P - 20 ART 팁 : CLP BT20
효모 칩
25 ML 멸균 일회용 pipets -
5ml 멸균 일회용 pipets -
Microfuge 튜브 랙
KimWipes :
랩 코츠
바 저어
문화 flasks
Innoculating 루프
Sharpies
장갑
압력솥 테이프
활동가 바
30 % 과산화수소 EMD Millipore 386,790
CA, MG없이 HBSS, 또는 염료 시그마 - 알드리치 H6648 - 100ml
Qiagen Rneasy 미니 키트 : Qiagen 74,104
Qiagen DNase 키트 : Qiagen 79,254
Rnase의 리무버 댄빌 과학 D1180
Harleco 알코올 백퍼센트 EMD Millipore 65,347
엔조 IVT 키트 엔조 ENZ - 42655-10
Lyticase : 한 병 VWR IC19012310
물, 세포 배양 등급 EMD Millipore 4.86505
효모 문화 ATCC 18,824
YPD 국물 분말 EMD Millipore 4.8504
D (+) 포도당, 무수 EMD Millipore 346,351
Sorbitol EMD Millipore 56,755
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) EMD Millipore 4005
SDS 용액, 20 % EMD Millipore 7990 - OP
펠렛 페인트 EMD Millipore 69,049
PCI RNase DNase 무료 (7 aliquots) : 피셔 AC32711 - 500
7.5M NH4OAc 피셔 ICN1987 5980
파쇄 버퍼 (200 MM 트리스 - 아세테이트, 산도 8.1, 500 MM KOAc, 150 MM MgOA)
Trizma베이스 Fiaher 50-899-90034
KOAc 피셔 NC9757725
MgOA 피셔 NC9681042
로딩 다이 Invitrogen 10482055
PCR의 마커 EMD Millipore 69278-3
위상 잠금 젤 피셔 FP2302820
한 사이클 cDNA 키트 Invitrogen A10752 - 030
포함;
E. 대장균 DNA 폴
dNTP의
T4 DNA의 폴.
T - 7 oligod (T)
0.5ml EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.0
먼저 스트랜드 버퍼
E. 콜리 RNaseH
둘째 스트랜드 버퍼
E. 콜리의 DNA ligase
어깨 II
DTT