초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

요약

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초록

^1-3 살아있는 세포의 맥락에서 발생하는 염색질의 상호 작용 : 염색질 immunoprecipitation (칩)은 단백질을 식별하는 강력한 도구입니다. 이 기술은 널리 기본 조직에서 낮은 정도 조직 문화 세포에 악용하고있다. 특히 개발 초기 시간에 쥐 배아 조직에 칩의 응용 프로그램, 조직의 한계와 배아의 세포와 조직 유형의 이질에 의해 복잡합니다. 여기 dissociated 배아 하루 8.5 (E8.5) 배아를 사용하여 칩을 수행하는 방법을 제시한다. 염색질 상호 작용 : 단일 E8.5 배아에서 가지각색 염색질은 컨트롤과 특정 단백질의 조사를 위해 조사 충분한 자료를 수있는 다섯 aliquots에로까지 나눌 수 있습니다.

조직 특정 유전자 발현 프로그램의 사양 중 염색질 상호 작용 : 우리는 단백질을 문서로 시작이 기술을 활용합니다. 모든 상호 작용이 발생 여부를 구별하지 않고 염색질 상호 작용의 일부, 또는 하나의 셀 타입 (S) : 결과가 단백질의 검출이기 때문에 배아에서 세포 유형의 이질 반드시이 기술의 응용 프로그램을 제한합니다. 그러나, 도중에 조직 특정 유전자 검사 또는 조직 특정 유전자 발현의 발병 다음 두 가지 이유 때문에 가능합니다. 첫째, 조직 구체적인 요인 immunoprecipitation 반드시 요소가 표현되는 세포 유형에서 염색질를 분리합니다. 둘째, coactivators 및 유전자 활성화와 관련된 포스트 translational 수정을 포함 histones의 immunoprecipitation은 유전자가되는 세포 유형의 유전자와 유전자의 규제 시퀀스에서 찾을 수 있어야하거나 활성화되었습니다. 이 기술은 대부분의 조직 특정 유전자 활성화 이벤트의 연구에 적용해야합니다.

예제는 아래에서 설명에서 우리는 골격근 특정 유전자 프로 모터에 바인딩 요소를 검토 E8.5과 E9.5 마우스 배아를 활용. 트렁크와 사지의 골격 근육이 형성하는 전구체 조직 아르 Somites는 E8.5 - 9.5 ^4,5에서 존재하고 있습니다. Myogenin는 골격 근육 차별 ^6-9에 필요한 규제 요소입니다. 데이터 myogenin가 E8.5과 E9.5의 배아 자체 발기인와 관련된 것을 보여줍니다. myogenin에만 개발 ^6,10이 단계에서 somites 표현이기 때문에, 데이터 자체 모터와 myogenin 상호 작용은 이미 E8.5 태아의 골격 근육 전구체 세포에서 발생한 것을 나타냅니다.

프로토콜

1. 태아의 분리

참고 : 마우스와 관련된 모든 작업이 적절한 동물 관리 및 사용 정책 및 프로토콜에 따라 수행되어야

1. 여성의 마우스의 짝짓기 플러그의 존재 짝짓기 후 아침 확인하고 다른 케이지에서 그들을 배치하여 스터드 남성에서 여성 성관계를 구분한다. 짝짓기 플러그가 관찰되는 그날 정오가 개발의 배아 일 0.5 (E0.5)로 간주됩니다.
2. E8.5에서 (또는 원하는 단계와 다를 경우), 승인된 프로토콜을 사용하여 마우스를 희생.
3. 70 % 에탄올로 euthanized 동물의 배를 습식과 복강을 엽니다. 개발 태아의 존재를 나타내는 주입 사이트는 각각의 자궁 호른 (그림 1A)의 길이를 따라 정렬 "문자열에 구슬"로 볼 수 있습니다. 가위를 사용하면, 두 자궁 뿔을를 제거 분리 개별적으로 주입 사이트를 잘라 (그림 1B)와 실내 온도 (RT)를 포함하는 100mm 배양 접시에 넣어 해부 매체 (DMEM 10 % 태아 소 혈청, 20 MM HEPES의 산도 7.4 60 μg / ML 페니실린, 스트렙토 마이신이 당연).
4. 포셉를 사용하여 자궁 (그림 1C)에서 각각의 배아 및 주변 세포막을 제거하고 신선한 해부 매체에서 그들을 놓으십시오.
5. 포셉를 사용하여 해부 현미경으로 각각의 배아를 분리. 개발이 단계에서, 태아는 정수리 난황, 연락처 deciduum 조직, 내장 난황과 양막합니다. 둘러싸인 양막은 태아와 직접 접촉에있는 투명한 막이다. 내장 난황은 양막과 정수리 부분 노른자의 색 사이에 위치하고 있으며 쉽게 배아를 육성 두드러진 혈관의 존재에 의해 E8.5 - E9.5의 배아에서 구별됩니다. 주변 점막에서 각 배아를 제거하고 여분의 혈액을 제거하기 위해 절개 미디어를 포함하는 새 접시에 개별적으로 전송할 수 있습니다. 발달 단계는 배아에서 배아와 새끼 사이 다를 수 있으며, 대표적인 E8.5 배아 및 대표 E9.5의 배아는 그림 1D 표시됩니다.
6. 해부 미디어 (앞의 4 단계에서 설명) 200 μl를 포함하는 1.5 ML eppendorf 튜브 각 배아를 전송합니다.

2. 절연 배의 균질화

1. 각 eppendorf 튜브에 200 UL의 볼륨 (DPBS 1X Dubbecco의 인산에 희석 살린 버퍼)에 Collagenase 유형 II의 20 단위를 추가합니다.
2. 부드럽게 20 분 100 rpm으로 37 ° C 통에 샘플을 흔들.
3. 세포의 대단히 짧은 시간을 혼란 pipetting으로 잘 Resuspend.
4. 1.5 ML eppendorf 튜브를 통해 위치 살균 셀 스트레이너 (40 μm의 메쉬 크기)의 위에 세포 현탁액을 적용합니다.
5. 즉시 분리를 완료 실온 셀 스트레이너 위에 1X DPBS 600 μl를 적용합니다. 스트레이너를 폐기하십시오.
6. 4 견본을 원심 분리기 ° C를 5 분 4,000 XG에.
7. 뜨는 폐기하십시오.
8. RT 1X의 DPBS 1 ML에서 펠렛을 Resuspend.
9. RT 1 분 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
10. 뜨는 폐기하십시오.
11. 알티 해부 미디어 200 μl의 펠렛을 Resuspend.
12. 배아 세포를 계산합니다. 평균 3-5 X 10 ⁶ cells/E8.5 배아가 있습니다.

3. 크로스 링크 염색질

1. 1 %의 포름 알데히드의 최종 농도에 대한 200 μl 샘플에 37 % 포름 알데히드 5.6 μl를 추가합니다.
2. RT 10 분 샘플을 품어.
3. 4 ° C 3 분 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
4. 뜨는 폐기하십시오.
5. 80 μl / ML 테아제 억제제 칵테일 (PIC)를 포함하는 차가운 1X DPBS와 세포 Resuspend.
6. 4 견본을 원심 분리기 ° C를 3 분 4,000 XG에.
7. 뜨는 폐기하십시오. 이 단계에서는 샘플 -80에서 얼어 수 있습니다 ° C. 냉동, 가교 샘플 몇 달 동안 안정합니다.

4. Sonication

1. RT SDS 용해 버퍼 (1 μl PIC/800 μl 전체 볼륨에서 갓 추가 PIC와 함께 50 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS) 100 μl의 세포 펠렛을 Resuspend. resuspended 경우, resuspension을 촉진하기 위해 RT SDS의 용해 버퍼의 추가 100 UL를 추가합니다. pipetting과 전도로 잘 섞는다.
2. 10 분 얼음에 세포 현탁액을 품어.
3. 200 사이 Diagenode Bioruptor를 사용하여 500 basepairs에 전단 DNA에 lysed 세포를 Sonicate ™ UCD200 (5 분 X 8 회 : 높음 (320w) 전원을 30 초 on/30 초의 진폭 설정 해제). 샘플은 얼음 슬러리 둘러싸여 있어야합니다. 샘플 4 ° C 이상의 따뜻한하거나 동결하는 것을 허용하지 않습니다. 사용 가능한 sonicators 많은 종류가 있습니다. Sonication 조건은 약 500 BP의 길이에 교차 연결된 DNA의 전단의 결과 각 sonicator에 최적화된해야합니다.
4. 4 sonicated 샘플을 원심 분리기 ° C, 10 분 14,000 XG에.
5. 티새로운 eppendorf 튜브 얼음 사전 냉각에 뜨는를 ransfer.
6. 5 aliquots 최대로 sonicated 샘플을 나누십시오. 우리는 경험적으로 한 E8.5 배아가 5 aliquots로 나눌 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 작은 또는 큰 샘플 크기는 적절하게 크기를 조정하실 수 있습니다. 이 단계에서는 샘플은 -80에 저장할 수 있습니다 ° C 이상 사용까지.
7. 상호 링크가 거꾸로 될 때까지 6 단계 -20 ° C에서 입력 및 저장소로 사용하기 위해 예약 한 나누어지는. 1 μl/800에서 갓 추가 PIC를 포함하는 칩 희석 버퍼 (16.7 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1.1 % 트리톤 X - 100, 167 MM NaCl 및 0.01 % SDS)에 10 배 다른 aliquots를 희석 μl 버퍼.

5. 사전 지우고 Immunoprecipitation

1. 연어 - 정자의 DNA / 단백질 4 또는 아가로 오스 G - 50 %의 슬러리 ° C, 회전, 1 시간을위한 75 μl 사전 명확 희석 뜨는. 또는 단백질 G 비즈가 칩을 사용하는 항체에 의해 결정되어야 하나 단백질 중 하나를 사용하십시오. 단백질 G 비즈가 염소 항체 드나 마우스 IgG 항체에 대한 ₁ 추천 반면, 예를 들면, 단백질 구슬은 토끼 항체 권장됩니다. 자세한 내용은 비드 제조 업체에 의해 만들어진 권장 사항을 참조하십시오.
2. 1 분에 대한 2500 XG 4 ° C에서 원심 분리기.
3. 새로운 사전 냉각 eppendorf 튜브에 뜨는를 전송합니다.
4. 사전 허가 나누어지는하는 항체 (4 μg / 샘플)을 추가하고 4 박 품어 ° C를 회전.

6. 염색질 단백질 - 비드 콤플렉스 워싱

1. ° C 회전 1 시간 4 각 유리병과 부화에 연어 정자는 DNA / 단백질 A 또는 G 아가로 오스 슬러리의 60 μl를 추가합니다. 위의 단계 3 미리 삭제에 사용되는 동일한 비드 유형을 사용합니다.
2. 1 분 1000 XG 4 ° C에서 원심 분리기.
3. 조심스럽게 뜨는을 제거하고 폐기. 얼음에서 DNA - 단백질 비드 복잡한 보관하십시오.
4. Resuspend과 같은 세척 버퍼 1, 2와 함께 아래의 감독 펠렛, 3, 4를 씻으십시오. 1-3 ° C가 이러한 버퍼와 세척이 4 수행해야 4 냉장되어야 버퍼 ° C. 와시 버퍼 4 실온에서 수행되어야 상온이 버퍼로 세척에 있어야 씻으십시오. 각 세차 적절한 온도에서 회전 5 분입니다. 4 ° C (세척 버퍼 네 세척을위한 실내 온도) 1 분 1000 XG에서 각 세척, 원심 분리기에 따라 다음 조심스럽게 대기음 또는 표면에 뜨는를 제거하십시오.

버퍼 1 : 낮은 소금 세척 버퍼 (20 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100
150 MM NaCl 및 0.1 % SDS), 1 ML X 2 씻는다.
버퍼 2 : 높은 염분 세척 버퍼 (20 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100
500 MM NaCl 및 0.1 % SDS), 1 ML X 2 씻는다.
버퍼 3 : LiCl 소금 세척 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % IGEPAL - CA630,
0.25 M LiCl과 1 % deoxycholic의 산성 (나트륨 소금)), 1 X 1 ML 씻으십시오.
버퍼 4 : TE 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 1 ML X 2 씻는다.

7. 염색질 - 항체 복합 용리

1. 신선한 용출 버퍼 (1 % SDS, 0.1 M NaHCO ₃₎ 250 μl에 씻어 염색질 단백질 - 비드 복잡한을 Resuspend. 다음 회전 15 분 RT에서 품어 5 초에 대해 적극적으로 소용돌이로 샘플을.
2. RT 1 분 2,500 XG에 원심 분리기 새로운 eppendorf 튜브에 eluate를 전송합니다.
3. 1 단계와 2 단계를 반복하고 같은 eppendorf 튜브에 eluates을 결합. eluates는 상온에서 보관해야합니다. 이 단계를 완료되면, eluates가 더 사용하기 전까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

8. 크로스 링크를 바꾸게되면 DNA를 복구

1. 500 μl eluate (입력 컨트롤을 40 μl / ML) 20 μl 5 M NaCl을 추가합니다.
2. ° C 하루 4 시간을위한 물 목욕 65에서 eluates을 가열.
3. 각 샘플 (입력 컨트롤 포함) 10 μl는 DNA 조각의 크기를 확인 0.1-1 kbp를 스패닝 크기 표시 옆에있는 2 % 아가로 오스 겔에서 실행할 수 있습니다. DNA는 얼룩으로 나타납니다 아닌 날카로운 밴드 것입니다. 샘플의 나머지는 65 남아 수 있습니다 ° C 젤가 실행되는 동안.
4. QIAquick 젤 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 각 시료에서 DNA를 복구합니다. QIAquick의 스핀 열의와 500 μl의 시료에 이소프로판올 200 μl의 실리카 막과 DNA 흡착을 최적화하기 위해 600 μl QG 버퍼를 (키트에 제공)을 추가합니다. QG 버퍼는 시료의 산도 쉽게 결정을 허용하는 산도 표시기가 포함되어 있습니다. 샘플의 색상은 보라색에 노란색에서 전환하는 경우 (산도> 7.5) 혼합 후, 시료와 혼합 3 M의 NaAcetate 10 μl (산도 5.2) 추가합니다. 이것은 열에있는 비즈에 바인딩 DNA를 극대화하기 위해 혼합물의 산도를 감소시킵니다.
5. 전에 칼럼을로드하는 모든 SDS의 침전물이 존재하는지 여부를 확인하기 위해 혼합물을 확인합니다. SDS 강수량이 발생한 경우에는 샘플로 예열한다42 ° C의 물 목욕 침전이 사라질 때까지.
6. QIAquick의 스핀 열 (키트에 보라색 열)로 혼합 700 μl를로드 1 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 삭제하고 샘플의 나머지와 함께이 단계를 반복합니다.
7. 열을 씻어 500 μl QG 버퍼를 추가합니다. 2 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 폐기하십시오.
8. 제조 업체의 지시에 따라 에탄올 것이 추가되었습니다하기 위해 PE 세척 버퍼 700 μl (키트에 공급)로 컬럼을 씻으십시오. 1 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 폐기하십시오.
9. 완전히 칼럼에서 PE 버퍼의 나머지 부분을 제거하기 위해 원심 분리 단계를 반복합니다. 을 통해 흐름과 수집 튜브를 폐기하십시오.
10. 60 μl EB 버퍼 (용출 버퍼 키트에서 제공)을 추가하여 새로운 eppendorf 튜브에 열을에서 Elute의 DNA.
11. 1 분 14,000 XG에 실온에서 원심 분리기. eluted DNA가 검출 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 복구 재료의 ₂₆₀ 신호는 일반적으로 나누어지는 당 ~ 6-7 UG 총 복구를 위해, 90-120 NG / UL의 농도를 나타냅니다. 그러나 이러한 샘플 _{280분의 260} 비율은 RNA의 예제에있다는 것을 제안, 일반적으로> 1.8입니다. 따라서 복구 DNA의 정확한 금액은 낮을 수 있습니다.

9. 복구된 DNA 분석

1. SDS는 PCR DNA 형성 촉매 효소의 활동을 방해할 수 있습니다. SDS는 PCR을 수행하기 전에 완전히 제거하여야한다. 1 분 14,000 XG 4에서 잔여 SDS와 원심 분리기 ° C을 촉진하기 위해 얼음에 DNA를 품어. 새로운 eppendorf tube.This 단계에 뜨는을 전송 것은 좋습니다.
2. DNA의 eluates은 기존의 PCR 또는 분석 각 시퀀스에 대한 구체적인 primers와 양적 실시간 PCR (Q - PCR)을 통해 검색하실 수 있습니다. 전체 DNA를 eluate 5-10 μl 한 PCR 또는 Q - PCR 반응에 사용할 수 있습니다. 입력 컨트롤 PCR은 다른 샘플의 크기와 비교하여 DNA의 5-10 배 희석과 함께 수행할 수 있습니다. PCR 및 Q - PCR 조건하지만, 다양, 시작 물질의 제한된 양을 추가 PCR 사이클이 필요합니다. 기존의 PCR 검출을 위해, 우리는 40주기 시작하며 필요에 따라 조정하는 것이 좋습니다.

10. 대표 결과

우리는 E8.5과 E9.5의 배아 (그림 2) 모두에서 칩을 수행하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 결과는 myogenin가 E8.5과 E9.5의 배아에서 myogenin 모터에 존재하는 것을 보여줍니다. 칩 정화의 DNAs은 기존의 PCR (그림 2A)와 양적 실시간 PCR (그림 2B)에 의해 분석되었다. 대조적으로, myogenin이 표현되지 않은 난황에서 myogenin 모터에 바인딩 myogenin의 징후가 없었다. 인터페론 - γ (IFNγ) myogenin 바인딩 사이트를 일치 시퀀스를 포함 발기인은, 부정적인 시퀀스 제어로 사용되었다. 예상했던대로, myogenin는 테스트를 조직 샘플의에서 IFNγ업자에 바인딩되지 않았습니다. 골격근에 엽 성의 전구 물질 있으며,, E8.5 9.5 배아에서 myogenin은 특히 somites ^(6,10 그림 3)에 표시됩니다. 따라서 결과는 myogenin가 E8.5과 E9.5에서 somites에 myogenin 모터에 바인딩된을 나타냅니다.

그림 1. E8.5 배아 해부. (A) 절연 자궁 호른 (상단 패널, 하단 패널에 표시 상위 확대). (B) 자궁 경적 개별 배아를 포함하는 개별 주입 사이트를 분리하는 가위로 잘라. (C) 공룡의 태아가 해부하는 동안 자궁에서 튀어나온. 화살표는 여전히 엑스트라 배아 조직의 적용 배아를 표시합니다. 같은 쓰레기에서 (D) 2 E8.5 배아. 왼쪽의 배아 선회하는 과정을 시작하지 않았습니다. 오른쪽에 배아가 돌고를 겪고 있습니다. 맨 오른쪽 - 대표 E9.5의 배아.

그림 2. 칩 분석은 E8.5과 E9.5의 배아에서 myogenin 모터에 바인딩 myogenin를 시연. myogenin 항체 또는 불특정 IgG가 전사의 시작 사이트를 -79에서 69 상대적으로 myogenin 모터의 일부를 증폭 primers로 수행된을 사용하여 칩 실험에서 정화 DNA의 5 UL의 (위) 기존의 PCR 분석되는 -12 또는 전사 시작 사이트의 ~ 1,075 BP 상류에 위치한 myogenin 바인딩 사이트를 일치하는 시퀀스를 포함하는 IFNγ 프로 모터의 일부를 증폭 primers에있는 myogenin 바인딩 사이트가 포함되어 있습니다. 사용 IFNγ의 프라이머 절차가 GAC TCA AGA CCC CGA GGC - 3 '와 5' - TGA GGA GGC TGG AGG AGG CC - 3'5' - GCT되었습니다. (A)에 사용되는 동일한 샘플 (아래) 정량 실시간 PCR 분석.표준 편차 - 데이터 입력 + /의 %로 꾸몄다 있습니다.

그림 3. Myogenin 특별히 E8.5과 E9.5의 태아의 somites에 표시됩니다. myogenin의 현장 하이브리드화의 전체 마운트 somites에서 특정 mRNA 표현을 보여줍니다. 200 μm의 - E8.5 이미지의 크기 바. E9.5 이미지 크기 모음 - 500 μm의.

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토론

설명 칩 프로토콜에서는, 우리는 myogenic 조절기 myogenin가 단일 E8.5과 E9.5의 배아에있는 골격근 전구체 조직에서 myogenin 모터와 관련된 것을 보여줍니다. 이전 연구는 광범위 ^11-20 타겟 유전자 규제 시퀀스의 관련 부분을 인코딩 체외 번역 또는 bacterially 생산 myogenin 및 radiolabeled DNA에 활용하여 체외 겔 이동 실험의 초기부터 시작 시퀀스를 포함하는 E 상자에 바인딩...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChIP Assay Kit	Upstate, Millipore	17-295
Collagenase Type II	Invitrogen	17101015	Dilution by 1 x PBS
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)	GIBCO, by Life Technologies	12100-061	High glucose content
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144	Calcium chloride free, Magnesium chloride free
Fetal bovine serum (FBS)	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Gel extraction kit	QIAquick	28704	50 reaction kit
Penicillin/streptomycin stock solution	GIBCO, by Life Technologies		5000 μg/ml concentration
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
Salmon sperm DNA /Protein A agarose	EMD Millipore	16-157
myogenin antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-576
Normal rabbit IgG	EMD Millipore	12-370
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
GoTaq Q-PCR master mix	Promega Corp.	A6001