입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

요약

광학 해상도 photoacoustic 현미경 (또는 - PAM)는 영상 광학 흡수 능력이 새로운 기술을 대조합니다 생체내에 셀룰러 해상도와 감도와 함께. 여기, 우리는 시스템 구성, 시스템 정렬을 포함 또는 - PAM의 실험 프로토콜에 시각 명령을 제공 전형 생체내에 실험 절차 및 기능 이미징 방식.

초록

세포와 organelle 수준에서 귀중한 통찰력을 제공하는 광학 현미경은, 널리 사용 생물 의학 기술로 인정되었습니다. 마찬가지로 생체내 (3 - D) 입체은 광학 현미경, 형광 ​​현미경 single-/multi-photon 및 광학 일관성의 tomography (OCT)는 각각 형광 및 광학 산란 대비하기 위해 특별한 감성을 입증의 mainstays. 그러나, 필수 생리 / 병리 학적 정보를 인코딩 생물 조직,의 광 흡수 대비는 아직 평가할 수있는가되지 않았습니다.

의생명 photoacoustics의 출현은 광학 방사선이 세포 ^1도 subcellular ² 수준 측면 해상도를 달성하기 위해 회절 한계에 초점을 맞추고 있습니다 광학 현미경 광학 해상도 photoacoustic 현미경 (OR - PAM) ^1의 새로운 지점되었다. 기존의 광학 현미경 기술에 대한 가치있는 보완으로, 또는 - PAM은 적어도 두 개의 보지 못하던 상품으로 제공합니다. 가장 중요한 첫 번째 AND, OR - PAM은 뛰어난 감도 (즉, 100 %)과 광학 흡수 대조를​​ 감지합니다. 형광 현미경 또는 광학 ³ - 산란 기반 ^10월 4일 (또는 모두) 또는 - PAM을 결합하는 것은 생물 학적 조직의 포괄적인 광학 특성을 제공합니다. 둘째, 또는 - PAM은 형광 현미경과 OCT에서 순수한 광학 프로세스와는 대조적으로, 음향 파도에 광학 흡수를 인코딩하고, 배경이없는 감지 기능을 제공합니다. OR - PAM의 음향 탐지 신호 저하에 대한 광 산란의 영향을 mitigates하고 자연스럽게 여기와 여기와 형광 스펙트럼 사이의 중복으로 인해 형광 현미경에서 일반적인 문제 탐지, 사이 가능한 interferences (즉, crosstalks)를 제거합니다.

광학 흡수 이미징에 대해 고유한, OR - PAM을 포함한 자사의 발명 이후 광범위한 생물 의학 응용 프로그램을 시연지만, 신경 ^{5, 6,} 안과 ^{7, 8,} 혈관 생물학 ^9, 피부과 ^10에 국한되지 않았습니다. 이 비디오에서는, 우리는 시스템 구성과 OR - PAM의 정렬뿐 아니라 생체내 기능 microvascular 이미징에 대한 실험 절차를 가르칩니다.

프로토콜

1. 시스템 구성

1. 광학 조사
   1. 광학 방사선 출처 : 고체 펄스 레이저 (INNOSLAB, Edgewave)과 염료 레이저 (CBR - D, 시라)을 펌핑 - 다이오드.
   2. 출력 레이저 빔을는 (펄스 폭 : 7 NS) (P50C, Thorlabs) 50 μm의 핀홀 통과하는 콘덴서 렌즈 (LA1131, Thorlabs)로 초점을 맞추고 있습니다.
   3. 핀홀은 효율적인 공간 필터링을위한 기본 모드 빔 직경 핀홀 직경과 일치하도록 콘덴서 렌즈의 초점에서 약간 떨어진 위치에 있습니다.
   4. 필터링된 빔은 단일 모드 광섬유 (P1 - 460A - FC - 2, Thorlabs)에 결합하여 다음 중립적인 밀도 필터 (NDC - 50C - 2M, Thorlabs) 및 의해 감쇠됩니다.
   5. 섬유 출력은 570 nm의 파장의 ~ 2.6 μm의의 회절 - 제한된 광학 초점을 달성하기위한 현미경의 목표의 뒤에 조리개 (RMS4X, Thorlabs)을 채웁니다.
2. 초음파 검출
   1. 초음파 트랜스 듀서 : 50 - MHz의 중심 주파수 (V214 - BB - RM, 올림푸스 - 뉴펀들랜드 서머 타임).
   2. 초음파 트랜스 듀서는 회절 - 제한된 광 조사로 coaxially 정렬 초음파 감지를위한 집에서 만든 음향 - 광학 빔 결합기 ¹¹ 첨부되어 있습니다.
   3. 구형 캐비티는 음향 렌즈를 생산하는 결합기의 바닥에서 지상이다. 이 음향 렌즈는 물에 0.5의 조리개 수치를 가지고 있으며 50 MHz의 중심 주파수에서 43 μm의의 음향 초점 직경을 제공합니다.
   4. 광학 및 음향 foci는 검출 감도를 극대화하기 위해 confocally 정렬됩니다.
3. 어쿠스틱 커플링
   1. 드라이 초음파 커플링은 초기 photoacoustic 이미징 시스템 ¹² 사용된 물의 실험 동물을 잠수함이 잠수 피하기 위해 고용됩니다.
   2. 이미지 창은 페트리 접시 (직경 9 ㎝)의 하단에 오픈하고 초음파 및 광학 투명 폴리에틸렌 막과 함께 밀봉합니다.
   3. 폴리에틸렌 막과 몇 군데 커플 빠져들 OR - PAM 영상 머리에 페트리 접시에 페트리 접시에 객체로부터 생성된 photoacoustic 파도, 그리고 탈이온수 더 커플 물결로 객체 사이의 초음파 젤 (클리어 이미지, SonoTech) .
4. 전자 공학
   1. 초음파 변환기에 의해 감지 photoacoustic 신호는 두 종속 증폭기 (ZFL 500LN, 미니 회로)에 의해 증폭됩니다
   2. 증폭된 신호는 200 MS / s의의 샘플링 속도에서 14 비트 데이터 수집 (DAQ) 보드 (CompuScope 14200, 게이지 응용 과학)에 의해 디지털이다
5. 계획을 스캔
   1. 래스터는 수평 (XY) 비행기 따라 또는 - PAM 이미징 머리 스캔 (2 - D) 2 차원은 DAQ 보드와 펌프 레이저를 모두 실행 개인용 컴퓨터에 의해 제어됩니다. 트리거 신호는 DAQ 보드에서 클럭 출력 신호와 동기화됩니다.
   2. 2 - D 스캐너의 빠른 축이 교차 단면 스캔 (B - 스캔)의 방향으로 정의됩니다.
   3. B - 스캔 이미지의 순서가 직접 3 - D 렌더링이나 2 - D 최대 진폭 투영 (MAP) 이미지 중 볼 수있는 용적 이미지를 형성 속도가 느린 축을 따라 이미징 머리를 번역 인수 수 .

2. 시스템 정렬

1. 음향 초점 비행기의 위치 (즉, 최대 펄스 반향 초음파 신호에 트리거 신호의 시간 지연)를 확인하는 펄스 에코 초음파와 초음파 반사경을 사용합니다. 이 단계는 OR - PAM 시스템을 구축할 때 한 번만 수행하는 데 필요합니다.
2. 단일 모드 광섬유의 결합 효율을 극대화할 수 있습니다.
3. 광학 흡수 객체 (예, 검정 테이프의 일부)의 상단에 초음파 젤을 적용하고 부드럽게 탈이온수 가득 페트리 접시에서 이미지 창 아래에 첨부해 주시기 바랍니다.
4. 물에 이미징 머리를 조아리고, 그리고 음향 렌즈 아래에 갇혀있는 공기 방울을 제거하십시오.
5. 흡수 개체의 photoacoustic 신호가 음향 지연에서 재판받을 수있는 어쿠스틱 초점 비행기에서까지 이미징 머리를 조정합니다.
6. 플랫 객체로부터 생성된 photoacoustic 신호의 진폭을 극대화하기 위해 현미경 목표의 수직 위치 (즉, Z 위치)을 조정합니다. 최대 신호 진폭은 광학 초점이 수직 방향으로 음향 초점을 정렬하는 것이 좋습니다.
7. 대상에서 생성된 photoacoustic 신호가 대칭 패턴을 보여줍니다 때까지 현미경 목표의 수평 위치 (즉, x와 y 위치)를 조정할 수 있습니다. 대칭은 광학 초점이 수평 방향으로 음향 초점을 정렬하는 것이 좋습니다.
8. photoacoustic 신호가 대칭과 진폭 모두에서 최적화 때까지 단계 2.6 및 2.7을 반복합니다.

3. SA mple 실험 절차 인 생체내 또는 - PAM 마우스 귀 vasculature의

1. 이 단계는 누드 마우스가 필요하지 않습니다. 칵테일의 intraperitoneal 주사 [:; : 0.1 ml/10 g 투여 1 ML 케타민 (100 MG / ML), 0.1 ML xylazine (100 MG / ML) 및 8.9 ML의 생리 조리법과 동물을 마취. 귀에의 머리를 면도하고, 추가로 Surgi 크림 (카테고리 # : 82565, 미국 국제 산업)와 잔류 머리를 털을 뽑다 탈이온수 그것을 청소하기 전에. 이러한 이신가요 약간 피부 vasculature을 짜증나게 수 있으므로 가장 계획된 실험 전 24 시간 수행합니다.
2. photoacoustic 레이저 시스템 켜고, 그리고 시스템 정렬을 확인하십시오.
3. 흡입 가스 (전형적인 유량은 동물의 체중에 따라 1.0-1.5 L / 분)을하여 isoflurane 3 % 증발로 마우스를 마취하고, 실험을 통해 isoflurane 1%로 마취를 유지합니다. 의료 수준의 공기는 정상적인 생리 상태에서 마우스를 유지하기 위해 흡입 가스로 권장합니다.
4. stereotactic 단계로 마우스를 전송하고, 난방 패드와 37의 체온 ° C을 제어합니다.
5. 플라스틱 접시에 마우스 귀를 평평하고 귀 위에 초음파 젤의 레이어를 적용합니다. 겔 내부에 기포를 트래핑하지 마십시오. 그런 다음, 이미지 창 아래에 귀를 장소 천천히 초음파 겔 연락처 폴리에틸렌 막의 아래쪽까지 동물의 무대를 올립니다. 멤브레인에 대한 귀를 누르면 귀에 혈액 흐름에 영향을 미칠 수 있기 때문에 소프트에 문의가 필요합니다.
6. 의 생리 상태를 모니터링하기 위해 마우스 다리 꼬리에 펄스 산소 농도계를 클램프하고, 건조하고 마우스 눈 실수로 레이저 손상을 방지하기 위해 눈 연고를 적용할 수 있습니다.
7. 음향 렌즈 탈이온수에 잠겨 때까지 이미징 머리를 조아리고, 그리고 음향 렌즈 아래에 갇혀있는 공기 방울을 제거하십시오.
8. 그것이 미국 국립 표준 연구소 ¹³ 레이저 안전 기준 내에 있는지 확인하기 위해 레이저 fluence를 확인합니다. 레이저 fluence은 레이저 빔을가 피부 표면 아래 150 μm의에 초점을 맞추고 있습니다 레이저 펄스 에너지의 80 뉴저지로 변환 20 MJ / cm ^2를 넘지 않아야합니다.
9. 외부 - 트리거 모드로 레이저를 설정하고 시험 검사를 시작합니다. 강한 photoacoustic 신호가 음향 초점 비행기에서까지 이미징 헤드의 Z 위치를 조정합니다.
10. 정확한 검색 매개 변수를 설정하고 공식적인 이미지 수집을 시작합니다.
11. 실험 후, 레이저를 해제 탈이온수의 이미징 머리를 들어, 마우스를 출시하기 위해 동물 단계 낮은, 탈이온수와 마우스 귀를 청소, 마취 시스템과 온도 컨트롤러를 해제하고, 마우스를 언로 드 stereotactic 단계에서.
12. 반복적인 이미지가 필요한 경우, 37에서 설정된 환경 온도 ° C.있는 인큐베이터에 마우스를 올려 그것이 자연스럽게 깨어나면 후 동물 시설에 마우스를 반환합니다. 그렇지 않으면, euthanatize과 유기 동물 프로토콜을 따르십시오.

4. 기능 또는 - PAM 총 농도와 헤모글로빈의 산소 포화도의

1. Oxyhemoglobin (HBO ₂₎ deoxyhemoglobin은 (HBR) 헤모글로빈의 두 가지 주요 형태, 가시 스펙트럼 범위의 지배 내생 photoacoustic 소스입니다. HBO ₂ HBR는 별개의 광 흡수 스펙트럼을 가지고 있으며 따라서 spectrally 총 농도 (HbT) 및 혈색소 ⁵ 산소 포화도 (SO _2)을 모두 수치 구분하실 수 있습니다. 이렇게 _두 측정 적절한 광학 파장을 선택할 수 있도록이 지침은 다음과 같습니다
2. 파장은 충분한 신호 대 잡음 비율과 적절한 침투력을 보장하기 위해 헤모글로빈 흡수 스펙트럼 (즉, 550-600 nm의)의 Q - 밴드 내에서 선택되어야합니다.
3. HBO ₂ HBR의 흡수 계수가 발음 차이를 (예 : HBR - 561 nm의 지배와 HBO ₂ 지배적 578 NM)가 파장을 권장하고 있습니다.

그런데 ₂ 게다가, HbT가 추가로 계산할 수 [HBR] 및 [HBO _2] 함께 또는 직접 헤모글로빈의 어금니 흡광 계수 스펙트럼 (예 : 530 NM, 545 NM, 570 nm의, 그리고 isosbestic 파장에서 측정할 수 HBR와 HBO ₂ 동등 어금니 흡광 계수를 584 nm의) ^14.

5. 대표 결과 :

듀얼 파장 (561 nm의 및 570) 또는 - PAM에 의해 몇 군데 살아있는 누드 마우스 귀의 혈관 해부학 그리고 _2는 그림 1에 표시됩니다. ~ 80 분입니다; 관심이 같은 지역의 ₂ 측정 (2.5 μm의 X 5 μm의 스텝 크기를 10mm X 10mm 이미지 크기)는 SO 듀얼 ​​파장에 대한 전형적인 이미지 수집 시간.

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그림 1. 생체내 광학 해상도 photoacoustic 현미경에서. 혈관 해부를 (570 NM에서 인수) 표시 (A) 총 헤모글로빈 농도 및 누드 마우스 귀 뒤에 (B) 헤모글로빈의 산소 포화도 (561 NM 및 570 nm의에 인수)의 맵 이미지. (C) 클로즈업 패널의 박스 영역 (A)의. 패널에서 규모 막대 (A)는 모두 (A)에 적용되며 (B).

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토론

이 비디오에서는, 우리는 시스템 구성, 시스템 정렬하고, 전형적인 실험 절차를 포함 또는 - PAM의 실험 프로토콜에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 라벨 - 무료 비침 투 또는 - PAM은 단일 모세 기준 microvascular 기능 및 대사 연구를 활성화시키고 엑기스 관련 생리와 병리에 대한 우리의 이해를 확장 가능성을 가지고있다. Microphotoacoustics 현재이 또는 - PAM 시스템을 생산합니다.

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자료