성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

요약

쥐의 간 세포의 주요 문화 macrophages를 얻을 소설 방법을 설명합니다. 이 방법은 플라스틱 요리 선택적 첨부하여 문화 flasks 및 정화의 흔들림 다음 문화 macrophages의 확산을 활용합니다. 이 기술은 효율적으로 복잡한 장비와 기술없이 간 macrophages을 제공합니다.

초록

Kupffer 세포가 간 특정 주민 macrophages이며, ^1-3 간의 생리와 병리 학적 기능에 중요한 역할을한다. 간 macrophages의 절연 방법 ^4-6 잘 설명하고 있지만, 이러한 방법의 대부분은 이러한 원심 elutriator 및 기술 능력 등 정교한 장비가 필요합니다. 여기, 우리는 간략하게 구조 그림 1에 설명된 성인 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화에서 충분한 번호 및 순도에 간 macrophages을 얻기 위해 소설 방법을 제공합니다.

2 단계 재관류 방법 ^7,8하여 간 세포의 분리 후, 대부분 parenchymal hepatocytes 구성된 분수가 준비하고 DMEM와 10 %의 FCS.Parenchymal hepatocytes 구성된 문화 매체와 T75 조직 문화 flasks에 씨앗을 품고 것은 상피 세포의 형태를 잃게 문화의 몇 일 이내에, 타락한 또는 fibroblast 같은 세포 (그림 2)로 변환. 로 문화의 날 6 주위 진행, 위상 대조 - 밝고 둥근 대식 세포와 같은 세포 (그림 2) fibroblastic 세포 시트에 분아 따위에 의해 번식을 시작합니다. 대식 세포와 같은 세포의 성장은 술병의 표면에있는 세포 시트를 덮고, 계속 일 1,200 최대 수준에 도달. 문화 flasks의 흔들림으로, macrophages는 즉시 문화 매체로 중단됩니다. 와 같은 다른 오염 세포가 정지 상태 macrophages의 선택 접착에 플라스틱 접시 결과의 후속 전송 및 짧은 부화 (그림 3). PBS 여러 rinses 후, 첨부된 macrophages은 수확하고 있습니다. 이상 10 ⁶ 세포는 두 개 이상의 주 (그림 3) 2-3일 간격으로 동일한 T75 조직 문화 플라스크에서 반복적으로 수확 수 있습니다.하거나 유동세포계측법에 의해 평가로 격리 macrophages의 purities은 95~99%되었습니다 쥐 대식 세포 특정 항체 (그림 4)와 immunocytochemistry가. 고립된 세포는 LPS로 자극하고, 형성시 polystylene 비즈의 적극적인 phagocytosis (그림 5), 재조합 GM - CSF에 proliferative 반응, 염증 / 안티 - 염증성 크린 시토킨의 분비를 보여 multinucleated 거대 세포 ^9.

결론적으로, 우리는 방법이 다른 포유 동물 종에 적용있을 복잡한 장비 및 skills.This없이 충분한 번호 및 순도에 간 macrophages를 얻을 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

프로토콜

1. 간의 재관류

1. 나트륨 pentobarbital 용액 (50 MG 나트륨 pentobarbital / kg 체중)의 intraperitoneal 주사로, 성인 남자 스프 라그 - 돌리 쥐 (몸 무게 1백50-2백그램 주 된 10-15에서) 마취.
2. 스테인리스 냄비에 동물을 장소와 복부 및 흉부에 70 % 에탄올을 스프레이.
3. 피부에서 작은 잘라 껍질을 확인하십시오. 가위로 절단하여 복부를 엽니다.
4. 포털 정맥의 위치를​​ 확인 포탈 정맥과 느슨하게 클럼프 아래 수술 스레드를 전달합니다.
5. 클럼프 하부 베나의 정맥과 간으로 혈액 역류를 방지하기 위해 정맥 mesenteric의 말초 부분을. 가위로 다이어프램을 절단하여 흉강을 열고 심장을 노출.
6. 포털 정맥에 플라스틱 카테 테르 (2mm 직경)를 삽입하고 단단히 카테터 주변의 스레드를 조입니다.
7. 37 prewarmed ° C.; 세척 용액 (pH는 7.2 칼슘 ^{2 +} - MG ^{2 +} 0.5 MM EGTA, 10 MM의 HEPES 및 4.2 MM NaHCO _3가 포함된 무료 HBSS)이 탑재되는 재관류 시스템에 카테터를 연결
8. 10 ML / 분 속도로 현장에서 재관류를 시작합니다. 동시에, 오른쪽 아트리움 벽에 상처를합니다. 10 분 재관류를 계속합니다.
9. collagenase 솔루션 재관류 솔루션을 스위치 [유형 보충 10mM HEPES 및 4.2mM NaHCO _3가 포함된 HBSS I collagenase (0.05 %)과 트립신 억제제 (50 μg / ML), 산도 7.5] 10, 그리고 perfuse - 속도로 20 분 10 ML / 분 간 약간 부풀 및 장액의 막 아래에있는 간 구조의 붕괴에 대한 기호를 표시하기 전까지.

2. Parenchymal Hepatocyte 풍부한 세포 분획의 준비

1. 제거하고 신중하게 collagenase 솔루션 25 ML을 포함하는 멸균 비커에 간 전송. 가위로 작은 조각으로 말하다.
2. 결과 세포 현탁액에 감기 멤의 75 ML을 추가합니다. 부드러운 pipetting 후, 여과수는 셀 스트레이너 (100 μm의)를 통해 결합 조직 및 소화되지 않은 조직 파편을 제거합니다.
3. 4 ° C (브레이크 해제)에서 1 분 50 XG 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 여과물을 전송합니다.
4. 조심스럽게 뜨는 폐기하십시오. 감기 멤와 펠렛을 Resuspend.
5. )을 세 번 2.4 반복합니다.

3. 간세포의 혼합 차 문화

1. DMEM가에 100 μm의 β - 메르 캅 토 에탄올, 10 μg / ML 인슐린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신과 100 U / ML 페니실린, 그리고 씨앗과 보충 10% 열을 inactivated FCS를 포함 구성된 성장 매체 2.5에서 얻어진 세포)를 일시 중지 6.7 X 10 ⁴ 세포 / cm ² (중간 5 X 10 ⁶ 세포 / 술병 / 12 -15 ML)의 밀도에 : 5-10 조직 문화 flasks ^(75cm이 표면적).
2. 문화에게 flasksat 37 품어 ° 5% CO ₂ 분위기에서 C - 95 %의 공기.
3. 성장 매체마다 2~3일 간격을 바꾸십시오.

4. Macrophages의 선택적 분리

1. 문화 12 일 후에, macrophages의 세포 시트에 분아 따위에 의해 번식. 이러한 세포가 80 문화 flasks의 흔들어 상호에 의해 정지 아르 - 30 분 분당 120 스트로크를 37 ° C.
2. 100mm 이외의 조직 문화 학년 플라스틱 접시에 배지를 전송합니다. 한 플라스틱 접시 두개의 T75 flasks에서 매체를 풀. 성장 매체와 함께 리필 문화 flasks는 배양기로 돌아갑니다.
3. 37 30 분 플라스틱 요리를 품어 ° 5 % CO ₂ 분위기에서 C - 95 %의 공기. 다른 오염 세포 안 반면 Macrophages은 쉽게이 부화 과정에 따라 이외의 조직 문화 등급 플라스틱 요리에 첨부합니다.
4. 매체 대기음 부드럽게 PBS로 플라스틱 접시를 씻어. 이 단계를 세 번 반복합니다.
5. 그릇에 TrypLE 익스프레스 솔루션 1 ML을 추가하고 37 10 분에 대해 품어 ° 5 % CO ₂ 분위기에서 C - 95 %의 공기.
6. 성장 매체 9 ML을 추가합니다. 부드럽게 세포 스크레이퍼에 의해 연결된 macrophages를 다쳤어요.
7. ° C (브레이크)를 25 5 분 180 XG에 15 ML 원뿔 관과 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다.
8. 뜨는을 취소하고 성장 매체 1 ML를 추가합니다. 활발한 pipetting하여 단일 세포로 분열시키다. hemocytometer - 계산하여 휴대폰 번호를 열거합니다.
9. 절연 단계는 두 개 이상의 주 2~3일 간격으로 같은 문화 flasks와 반복 수 있습니다.
10. 절연 macrophages는 3.1에서 설명한 성장 매체 교양 수 있습니다.

5. 대표 결과

성인 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화의 예제는 그림 2에 표시됩니다. Parenchymal hepatocytes 문화에 몇 일 이내에 상피 세포의 형태를 잃고, 타락한 또는 fibroblast 같은 세포로 변환.그렇다면, 하루 종일 6-12, 위상은 반대로 밝은 둥근 대식 세포와 같은 세포가 vigourouly fibroblastic 세포 시트에 분아 따위에 의해 번식. 문화 flasks의 흔들림으로, macrophages는 즉시 문화 매체에 정지하고 있으며, 플라스틱 요리 후속 전송과 부화는 macrophages의 선택적 유착 (그림 3)의 결과. 대식 세포와 같은 세포는 일 8로 일찍 수확하고, 숫자 12-14일에 최대한의 수준에 도달하실 수 있습니다. 이상 10 ⁶ 세포는 10 ⁷ T75 당 문화 플라스크 (그림 3) 플라스크 당 총 세포 수율을 활성화, 2 주 이상 2 ~ 3 일 간격으로 반복 T75 문화 플라스크에서 수확 수 있습니다. 절연 macrophages의 purities은 같은 ED - 1 (그림 4), ED - 3, OX - 41 (그림 4)와 Iba1 ^9.로서 쥐 대식 세포 특정 항체와 flowcytometry 또는 immunocytochemistry에 의해 평가 95~99% 였는데 고립된 세포는 polystylene 비즈의 적극적인 phagocytosis (그림 5), 재조합 GM - CSF, LPS로 자극하고, multinucleated 거대한 세포 ^구 형성에 염증 / 안티 - 염증성 크린 시토킨의 분비에 proliferative 응답으로 macrophages의 전형적인 특성을 보여줍니다.

그림 1. 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화에서 대식 세포와 같은 세포의 선택적 분리 및 정화를위한 계획.

그림 2. 쥐의 간 세포와 대식 세포와 같은 세포의 확산의 주요 문화. 화살표 multinuclear 거대한 세포를 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm의. Elsevier의 허가를 면역 방법의 논문집, Vol.360, 47-55 (2010) ⁹ Reprinted.

그림 3. 떨고 첨부 방법으로 대식 세포와 같은 세포의 선택적 분리. 세포는 flasks를 흔들어하여 문화 매체에 정지 이후이 아닌 조직 문화 학년 플라스틱 접시에 양도하고, 37 ° C.에 incubated했다 도금 후 빠르면 10 분, 기타 오염 fibroblastic 세포가 정지 유지하면서, 접시 표면에 부착된 대식 세포와 같은 세포. PBS로 rinsing 후, 매우 정제된 세포 대식 세포의 인구는 얻은 것입니다. 이러한 세포는 문화의 40 분 이후에 전형적인 대식 세포의 형태를 얻고, 그리고 mitotic 세포는 자주 (화살표) 관찰되었다. 다른 문화의 시대에 flasks에서 발견한 세포 숫자의 후속 변경 내용이 표시됩니다. 값은 3 ~ 5 flasks에 평균 ± SD 있습니다. 실험은 세 번 반복되었으며 데이터를 다른 기호로 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm의. Elsevier의 허가를 면역 방법의 논문집, Vol.360, 47-55 (2010) ⁹ Reprinted.

그림 4. 쥐의 단클론 항체에 대한 macrophages와 대식 세포와 같은 세포 Immunocytochemical 염색법.

그림 5. 대식 세포와 같은 세포 FITC - 라벨 microbeads의 Phagocytosis.

토론

여기, 우리는 성인 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화에서 macrophages를 얻을 간단하고 효율적인 방법을보고합니다. 우리의 방법은 쥐 간 세포의 혼합 문화 macrophages의 소설 proliferative 활동에 첫번째 의존하고 macrophages ^{9으로서의} 생물 학적 특성을 바탕으로 이러한 세포의 후속 분리 및 정화. 그것은 성인 간 세포의 혼합 차 문화의 확산 macrophages는 Kupffer 또는 parenchymal hepatocytes 분율로 오염과 관련된 세포에서 유래있을 수도 있습니다. macrophages는 혼합 차 문화에 parenchymal hepatocyte ¹⁰ 기타 fibroblastic 세포의 변화로 인해 특정 환경 변화에 대응 할 수도 있습니다.

결론적으로, 우리의 방법은 정교한 장비와 기술을 사용하여 쥐의 간 cellswithout의 주요 문화 충분한 번호 및 순도의 대식 세포와 같은 세포의 격리를 제공합니다. 또한, 절연 절차는 두 개 이상의 주 같은 문화 플라스크와 반복 수 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물 종에 적용할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
나트륨 pentobarbital 용액	교리쓰 Seiyaku	Somnopentyl 사출
행크의 균형 소금 용액 (HBSS)	Invitrogen	14185-052
에틸렌 글리콜 tetraacetic 산 (EGTA)	시그마 - 알드리치	E - 4378
Collagenase	와코 순수 화학 공업 (주)	032-10534	세포 분리 학년 (롯 확인 필요)
트립신 억제제	시그마 - 알드리치	T - 9128
이글의 최소 필수 중간 (멤)	시그마 - 알드리치	M - 4655
Dulbecco이 수정의 이글의 중간 (DMEM)	시그마 - 알드리치	D - 6459	포도당 - 타입 하이
소태아 혈청 (FCS)	HyClone	SH30070.03	열 ° C 30 분 56 inactivated. (롯 확인 필요)
TrypLE 익스프레스	Invitrogen	12,605
Dulbecco의 인산염은 버퍼링 호수 (PBS)	Invitrogen	14,190	CA 2 + - MG 2 + 무료
β - 메르 캅 토 에탄올	시그마 - 알드리치	M - 7522	주식 : 증류수 100 MM
인슐린	시그마 - 알드리치	I - 5500	주식 : 0.1N HCL 10 MG / ML
페니실린 / 스트렙토 마이신	Invitrogen	15,070
셀 스트레이너	BD Biosciences	352360	메쉬 크기 : 100 μm의
조직 문화 플라스크	스미토모 Bakelite (주)	MS - 21250	표면적 : 75cm 2
비 - 조직 문화 플라스틱 요리	BD Biosciences	351005
셀 스크레이퍼	코닝 주식 회사	3010
상호 흔드는	TAITEC	NR - 1