중간 대뇌 동맥 폐색의 마우스 모델

요약

우리는 비디오 intraluminal monofilament를 사용하여 성인 마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색을 생산하는 방법을 보여줍니다. 또한 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC) 염색법에 의해 대뇌 경색의 범위를 평가하는 방법을 보여줍니다.

초록

뇌졸중은 미국 ¹ 가장 흔한 치명적인 신경 질환입니다. 두뇌에있는 혈관의 막힘 (허혈성 뇌졸중) ² 스트로크의 대부분 (88 %) 결과. 대부분의 허혈성 뇌졸중 (~ 80 %) 중간 대뇌 동맥 (MCA) ^3의 영토 발생 이후 개발된 많은 동물 스트로크 모델이 동맥에 집중했습니다. 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)의 intraluminal monofilament 모델은 외부 경동맥 동맥에 수술 필라멘트의 삽입과 팁은 MCA의 출처를 occludes 때까지 정지 그 결과, 내부 경동맥의 동맥 (ICA)에 기대를 스레딩을 포함 혈액 흐름과 MCA 테리토리 ⁴ 이후 뇌 경색의. 기술은 영구적인 또는 일시적인 폐색 ⁵ 모델하는 데 사용할 수 있습니다. 봉합사가 특정 간격 (30 분, 1 H, 2 H) 후 제거하면, reperfusion는 (일시적 MCAO) 이루어집니다, 필라멘트가 자리에 남아있다면 (24 H) 절차는 영구 MCAO의 모델로 적합합니다 . 이 기술은 craniectomy, intracranial 압력 및 온도 ^6에 영향을 미칠 수있는 두개골의 일부를 제거하는 neurosurgical 절차를 필요로하지 않습니다. 그것은 쥐 및 생쥐 ^7,8에 영구와 일시적인 대뇌 국소 빈혈 초점을 모방하는 데 가장 자주 사용되는 방법이되었습니다. 대뇌 경색의 범위를 평가하기 위해, 우리는 허혈성 뇌 조직 ⁹ 식별 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC)와 뇌 조각 얼룩. 이 비디오에서는, 우리는 MCAO 방법과 TTC의 얼룩에 의해 경색 크기의 결정을 보여줍니다.

프로토콜

1. MCAO 방법

이 프로토콜은 실험 동물의 사용을위한 건강 지침 국립 연구소에 의해 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 UCSF와 켄트 주립 대학에서, 그리고 abides에 의해 승인되었습니다.

1. 20mm 세그먼트에 5-0 monofilament의 봉합을 (하버드 장치, 홀리스튼, MA) 잘라. cauterizer (브레인 트리 과학 주식 회사, 브레인 트리, MA) 근처 가열하여 각 세그먼트의 팁을 라운드. 마이크로 미터 (응용 이미지 주식, 로체스터, NY)를 사용하여 팁의 직경을 측정합니다. 우리는 25-30 G.의 체중을 가진 마우스에 대한 0.21-0.22 mm의 최종 팁 직경과 봉합을 사용하여
2. autoclaving (최소 121 ° C, 15 분 15 PSI).하여 모든 수술 도구를 소독 70 % 에탄올을 사용하여 수술 테이블 및 관련 장비를 살균하십시오.
3. 와 8~12주 된 마우스 (25-30그램) 마취 5% 30% O ₂ /에서 (Aerrane, 백스터, 디어 필드, IL) isoflurane 70% N V - 10 아나스타샤 시스템을 사용 ₂ O (VetEquip, Inc의 ., 플레즌턴, CA). 마취의 유도에 따라, isoflurane의 수준을 줄이고 1.5 %에 그것을 유지합니다.
4. 가열 패드에있는 위로 향한 위치에 마우스를 놓습니다. 직장 프로브를 삽입하고, 36.5-37.5 사이의 체온 ° C를 사용하여 TR - 200 homeothermic 온도 시스템 (좋은 과학 도구 주식 회사, 포스터 시티, CA).을 모니터링하고 유지
5. 피부를 노출 전기 면도기 (브레인 트리 과학)와 복부 목 지역에있는 모피를 면도. 70 % 에탄올 세 응용 프로그램을 사용하여 외과 사이트를 소독.
6. 스테레오 해부 현미경 (니콘, 일본), 목을 1cm 길이 정중선 절개를합니다. 외과 분야를 노출하고 오른쪽 일반적인 경동맥 (CCA), 외부 경동맥의 동맥 (ECA), 그리고 내부 경동맥의 동맥 (ICA)을 식별 견인기 (브레인 트리 과학)를 사용하십시오. 조심스럽게 신경 및 근막 주변에서 무료로 동맥을 해부하다.
7. 추가 distally ECA를 해부하다 및 바이폴라 coagulator (하워드 악기 주식 회사, 터스칼루사, AL)를 사용하여 ECA와 뛰어난 갑상선 동맥 (STA) 지점을 응고. coagulated 세그먼트에서 ECA와 STA 컷.
8. 대충 ECA 스텀프 통해 두 8-0 실크 봉합을 묶어. ECA와 ICA에 CCA의 분기점에서 혈관 클램프 (파인 과학 도구)을 적용합니다.
9. Vannas 스타일 스프링 가위 (파인 과학 도구)와 ECA 유세의 끝부분에 작은 절개를합니다. 측정과 끝에 둥글게 5-0 monofilament의 봉합의 길이를 기록합니다. 절개로 봉합를 삽입하고 클램프에 미리. 충분히 인 주거 monofilament의 봉합의 이동성을 확보 아직 보존 루멘 주위 두 실크 봉합를 조이십시오.
10. 분기점에서 클램프를 제거합니다. 부드럽게 MCA의 출처를 막다하기 위해 CCA의 분기점 넘어 90~10밀리미터의 거리에 대한 ICA에 ECA의 루멘에서 monofilament의 치료를 사전. 수술 기간은 30-45 분 정도입니다.
11. 목에 절개를 봉합하고 마취에서 회복하고, 우리를 그것을 반환하는 35 ° C 간호 상자에서 마우스를 놓으십시오. 그것은 일반적으로 마취에서 회복하기 위해 생쥐를 위해 50-10 분 정도 소요됩니다. 과도 MCAO를 수행하려면, 연구자들은, 보통 사이 0.5-2 H.에 마우스를 다시 마취하고 일정 기간 후 ECA의 선거 유세에 다시 봉합을 인출할 수
12. 스물 네 시간 MCAO의 유도 후 5 % isoflurane으로 마우스를 마취하고 경추 탈구하여 안락사. 마우스를 참살하고 두뇌를 수집합니다. 얼음 두뇌 매트릭스 (브레인 트리 과학)과 사 2 mm 슬라이스로 coronally 머리를 슬라이스. 2퍼센트의 뇌 조각 실온에서 20 분 1X PBS에서 2,3,5 - triphenyltetrazolium은 염화물 (TTC) (시그마 - 알드리치) 경색의 크기와 범위를 결정하는 부화. 이미징 때까지 중립은 4 포르말린 솔루션 (시그마 - 알드리치) 버퍼 10 % 뇌 조각 ° C를 수정. 조브 프로토콜 955 (에서 설명한대로 경색의 범위는 계량 수 https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) ^9.

2. 대표 결과

MCAO에 의해 생성된 infarcts는 striatum과 dorsolateral 피질에서 볼 수 있습니다. striatum는 대뇌 피질보다 국소 빈혈에 더 민감합니다. MCAO 이상의 시간의 간격 striatum, 피질 모두를 손상시킬 수있는 동안 MCAO 서른 분 거리에 있으며, 단지 striatum의 경색을 생산합니다. 24 H 영구 MCAO 후, 총 경색의 비율은 40 ~ ± 수술 후 북반구와 사망률의 5 % ~ 10 %입니다. 과도한 출혈 수술하는 동안 발생하면 우리는 더 연구에서 생쥐를 제외, 수술 시간이 90 분 초과, 생쥐는 15 분 이내에 마취에서 회복하기 위해 실패하거나, 출혈이 뇌 조각 또는 사후 심사 중에 윌리스의 원안의 기본에서 찾을 수 있습니다 .

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영구 MCAO 24 H 후 TTC - 스테인드 뇌 조각의 그림 1. 대표 이미지 (코로나 레벨 1-4). 괴사 영역에서 이러한 효소 활동의 부재로 인해 흰색 남아 살아있는 동안에 조직 TTC는 효소, 색상에 빨간색 1,3,5 - triphenylformazan (TPF)에 dehydrogenases에 의해 감소​​됩니다. 따라서, 경색의 지역 TPF에 TTC의 변환의 부족은 백색으로 확인할 수 있습니다. 참고 : TT​​C는 다소 열 등 열과 최대한 빛으로부터 스테인드 섹션을 보호 불안정 조명입니다.

토론

생쥐의 MCAO는 일반적으로 인간에 초점 뇌 국소 빈혈을 모델로 사용됩니다. 뇌졸중 연구 생쥐를 사용하기 때문에 유전자 변형 및 녹아웃 종자의 가용성을 더 자주되었다. 프로토콜 참고로 몇 가지 중요한 세부 사항이 있습니다 :

1. 그것은 수술하는 동안 마우스 체온을 유지하기 위해 필수적이며, 그것은 완전히 마취에서 회복하기 전에. 체온이 경색의 정도에 영향을 가지고, 저체온증의 감소와 고열은 경색의 크기를 증가시킵니다.
2. 노출과 CCA와 ECA를 분리하는 동안, 경색 크기 감소의 가능성을 높일 수있는 인근의 미주 신경 및 기관을 손상하지 마십시오.
3. 이상의 10mm의 분기점을 통과 monofilament의 봉합을 삽입하지 마십시오. 너무 멀리 삽입 봉합은 뇌출혈의 앞쪽에 대뇌 동맥 및 결과를 구멍 수 있습니다. 저항은 봉합이 분기점 포인트 너머 90-10밀리미터에 대한 고급 때 느낄 수 있습니다. 이 경우, 연구자는 봉합을 증진 중단하고 거리를 확인합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Chemical	Baxter Internationl Inc.	95045-588
V-10 Anesthesia system	Equipment	VetEquip	901807
TR-200 Temp Controller	Equipment	Fine Science Tools	21060
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	CLP-9931
Dissecting microscope	Equipment	Nikon Instruments	SMZ745T
Retractor system	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	ACD-014
Bipolar coagulator	Equipment	Howard Instrument	64000
Silk suture	Material	Harvard Apparatus	510479
Monofilament suture	Material	Harvard Apparatus	723351
Vascular clamp	Equipment	Fine Science Tools	00396-01
Vannas scissor	Equipment	Fine Science Tools	15000-08
Brain matrix	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	BS-2000C
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma-Aldrich	T8877
10% neutral buffer formalin	Chemical	Sigma-Aldrich	HT5011