개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

요약

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한 방법 생체내에 제공됩니다. 이 방법은 외부 전기장의 응용 프로그램에 의해 유도된 세포 플라즈마 점막의 투과성에서 일시적 증가에 capitalizes.

초록

포유 동물 망막 개발 중에 표현 유전자의 기능적 특성은 중요한 도전 남아있다. 기능 knockouts의 제정 또는 조건부 손실을 생성하는 대상 유전자는 비용과 노동 집약뿐만 아니라 시간이 소요 남아 있습니다. 이러한 도전을 추가, 망막는 녹아웃 방식을 사용하면 의도하지 않은 유전자 confounds 이어지는 망막 밖에서 필수적인 역할을 할 수 있습니다 표명했다. 세포 운명 사양 및 / 또는 터미널 차별화의 역할을 파악하려고 할 때뿐만 아니라, ectopically 기능 실험의 이득에 유전자를 표현하는 능력은 매우 가치 수 있습니다.

우리는 electroporation에 의해 신생아 마우스 망막에의 DNA plasmids의 신속하고 효율적인 설립을위한 방법을 제시한다. 멤브레인 ^1,2,3,4 전체 자료의 전송을 촉진 플라즈마 막 투과성의 일시적 증가 특정 필드 강도 결과 위에 짧은 전기 자극의 응용 프로그램입니다. 획기적인 작품은 electroporation은 지질 이중층 ^1-5 높은 청구 DNA의 통과를 허용 친수성 플라즈마 막 모공의 형성을 유도하여 포유 동물 세포에 유전자 전달의 수단으로 활용 될 수 있다고 보여주었다. 지속적인 기술 개발은 망막, 본 ^{6, 7, 8, 9, 10} 설명되어있는 방법을 포함한 여러 마우스 조직에서 생체내 유전자 전달에 대한 방법으로 electroporation의 생존 결과입니다.

그 DNA가 신생아 (P0) 마우스 및 전기 펄스의 망막 색소 상피와 망막 사이에 위치하므로 DNA 솔루션은 트위터 전극을 사용하여 적용됩니다 subretinal 공간에 주입합니다. 마우스에 눈의 수평 배치가 필요한 부정 극 - DNA - 망막 - 긍정적인 극 정렬에 트위터 전극의 쉬운 방향을 허용합니다. 양도 유전자의 다양한 결합과 표현은 출생 후의 일 2 (P2)에 의해 확인할 수 있습니다. 망막에있는 세포의 중요한 측면 마이 그 레이션의 부족으로 인해 electroporated이 아닌 electroporated 영역은 생성됩니다. 비 electroporated 지역 내부 histological 컨트롤 적절한 역할을 수 있습니다.

망막 electroporation은 같은 편대의 편대 장으로 유비 쿼터스 발기인 아래 유전자를 표현하기 위해, 또는 shRNA 구조 또는 Cre 호텔 - recombinase를 사용하여 유전자 기능을 방해하는 데 사용할 수 있습니다. 보다 타겟이 명확한 표현은 세포 특정 유전자 발기인과 구조를 설계하여 얻을 수 있습니다. electroporated 세포의 시각화는 GFP를 표현 bicistronic 구조를 사용하여 달성하거나 GFP 식은 구조 공동 electroporating 것입니다. 또한, 여러 구조는 유전자 조합 효과 또는 다른 유전자의 기능을 동시에 이득과 손실의 연구 electroporated 수 있습니다. 망막 electroporation도 적절한 표현 구조 및 삭제 돌연변이를 생성하여 게놈 CIS - 규제 요소의 분석을 위해 활용할 수 있습니다. 이러한 실험은 세포 특정 유전자 발현 ¹¹ 충분한이나 필요한 CIS - 규제 지역을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 잠재적인 실험은 구성 가능한 의해 제한됩니다.

프로토콜

1. electroporation에 대한 플라스미드 준비

electroporation에 필요한 DNA의 농도는 5μg/μl입니다. 이것은 일반적으로 원하는 plasmids이 작동 금액에 DNA의 정화와 농도에 의해 다음 맥시 - 준비 (Qiagen) 또는 이와 동등한 방법을 사용하여 증폭해야합니다. 다음 단계는 작업 금액에 DNA의 준비를 설명합니다.

1. 나누어지는 100 μg의 DNA (맥시 - 준비 또는 동급에서)와 조작의 용이성 100 μL에 볼륨을 희석.
2. 페놀 추가, 페놀의 양은 약 60 %의 DNA / 볼륨 비율 (μg의 DNA : 총 볼륨)을 구하는 계산해야합니다 즉 : 100 μg의 DNA (100 μL)을 더한 67 μL 페놀 (100 μg : 167 μL)를. 철저하게 혼합, 이것은 DNA의 과도한 전단을 일으킬 수 있으므로 아래 피펫과하지 않습니다.
3. 실온에서 14,000 rpm으로 5 분 DNA를 스핀.
4. 뜨는 수집과 동일한 DNA를 사용하여 클로로포름 추가 단계 1.2 총 부피 비율, 혼합으로 실온에서 5 분간 14,000 rpm으로 단계 1.2 스핀에 설명되어 있습니다.
5. , 표면에 뜨는를 수집 DNA 솔루션 3 M의 아세트산 나트륨의....

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토론

생체내에 electroporation은 DNA의 표현 plasmids와 망막 세포의 변화에 대한 신속하고 효율적인 방법을 나타냅니다. 이 방법은 실험자들이 ectopically ubiquitously 표현 발기인의 통제하에 관심있는 유전자를 도입하거나 관심있는 유전자를 대상으로 s​​hRNA 구조를 사용하여 기능 연구의 손실을 수행하기 위해하여 기능 연구의 이득을 수행할 수 있습니다. 또한, 다중의 DNA plasmids은 실험자 여러 유전?.......

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
버퍼 페놀 포화	Invitrogen	15513-039	N / A
클로로포름	JT 베이커	9180-03	N / A
아세트산 나트륨	JT 베이커	3470-05	3 M 주식
빠른 그린 FCF	피셔 생명 공학	BP123 - 10	10 % 주식
이소 프로필 알코올 준비	타이코 헬스케어	6918	N / A
30 guage 바늘	Terumo 의료 주식 회사	SG2 - 3013	N / A
Exmire microsyringe	이토 주식 회사	MS * E05	N / A
Tweezertrode (트위터 전극)	BTX 악기, Genetronics 주식 회사	522	N / A
전기 스퀘어 Porator (electroporator)	BTX 악기, Genetronics 주식 회사	ECM 830	N / A
OCT 컴파 운드	사쿠라 Finetek 미국	4583	N / A