종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석

요약

튜브 형성 분석은 종양 세포의 혈관 활동을 평가하는 데 사용됩니다.

초록

지난 몇 년간, 튜브 형성 분석 성장을 사용하는 인자 - 감소 Matrigel 일반적으로 체외 ^1-5에서 혈관 내피 세포의 angiogenic 활동을 입증하기 위해 채용되었습니다. 그러나, 최근에 성장 증거는이 분석은 내피 세포에 대한 혈관 동작을 테스트하기 위해 제한 아니라는 것을 보여주었다. 대신, 그것은 또한 혈관 표현형 ^6-8을 개발하는 종양 세포의 숫자의 능력을 테스트하는 데 사용되었습니다. 이 기능은 xenotransplanted 동물, vasculogenic 흉내 (VM) ^9라는 과정에서 확인된 그들의 vasculogenic 행동과 일치했다. 그 종양 세포 매개의 VM이 내피 세포 angiogenesis ^{6, 10-13의} 독립 종양 개발에 중요한 역할을 보여주는 증거 다수가있다. 예를 들어, 종양 세포는 흑색증 및 glioblastoma 환자 ^{8, 10, 11} 조직 샘플에서 혈액 perfused, 혈관 채널 형성에 참여하는 발견되었습니다. 여기, 우리는 종양 세포의 vasculogenic 활동의 평가에 유용한 도구로 관형 네트워크 분석을 설명했다. 우리는 이러한 흑색증 B16F1 세포, glioblastoma U87 세포와 유방암 MDA - MB - 435 세포와 같은 일부 종양 세포 라인 혈관 tubules를 형성 할 수있다는 사실을 발견했다,하지만 일부는 결장암 HCT116 세포와 같은하지 않습니다. 또한,이 혈관 표현형는 Matrigel에 도금 휴대폰 번호에 따라 좌우됩니다. 따라서이 분석은 혈관 세포, 종양 세포뿐만 아니라 다른 세포를 포함한 세포 유형의 다양한 혈관 가능성을 화면에 강력한 유틸리티로 사용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석

1. 종양 세포 및 microvascular 내피 세포의 준비 같은 U87 세포, 흑색증 세포 B16F1, 유방 암 MDA - MB - 435, 그리고 결장 세포 HCT116과 같은 뇌 종양 세포는 (10 % FBS 및 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 DMEM에서 재배되었다 Invitrogen에서 ). 내피 세포주 인간 microvascular 내피 세포 (HMVECs은) 1 μg / ML 하이드로코티손 1 NG / ML 표피 성장 인자 10 % FBS 및 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 EBM2 중간 (Lonza)에 교양되었습니다. 세포는 PBS로 세 번 씻어와 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Invitrogen)로 분리되었다. 5 분 2,000 RPM과 원심 분리 후 세포 펠렛은 PBS로 다시 씻어되었습니다. 그런 다음 pelleted 전지는 hemocytometer로 집계되었다.
2. Matrigel 준비 : 성장 인자 - 나누어지는 감소 Matrigel이 (BD Bioscience) 실온에서 예열했다. 완전히 해동되기 전에, 그것은 얼음에 양도했고 그 액체는 적어도 10 분 얼음에 보관했다. 다음 Matrigel 50 μl가 Matrigel가 균일하게 배포 수있는 수평 레벨에서 96 - 웰 플레이트에 도금 및 37 ° C. 30 분 incubated되었습니다
3. 튜브 형성 : 세포 (1-2 X 10 ^4)이 내피 세포 종양 세포 또는 EBM - 2 혈청 무료 DMEM으로 다시 중단하고, Matrigel의 위에 적재했다. 이 분석은 가느다란 관 개발에 일부 요원들의 효과를 측정에 사용되는 경우,이 요원 (stimulators 또는 억제제)은 혈청이없는 매체에 추가되었습니다. 각 조건 그룹은 4-6 우물이 포함되어 있습니다.
4. 이미지 및 데이터 분석 : 37에서 다음과 부화 ° C 야간 각 잘가 현미경으로 직접 분석했다. tubules가 고정에 필요한이라면 10 % 포르말린 생리 기반 솔루션 100 μl가 부드럽게 추가되었습니다 십 분 후, 분석을 위해 준비했습니다. 10X 위상 대조 현미경, 각 분야의 tubules이 몇 군데 있었다 각 우물에 3-5 임의의 분야에서 tubules의 평균이 계산되었습니다.

2. 대표 결과 :

이러한 tubules가 다각형 네트워크를 형성 연결 명확한 길쭉한 세포 기관에서 개발된 것처럼 HMVECs은 긍정적인 제어로 사용되었습니다. B16F1, U87, 그리고 MDA - MB - 435 세포에 의해 형성 HMVECs 비슷한 혈관 tubules을 개발하지만, HCT116 세포는 (그림 1)하지 않았다. 세포 투여량에 의존 튜브 형성 U87 세포에서 테스트되었습니다. 그림 2에서 보여주 10,000 전지는 중단 tubules을 형성. 세포가 두 배가되었습니다되면 고체 혈관 네트워크 HMVECs에서 본 것과 비교했다. 대조적으로, 5,000 이하 세포는 혈관 표현형를 형성하지 못했습니다.

그림 1. HMVECs, U87, MDA - MB - 435과 B16F1 세포에 의해 유도하지만, HCT116 세포. 모든 세포는 (2 × 10 ⁴⁾ Matrigel에 적재하고 하룻밤 incubated되지 않았습니다 튜브 형성. Tubules는 위상 콘트라스트를 사용하여 몇 군데 있었다. HMVECs은 긍정적인 제어로 사용되었습니다. 3-5 분야의 대표가 표시되었다. 바 : 100 μm의.

휴대폰 번호 종속적인 방식으로 그림 2. U87 세포 유발 tubules.로서 모서리에 표시된 U87 세포의 서로 다른 숫자는 튜브 형성을 위해 사용되었습니다. HMVECs은 긍정적인 제어에 사용되었다. 바 : 100mm.

토론

성공이 분석하기 위해서, Matrigel의 품질 먼저 테스트해야합니다. 작은 샘플 HMVECs를 사용하여 분석을 미리 실행 Bioscience BD에서 구할 수 있습니다. 다른 배치 제품은 일부 많은 튜브 형성을위한 최적의 조건을 제공하지 않는에 ...와 비슷하지 않은 자질을 표시할 수 있습니다. Matrigel의 나누어지는가 96 - 웰 플레이트에 로드할 때 거품이 가느다란 관 형성을 방해 할 수 있기 때문에 둘째, 모든 거품은 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
DMEM	Invitrogen	11,995
FBS	Invitrogen	16000-044
성장 인자 - 할인 Matrigel	Bioscience BD	47743-720
EBM2 키트	Lonza	CC - 3156
니콘 이클립스 TS100 현미경	니콘