Cryo - 전자 현미경에 의해 HIV - 1 Capsid 어셈블리의 구조와 반복 나선형 실제 공간 재건

요약

이 문서는 cryo - 전자 현미경을 사용하여 나선형으로 조립 분자의 3 차원 (3D) 구조를 구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 반복 나선형 실제 공간 재건 방법에 의해 밀도지도를 달성하기위한 세부적인 3D 재건 절차를 설명하기 위해 HIV - 1 capsid 어셈블리를 사용합니다.

초록

이미지 프로세싱과 결합 Cryo - 전자 현미경 (cryo - EM)는, macromolecular 단백질 단지와 어셈블리의 구조 결정에 대한 점점 더 강력한 도구입니다. 사실, 단일 입자 전자 현미경 ¹ (2D) 2 차원은 전자 crystallography ² 상대적으로 일상적인 방법론과 구조의 많은되고있는 이러한 방법을 사용하여 해결했습니다. 동시에, 이미지 처리 및 헬리컬 객체의 세 차원 (3D) 재건은 빠르게 특히 나선형 대칭과 함께 단일 입자 분석 도구를 사용하여 나선형 실제 공간 재건 (IHRSR) 방법 ^3을 반복, 발전시켜 왔습니다. 나선형 엔티티의 3D 밀도지도가 하나의 투영에서 획득 할 수 있기 때문에 대부분의 생물 학적 실체가 filamentous 또는 헬리컬 굴지의 필라멘트 ^4, microtubules ^5, 아밀로이드 섬유 ^6, 담배 모자이크 바이러스 ^7, 박테리아 flagella ⁸ 포함한 양식, 그리고에 기능 IHRSR 방식이 아닌 나선형 오브젝트의 3D 재건에 필요한 다양한 이미지, 등 유연하고 무질서 나선형 어셈블리의 구조 분석에 비해 이미지는 지금 실현합니다.

이 비디오를 문서에서, 우리는 cryo - EM으로 cryo - EM 시료 준비, 저용량 데이터 수집을위한 프로토콜을 포함 헬리컬 단백질 어셈블리의 3D 밀도지도 (HIV - 1 capsid ^9의 예입니다), 인덱싱를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다 헬리컬 회절 패턴, 그리고 IHRSR를 사용하여 이미지 프로세싱 및 3D 재건. 다른 기술에 비해, cryo - EM은 근처 기본 조건 하에서 최적의 표본 보존을 제공합니다. 샘플은 빠른 냉동으로 유리 얼음의 얇은 레이어에 포함된, 그리고 방사선 피해를 최소화하기 위해 저용량 조건 하에서 액체 질소 온도에서 전자 현미경으로 몇 군데 있습니다. 샘플 이미지는 낮은 신호 및 기록 micrographs 낮은 콘트라스트의 비용으로 근처 기본 조건 하에서 얻을 수 있습니다. 다행히, 나선형 재구성하는 과정은 크게 헬리컬 회절 패턴을 색인을 제외하고, 자동되었습니다. 여기, 우리는 인덱스 헬리컬 구조 방식을 설명하고 디지털 micrographs, 3D 나선형 재건을위한 필수적인 단계에서 나선형 symmetries을 (헬리컬 매개 변수)를 결정합니다. 간단히, 우리는 IHRSR 방법을 적용하여 초기 3D 밀도지도를 구하십시오. 이 초기지도는 다음 반복함으로써 자신의 자유도를 조절, 각 세그먼트의 정렬 매개 변수에 대한 제약을 도입하여 세련됩니다. 더 개선은 전자 현미경 (진폭 및 위상 보정)의 대비 전송 기능 (CTF)을 수정하여하고 어셈블리의 나선형 대칭을 최적화하여 이루어진다.

프로토콜

1. 냉동 수산화 EM 표본 준비

HIV - 1 capsid 단백질 (CA)이 어셈블리 ⁹ 단 cryo - EM 이미지에 강한 배경 소음을 기여 높은 소금 (1M NaCl) 버퍼에 안정되기 때문에, 우리는 transiently 소금을 줄이기 위해 빠른 희석 다시 사이드 모래 바닥 방법을 사용 농축 냉동 수산화 EM 격자를 준비할 때.

1. 25초에 대한 25mA 이하 200 메쉬 R2 / 1 Quantifoil 구리 격자의 글로우 방전은 탄소 측면.
2. 80 % 환경 챔버에서 습도, 집에서 만든 수동 중력 플런저를 데리고 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 사용합니다.
3. 페이 Vitrobot 플러져 듀어, 액체 질소를 사용하여 냉각 액체 에탄에서. 수동 중력 플런저에 뛰어들다 - 냉동 듀어를 탑재합니다.
4. 포셉에 장착할 수있는 격자의 탄소쪽으로 preassembled CA 솔루션 2.5 μl를 적용하고, 당신을 멀리 직면하고있는 격자의 탄소 사이드와 플런저에 포셉를로드합니다.
5. 그리드의 뒷면에 낮은 소금 희석 버퍼 (100 MM NaCl) 3 μl를 추가하고 즉시 필터 종이와 그리드의 뒷면에 얼룩. 그리드의 전체 배면은 필터 용지를 제거하기 전에, 약 6 초 동안 필터 종이와 긴밀한 연락을해야합니다. 즉시 필터 용지를 제거한 후 액체 에탄으로 격자를 뛰어들다.
6. 플런저의 집게를 제거하고 신속하게 그리드 스토리지 상자에 격자를 전송합니다.

2. CA 관형 어셈블리 Cryo - 전자 현미경

1. 200kv에서 황비홍 폴라라 G2 전자 현미경 운영에 냉동 수산화 격자를로드하고 Gatan 4Kx4K CCD 카메라가 장착되어.
2. ~ 200x의 확대에 낮은 선량 - 검색 모드에서와 복용 <0.001e과 함께 ^- / ^2, 스크린 적합한 얼음 무대 파일에 이러한 영역의 위치를 저장과 영역에 대한 전체 그리드.
3. 낮은 선량 - 검색 모드에서 3,900 X의 확대에 저장된 위치와 추가 화면이 영역을 회수. 데이터 수집을 위해 구멍을 통해 잘 구분된 긴 튜브를 포함하는 얼음의 유니폼, 얇은 레이어로 영역을 선택합니다. 두 번째 단계 파일에서 이러한 영역의 위치를​​ 저장합니다.
4. 59,000 X, 삽입된 페이지 100 μm의 목표 구멍의 확대에 노출 모드로 전환하고, ~ 15 E의 복용에 대한 객관적 stigmatism 및 빔 강도를 조정 ^- 노출 당 / A ^2.
5. 낮은 복용량 - 검색 모드로 돌아갑니다, 저장된 위치로 이동하고 CCD 카메라를 사용하여 좋은 튜브를 파악하고 중심. 초점 모드로 전환, 초점을 조정하고, defocus 값을 설정, 일반적으로 사이 0.5-2.5 μm의. 노출 모드로 전환, 15 E의 복용량을 위해, 0.3-0.5 초 노출 시간을 설정 ^- / ^2, 그리고 이미지를 수집합니다. 이미지는 접시 카메라 수집하고, 노출이 촬영되기 전에 필름은 10 초 동안 정착을 허용해야합니다.
6. 다음 저장된 위치로 이동하고 더 많은 이미지를 수집하기 위해 5 단계를 반복합니다.
7. 영화 12 분 동안 풀 가동 D19에서 개발하고 6.35 μm의의 픽셀 크기 니콘 슈퍼 coolscan 9000 ED 스캐너를 사용하여 디지털됩니다. 이미지 파일의 형식은 TIFF 있습니다.

3. 나선형의 색인

나선형 개체는 두 개의 매개 변수에 의해 색인을 생성할 수 있습니다 베셀 주문, N, 및 레이어 줄 번호, 난 있습니다. 로 (N, L)에 의해 특징 푸리에 변환의 각 계층 라인, 2D 격자의 표기법을 사용하여, (H, K)에 의해 인덱스를 표시된 나선형 오브젝트의 표면 격자에 라인의 집합에 해당합니다. 모든 (H, K)의 경우, (N _홍콩, 난 _HK) 레이어 라인의 N과 나는 가치 두 가지 기본 벡터 (N ₁₀ 리터 _10)와 (N _01, 전 _01)의 선형 ​​조합입니다 두 주요 레이어 라인 (1, 0)과 (0, 1). 리터는 푸리에 변환의 Z 축을 따라 측정의 레이어 라인 높이에서 구할 수 있습니다. N의 값은 다음 방정식 ^10을 사용 예상 수

πRr ≈ J _N ≈ 1.1 | N | -0.9 .....................( 1)

J _n은 N의 ^번째 레이어 라인의 강도를 결정하는 베셀 함수이고, R은 나선형 객체의 반경이고, R은 레이어 라인의 최대 진폭의 반경이다. 레이어 라인 번호, 전, 선택 규칙 ¹¹ N과 관련이

L = TN + 음 ....................( 2)

T와 U는 나선형의 상수 어디. 특정 나선형 들어, (또는 매우 밀접하게) 정확히에서 T C U 정확히 단위가있을 수 있습니다omplete이 바뀝니다.

1. EMAN의 프로그램 ¹² helixboxer 및 MRC 포맷으로 이미지를 저장을 사용하여 균일한 직경이 비교적 직선과 긴 튜브 밖으로 상자.
2. MRC 패키지 ¹³ 등 'imgccf'와 같은 교차 상관 기반 프로그램을 사용하여 나선형 반복 거리, C를,,, 확인하십시오.
3. 반복 거리, C의 핵심입니다 새로운 상자 길이와 푸리에 변환을 계산합니다.
4. 두 가지 기본적인 표면 격자 벡터 (1,0)을 정의하고 (0,1) 2 주요 레이어 라인을 선택합니다.
5. 튜브의 반경, R 및 푸리에 변환, 전 _10, R _10, 각각 ₀₁ 리터 R _01, (그림 1)에서 두 개의 주요 레이어 라인의 높이와 반경을 측정합니다.
6. N ₁₀ 방정식 (1)에 따라 N ₀₁ 계산.
7. N 값은 추정하기 때문에, N ₁₀ N _01의 몇 가지 조합이 프로그램 패키지 IHRSR를 사용하여 올바른 나선형 대칭을 찾아 (단계 4.2 참조) 나중 단계에서 테스트합니다.
8. subunits (Δφ)과 한 별 나선의 축 리즈 (Δz) (N = 1) 사이의 순환 두 개의 현실 번호에 의해 설명하는 나사 대칭을 계산합니다. 리터 ₁₀ 리터 _01, N _10, N ₀₁ 가치를 감안할 때, U와 t는 m 값의 범위 (예를 들어, -50 <50) 선택 규칙에 따라. 테스트하여 구할 수 있습니다 마지막으로, Δφ 및 Δz이 사용하는 계산됩니다 Δφ = 360t / U 및 Δz = C / U.

4. 입체 재건

1. 입자 세분화
   1. EMAN 패키지 프로그램입니다 그래픽 프로그램 복서를 사용, 나선형 입자를 포함하는 현미경을 엽니다.
   2. 중복 세그먼트로 나선형 입자를 잘라. 복서의 제어판에서 헬릭스 모드를 선택하고 복싱에 대한 매개 변수를 설정 상자의 크기는 입자의 직경과 'OLAP'이 상자 크기의 ~ 90 %되어야합니다에 대한 값보다 커야합니다.
   3. 나선형 입자의 양쪽 끝에 왼쪽 버튼으로 클릭한 후, 복서가 자동으로 나선형의 길이를 따라 입자 박스 시리즈를 생성합니다.
   4. 박스 세그먼트뿐만 아니라 자신의 좌표를 저장합니다.
2. IHRSR 프로그램을 사용하여 초기 3 차원 재구성
   1. cryo - EM 이미지의 명암을 반전하고 반복 헬리컬 실제 공간 재구성 방법 (IHRSR)로 처리하기 전에 ¹⁴ (옵션) 필터링 낮은 패스를 적용합니다.
   2. "생성기"를 입력하여 IHRSR 프로그램의 그래픽 인터페이스를 엽니다. 이름과 경로 스택의 스택에서 이미지의 숫자를 포함하여 박스 입자 스택에 대한 모든 정보와 그래픽 인터페이스를 제공, 대칭 매개 변수의 값은 등 재구성 스크립트를 만들려면 버튼 "마침"을 클릭 b25.spi.
   3. 초기 참조로 고체 또는 속이 빈 실린더를 사용하여 보통 몇 사이클 후에 발생하는 정의 나사 대칭에 변화가 없을 때까지 사이클로 프로 시저를 허용합니다. 오른쪽 나선형 대칭이 안정적으로 수렴 재건을 줘야한다. 지난주기에서 생성된 재건은 더욱 정제에 대한 최초의 레퍼런스로 사용됩니다. IHRSR 스파이더 프로그램을 사용하여 3 차원 재구성을 수행합니다.
3. 반복 상세 ¹⁵ 재건은 IHRSR에 의해 생성 3D 재구성은 현재 추가적인 정제를위한 초기 참조로 사용됩니다. 상세 동안 나선형 대칭은 Δφ 및 IHRSR 절차에서 결정됩니다 Δz에서 고정됩니다.
   1. 프로그램 CTFFIND3 및 CTFTILT ^16을 사용하여 현미경에서 defocus 및 난시의 현재를 확인합니다.
   2. 스파이더 프로그램 ^17을 사용하여 CTF에 의해 입자 세그먼트를 곱하면됩니다. 거미 스위트에서 FT를 칭했다 작업은 2D 이미지의 푸리에 변환 (FFT)을 계산하는 데 사용됩니다. 그 후, FFT는 거미 제품군 내에서 MU를 칭했다 작업을 사용하여 이전 단계에서 결정, CTF 값을 곱한 것입니다. 얻은 값은 다음 역 거미 작업을 사용하여 실제 공간에 새로운 이미지 (CTF - 수정)을 양식으로 변형, FT 다시합니다.
   3. 다중 참조 정렬을 사용하여 CTF - 수정된 이미지 참조 볼륨 계획을 비교하여 프로젝션 검색을 수행합니다. 아웃 - 오브 - 비행기의 기울기 각도의 편차는 + / -10 °로 제한하고 1 °의 단계로 샘플링됩니다. 각 세그먼트의 정렬 매개 변수에 대한 이러한 높은 상관 계수와 같은 제약, 0 ° 또는 180 °, 그리고 X - 교대 제한 근처에 - 평면 각도를 소개합니다. 제약을 만족 재건에만 세그먼트에 포함합니다.
   4. 각 상세 검색 사이클을 반복하면, 3D 재구성은 CTF 이상 합계로 다시 투영을 사용하여 생성하고 나누어져 있습니다2.
   5. symmetrized 볼륨을 생성하는 나선형 대칭을 부과. 새로운 3D 재건의 해상도에서 더 이상 개선이 발생 없을 때 반복 상세가 종료됩니다.
   6. 이미지 프로세싱 패키지 거미는 상세 검색 단계를 대부분 사용됩니다. 작업 일련의 작업과 매개 변수 값의 시퀀스를 포함하는 사용자가 만든 배치 제어 파일입니다 스파이더 스크립트에 의해 제어됩니다. 최종 재건은 거미의 제품군에 프로그램을 사용하여 계산됩니다.

5. 대표 결과 :

단일 HIV - 1 CA A92E 튜브 (그림 1A)은 박스 나오려고했는데 그 푸리에 변환 (그림의 1B)는 나선형 색인 계산되었다. 레이어 라인 (1, 0)과 (0, 1), 전 ₁₀ = 28 리터 ₀₁ = 37, R ₁₀ = 55, R ₀₁ = 44. 211.57Å의 튜브 반경을 감안할 때, 우리는 N ₁₀ =- 12 N ₀₁ approximated = 11 (여기서, handedness가 미리 정해진되었다). 5195.48Å의 반복 거리로 튜브의 나사 대칭이 Δz과 같이 결정되었습니다 = 6.8093Å, Δφ = 328.88 °. Δz과 Δφ는 7.1321Å과 328.86에 세련된했다 ° IHRSR (그림 2A) 및 초기 재건이 그림에 표시됩니다를 사용하여. 2B. 최종 재건 (그림 3), 상세 검색을 반복 후 IHRSR (그림 2B)로 계산 초기 모델에서 상당히 밀도지도를 향상되었습니다.

그림 1. HIV - 1 CA 헬리컬 튜브의 색인을 생성합니다. (A) 하나의 HIV - 1 CA A92E 관 이미지. 스케일 바, 30 NM. (B) 푸리에 (A)에 표시된 튜브의 변환. 나선형 지표는 (N ₁₀ =- 12 N ₀₁ = 11) 표시된 있습니다. 23A 해상도에서 레이어 라인에 애로를 가리 킵니다.

그림 2. IHRSR를 사용하여 초기 재건. 각 반복주기 (A) 나사 대칭 결정. 10 상세 검색 사이클을 반복 후 Δφ과 Δz은 초기 값부터, 안정적인 값으로 수렴. (B) 10 일 이후 최초 3D 밀도지도 사이클을 반복.

그림 3. 반복 상세 후 3D 밀도지도. (AC) CA 튜브의 밀도지도는 세 직교 조각으로 표시됩니다 튜브 축에 평행하고 튜브 축 (B)에 수직, 표면 (A) 가까이 및 병렬 튜브 축 (C)와 통해 . 스케일 바, 10 NM. (D) 3D 밀도지도의 표면 렌더링 100 % 볼륨을 둘러싸고 1.8s에서 contoured.

토론

우리는 나선형 오브젝트의 3D 구조를 얻기 위해 직접적인 접근을 제공하는 프로토콜의 집합을 제시한다. 설명한 절차를 사용하여, 우리는 하나의 튜브 이미지 (176 세그먼트)에서 HIV - 1 capsid 어셈블리의 3D 구조를 인수했다. 높은 해상도의 구조는 더 많은 이미지 데이터를 포함하여 얻을 수 있습니다.

최적의 데이터 수집 및 분석을위한 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다 첫 번째는 cryo - EM 표본의 준비 기간 동안, 샘플 솔루션은 표본의 크기보다 약간 두껍 솔루션의 유니폼, 얇은 레이어를 떠나 멀리 blotted해야합니다. 예제를 얼룩하는 여러 가지 방법이 있습니다. 특히 백 측면에서, 한 측면에서 모래 바닥 세균 세포와 같은 HIV - 1 CA 어셈블리로 관형 표본, 들어 가장 적합합니다.

둘째, 나선형의 handedness이가 나선형 색인을 생성하거나 재구성하여 수행할 수 없으므로, 결정되어야합니다. 일반적인 연습은 로타리가 handedness을 결정하는 ¹⁸ 붙인 다음 냉동 에칭을 사용하는 것입니다. 밀도지도의 해상도가 충분히 높은 경우 Handedness 또한 이후 재건을 결정 수 있으며 정확한 handedness를 가정하면 개별 구성 요소의 3D 모델은 원자 밀도지도에 잘 맞지도한다. 그렇지 않으면, 반대 handedness을 가정해야합니다.

셋째, 위너 필터는 잡음 증폭을 줄이기 위해, 위상과 진폭 보정 모두, 이미지 처리하는 동안 사용해야합니다. 하나의 이미지에서 CTF는 항상 제로 횡단을 가지고 있기 때문에, 상호 공간에서 정보의 일부가 손실됩니다. 따라서 다른 defocus 값에서 3D 재구성, 각각의 몇 군데에 포함 여러 투영 데이터 집합이 필요합니다.

자료

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EM 소프트웨어 EMAN	http://blake.bcm.edu/EMAN/
EM 소프트웨어 IHRSR	http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /	에드워드 H. Egelman에서 제공 프로그램
EM 소프트웨어 스파이더	http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
MRC 기반 헬리컬 처리 소프트웨어	http://www.riken.jp/biostrmech/index.html	코지 요네쿠라에서 제공 프로그램
CTFFIND3/CTFTILT과 실제 공간 헬리컬 상세 검색 소프트웨어	http://emlab.rose2.brandeis.edu/software