Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

요약

방법은 콜라겐 유형 I 및 기본 인간 섬유 아세포로 구성된 3 차원 매트릭스의 준비를 위해 설명되어 있습니다. 이 조직 기질의 기본 기능을 모방하고 현미경의 여러 형태의 의무이기 때문 organotypic 젤은 침입 세포 마이그레이션을 평가하는 유용한 기판 역할을합니다.

초록

셀 마이그레이션 개발, 상처 치유, 면역 시스템의 세포 반응 및 종양 세포의 전이를 포함 생물학의 여러 측면들에게 필수적입니다. 마이그레이션은 밝은 현미경으로 조사 의무가 세포 역학을하기 위해 유리 coverslips에 연구되었습니다. 그러나, 세포 이주의 여러 측면이 충실 유리 및 플라스틱 ^1로 강성 2 차원 기판으로 표현되지는 탄성, 단백질 구성 및 기공 크기, 등의 지역 환경의 특징에 따라 분명이되었습니다. 또한, stromal 섬유 아세포 ^2, 면역 세포 ^3를 포함 해 다른 세포 유형, 상호 작용은 암 세포의 침략을 촉진에 중요한 역할을 보여왔다. 분자 수준에서 조사가 점점 더 비교했을 때 동일한 세포의 약물 치료에 반응을 포함한 분자 역학, 크게 다른 것으로 나타났습니다 생체 ^4인치

이상적으로,이 생활 생물에서의 자연적으로 발생하는 맥락에서 세포 이주를 공부하는 것이 바람직하다, 그러나이 항상 그렇지는 않습니다. 이러한 세포 유래 매트릭스, matrigel, organotypic 문화 (여기에 설명 된) 조직 explants, organoids 및 xenografts와 같은 중간 조직 배양 시스템은, 따라서 중요한 실험 중간체 있습니다. 이러한 시스템은 대략 특정 생체 환경에서의 측면 만은 안정적으로 transfected 세포 라인, 약물 치료 제도, 장기, 고해상도 영상의 사용으로 실험 조작에 더 의무가 있습니다. 이러한 중간 시스템은 프로브를 확인하고 이미지를 사전에 생체 ⁵ 이미지를 사업에 세포와 형광 기자의 동적 응답을에 필요한 매개 변수를 설립 근거를 증명 특히 유용합니다. 따라서, 그들은 리빙에서 실험에 대한 필요성을 감소에 중요한 역할을 제공 할 수g 동물.

프로토콜

1. 피부 explants에서 섬유 아세포 문화의 확립

1. 100 단위 / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 및 0.25 μg / ML의 Fungizone을 보완 인간의 팔에서 얻은 4mm 펀치 biopsies는 가상에 배치됩니다.
2. 어떤 피하 지방을 트림과 가늘게 페트리 접시의 바닥에 대한 번호 24 메스 블레이드를 흔들하여 작은 조각으로 생검을 자르다.
3. 플라스크의 표면이 될 때까지 주요 섬유 아세포 성장 미디어 (가상 10 % FCS, 100 단위 / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 25 μg / ML Fungizone과 보충)와 25cm ^두 조직 배양 플라스크에서 개최 조직 슬러리 추가 적용하지만 액체 깊이 조직이 떠 할 불충분합니다.
4. 5% CO ₂ humidified 분위기 속에서 37 번 3 일 부화 ° C에 따라, 기본 섬유 아세포 성장 미디어의 3 ML를 추가합니다.
5. 신선한 주요 섬유 아세포 성장 미디어와 다른 3 일 배양 변경 미디어를 따라, 또는 cel 경우이게들이 새로운 미디어에 1시 4분을 분할 할 수 있습니다 거의 합류합니다. (Fungizone이 시점부터 생략 할 수 있습니다.)

2. I를 단계 - 쥐 꼬리에서 콜라겐 I의 작성을

참고 : 약 12​​-14 사춘기 (신선한 또는 냉동) 쥐 꼬리에 대한 프로토콜

1. 70 % 에탄올에 세척하여 쥐의 꼬리를 준비하고 다음과 같이 힘줄을 제거 :
2. 로 위에서 아래로 꼬리의 중간에 썰기하여 쥐의 꼬리에서 피부를 제거 메스와 꼬리의 길이를 따라 pealing.
3. 꼬리의 가까운 지역의 핵심에서 힘줄를 분리합니다.
4. 톱니 집게를 사용하여 피복을 피하기 꼬리 말초 지역으로 힘줄을 제거합니다.
5. 48 H에 대해 4 ° C에서 교반에 의해 힘줄의 1 G / 0.5 M 아세트산 250 ML 압축을 풉니 다.
6. 30 분의 추출물 (7,500 XG)를 원심 분리기와 펠렛을 폐기합니다.
7. 표면에 뜨는에 10 %의 동일한 볼륨 (w / V) NaCl을 추가하고 30-60 분 동안 저어.
원심 분리기 (10,000 XG), 표면에 뜨는을 버리고, 4 24 H에 감동하여 ~ 1시 1분 비율 0.25 M 아세트산에서 다시 분해 침전물 ° C.
8. 6L 6-8 변화에 대한 콜라겐 솔루션 ~ 17.5 MM 아세트산을 (냉수 리터 당 1 ML 빙하 아세트산, 변경이 X 매일) Dialyze.
9. 1.5 시간 30,000 XG에서 dialysed 콜라겐을 원심 분리기.
10. 멸균 플라스크의 표면에 뜨는 및 장소를 제거합니다.
11. ~ 2 MG / ML에 나는 집중 4에서 0.5 mm까지 아세트산을 사용하여 ° C. 콜라겐을 조정

3. 단계 II - 내장 된 섬유 아세포 (8 일 계약을 체결 할 수 있도록)와 3D 매트릭스를 설정합니다.

1. 미리 차가운 병에 4에서 추위 시약을 사용하여 ° C를 혼합 조립. 얼음에 콜라겐 I세요.
2. 합류 주요 섬유 아세포 중 하나 T75 플라스크를 들어 (~ 전화 번호 1 개 10 ⁶⁾ 사용 :
   • 25 ML의 쥐 꼬리 콜라겐 (약 conc 2mg/ml)
   • 10X 3 ML가상
   • 0.22 M NaOH : 첫 번째는, 2ml, 콜라겐이 주황색집니다 때까지 드롭 현명어진이 저어, 추가
   • 하지만 핑크 (일반적으로 최대 3 ML). 대략 P ^H = 7.2.
   • 참고 : 조금이라도 알칼리성 조건에 노출하면 섬유 아세포가 젤 수축하지 않습니다 매체 / 젤은 중성 또는 약산성 상태를 유지하는 것이 중요합니다.
3. , 섬유 아세포를 Trypsinise ​​5 분 400 XG에 돌리고 표면에 뜨는 제거합니다.
4. 5 분 동안 위에 스핀 : 12 X 35mm 플라스틱 요리를 준비 - 일반적으로 섬유 아세포 / 콜라겐 믹스 중 하나를 플라스크에서 12 요리를 얻을 수 있습니다.
5. 3 ML FCS에서 섬유 아세포를 다시 중단하고 즉시 콜라겐 믹스에 추가하고 저어.
6. 의 판금 약 2.5 ML 요리 당 콜라겐 / 섬유 아세포 가능한 한 빨리. 거품과 콜라겐 설정을 피하기 위해보십시오.
7. 콜라겐은 10 분에 공중에 5 % CO ₂ humidified 분위기 속에서 37 ° C에서 설정할 수 있습니다.
8. 섬유 아세포의 1ml의 성장 추가일 미디어 (DMEM + 10% FCS).
9. 피펫을 사용하여 요리의 측면에서 콜라겐 / 섬유 아세포 매트릭스를 분리합니다.
10. 다음 날 : 섬유 아세포 성장 미디어 (DMEM + 10% FCS)의 1ml을 추가합니다.
11. 매일 미디어를 변경합니다. 그들은 24 잘 접시에 적합한까지 약 8 일간의 계약에 콜라겐 / 섬유 아세포 행렬을 허용 (직경 1.5 cm에 ~ 3.5 cm의 수축, 그림 1 참조).

참고 : 콜라겐 농도가 응용 프로그램에 맞게 조정해야합니다. 더 콜라겐 솔루션을 희석, 더 빨리는 섬유 아세포에 의해 계약을 체결합니다. 수축 속도에 약간의 차이가 같은 농도에서 콜라겐의 다른 일괄 적으로 경험 될 것입니다. 마찬가지로, 다른 섬유 아세포 문화가 서로 다른 가격으로 콜라겐 젤 수축되며, 더 많은 섬유 아세포가 제시 빠른 수축의 속도. 콜라겐 농도와 섬유 아세포 밀도 따라서에 의해 수축의 속도를 수정하는 조절 할 수 있습니다콜라겐 젤과 최종 밀도.

4. 단계 II - 모체의 상단에 관심 도금 세포

참고 : 사용하기 전에 에탄올 모든 포셉과 장비를 소독.

1. 무딘 집게를 사용하여 부드럽게 24도 요리에 계약 매트릭스를 이동합니다. 이 배하지 않도록 확인하십시오.
2. 매트릭스의 꼭대기에서 약 4 × 10 ⁴ / ML 및 플레이트 1ml (트립신 제거하는 trypsinising, 스핀 전지 후)에 관심 세포의 정지를 준비합니다. 필요한 셀의 실제 수는 사용하는 세포의 종류에 따라 달라집니다. 셀 매체의 관심 세포에 대한 일반적인 성장 매체해야합니다.
3. 세포가 모체의 상단 약 3-5일에 합류로 성장할 수 있습니다.

5. 단계 III - 침략을위한 그리드 (약 0~21일)에 매트릭스 전송

1. 삼각대를 생성하고 (그림 2 참조)을 사용하기 전에 압력솥에 스테인레스 스틸 격자를 잘라.
2. 에 멸균 그리드를 배치6cm 요리는 그리드 위의 수준 (약 10.5ml)에 성장 미디어를 추가 할 수 있습니다. 장소 그리드에 매트릭스와 매트릭스의 하단 미디어와 접촉하지만 침수되지 않도록 부드럽게 미디어를 대기음. 이것은 침략을 촉진 그라디언트를 만들어 공기 / 액체 인터페이스로 언급됩니다. 모든 매체 이틀 (그림 2 참조)로 대체합니다.
3. 셀을 라이브, 형광 세포를 사용하여 콘텐츠 영상이 단계 이전에 이미징 할 수 있습니다. 계약 또는 섬유 콜라겐은 I 제 2 고조파 세대 (SHG, 그림 3 참조)를 사용하여 이미지로 할 수 있습니다. 우리가 세포질 GFP를 표현 세포가 최소한 200 μm 깊이 이미징 할 수 있습니다 반면 SHG가 매트릭스에 최소한 100 μm를 이미징 할 수 찾을 폭 넓은 분야 감지와 결합 멀티 광자 여기를 사용합니다.

참고 : 침략의 정량화에 관하여, matricies이 격자에 배치되는 날은 날에게 공을 정의합니다. 격자에 게재은 침략의 정수를 촉진 세포 배양 매체의 그라디언트를 생성 행렬을 O. 샘플은 다음 하나 이상의 이미징 할 수 있습니다 - 21 일 (또는 이상) 등 침입, 증식, 생존 또는 차별화 (참조 목록을 참조)과 같은 생물학적 과정을 평가합니다.

6. 단계 IV - 고정

1. 팔콘 튜브에 4% PFA의 5 ML을 추가합니다.
2. 평평한 표면에 매트릭스를 전송합니다. 새로운 깨끗한 메스 (당신은 단면 얼룩 질 줄 등) 반으로 행렬을 잘라, 밤 수정, 메스와 4% PFA로 송금 행렬을 올린다.
3. Organotypic 매트릭스 지금은 항체와 얼룩 / (그림 3 참조) 선택의 얼룩을 할 수 있습니다.

7. 대표 결과 :

그림 섬유 아세포와 페트리 접시에서 분리하고 6~8일를 통해 계약을 체결 할 수 쥐 꼬리 콜라겐의 섬유 아세포 - 계약 콜라겐 I. 혼합물의 한 예.

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이 Organotypic 분석의 진행을 그림. organotypic 함정과 진행 A, 설계도. B, 스테인레스 스틸, 공기 / 액체 인터페이스를 만들 수있는 살균 격자의 상단에 콜라겐 / 섬유 아세포 행렬의 예.

organotypic 검정 3 응용 프로그램을 그림. A, B 비 침습적 및 침입 췌장 ductal 암종 (PDAC) 전지는 organotypic 행렬과 시간에 폐를 끼치고. C는 섬유 아세포 - 계약 collagenous 피부 구성 요소에 층상 표피를 보여주는 피부에 상응하는 생활. D, C8161 흑색 증 세포는 침입 섬유 아세포에 collagenous 피부와 같습니다. E, organotypic 매트릭스 내에서 상호 작용과 섬유 아세포 (빨간색)와 침략 침략 PDAC 세포를 (녹색) 계약을 체결. F는 , 세포 외 기질 (자주색)을 주변 저하와 상호 작용 침해 PDAC 세포 (녹색) multiphoton 기반의 초 고조파 세대를 사용하여 시각화.

토론

여기 침해 세포 이주 ^6-8 연구에 적합한 3 차원 매트릭스의 생산을위한 방법을 제시한다. 매트릭스는 기본 인간 표피 섬유 아세포로 몇 일 동안 계약 콜라겐 1 형 원 섬유로 구성되어 있습니다. 콜라겐은 폴리 펩타이드 끝에 반응성을 유지하면서 버퍼 조건 ⁹ 중화시 큰 집계에 콜라겐 원 섬유의 가교를 촉진 산성 추출,하지 효소 소화에 의해 준비가되어 있습니다. 더 자세히 생체에서 콜라겐의 기능을 모방하고 젤에 배양 세포의 침입 속성에 대한 중요한 결과를 가지고 다시 구성되는 젤에있는이 결과. 콜라겐 교차 연결은 어린 동물에 더 많은 불안정한 있기 때문에 신선한 또는 냉동 출발 물질을 사용 상관 있지만, 청소년 쥐 꼬리를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 콜라겐 I 젊은 동물은 추출하는 것이 용이하며, w를 다시 구성i 번째 높은 충실도.

콜라겐 매트릭스는 고정과 스테인드 침해 종양 세포 또는 stromal 섬유 아세포 ^2,10 하나 향한 항체와와 침략 ^5,6을 억제 할 수 약물의 효능을 테스트하는 데 매우 유용합니다 수 있습니다.

이 프로토콜은 기본 인간의 피부 섬유 아세포의 사용을 제안하지만,이 조사중인 조직의 종류에 따라 다른 조직 유형에서 기본 섬유 아세포를 사용 가능합니다. 그것은 안정적으로 형광 단백질 conjugates와 transfected 된 세포를 포함 불후의 섬유 아세포를 사용 문화를 구축하는 것도 가능합니다. 이런 식으로 stromal와 종양 세포는 모두 침략 ^11시 세포 세포 상호 작용을 시각화하기 위해 표시 할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
10X 가상	Gibco	21,430	-
NaOH	시그마	367176-500G	물에 0.22 M 재고 준비
FCS	PAA Laboratories의	A15-101	-
35mm 요리	매	353001	단계 3.4에 대한
60mm 요리	매	353004	단계 5.2에 대한
봄 포셉 무딘	Samco	E003/02	부드러운 아니라 톱니
16 % paraformaldehyde	전자 현미경 서비스	15,710	사용 전에 PBS에 4 %로 희석
CD-1, 크기 40 메쉬에 대한 화면	시그마	S07707-5EA	스테인리스 스틸 격자, 팩 당 5
투석 관	Medicell 국제	7607 2295	12-14 KD
PBS	Oxoid	BR0014G	-
아세트산	시그마	242853	-
24 잘 접시	매	353047	단계 4.1에 대한
Fungizone	vitrogen에서	15290018	-