단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

요약

뉴런 먼저 electrophysiologically 특징입니다. 그런 다음 기록된 신경 세포의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 이온 채널, 수용체에 대한 mRNAs의 표현을 감지하기 위해 전사 - PCR 분석을 반대를 받게됩니다.

초록

포유류의 중추 신경계에서 다양한 분자 및 기능적 특성과 뉴런의 종류는 서로 분리하는 어렵고도 쉽게 자신의 형태에 의해 식별되지 함께 혼합된 있습니다. 그러므로, 그것은 특정 신경 세포 유형의 유전자 발현을 분석하는 것이 어렵습니다. 여기서 우리는 상당한 nigra의 신경 세포의 다른 유형의 프로파일 mRNA 표현에 단일 셀 리버스 전사 중합 효소의 연쇄 반응 (scRT - PCR)과 전체 세포 패치 클램프 녹음 기술을 결합하여 절차를 문서. Electrophysiological 기법 먼저 각 뉴런의 neurophysiological과 기능적 속성을 기록하는 데 사용됩니다. 그런 다음, 단일 electrophysiologically 특징 nigral 뉴런의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 수용체 및 이온 채널에 대한 mRNA 발현 프로파일을 얻기 위해 scRT - PCR 분석의 대상이됩니다. 높은 선택성 및 감도는 immunohistochemistry 인해 적절한 항체 또는 단백질의 낮은 표현 수준의 부족으로 사용할 수 없습니다 때이 방법은 특히 유용합니다. 이 방법은 다른 뇌 영역에서 뉴런에 적용됩니다.

프로토콜

1. 뇌 슬라이스 준비

1. 영은 (15-40일 세) 남성과 스프 - Dawley 쥐의 여성이 사용됩니다. (우리는 또한 생쥐에서이 같은 프로토콜을 사용합니다.) 깊이 우레탄 마취, 동물은 참수되고 머리가 빨리 밖으로 해부하는 것입니다. substantia nigra의 midrostral 일부를 포함하는 다음 300 μm의 두께 코로나 뇌 조각은 Leica vibratome (VT - 1200S)에 절단됩니다. 220 자당, 2.5 KCl, 1.25 아니 ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 0.5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 D - 절차를 절단 슬라이스는 (MM)를 포함하는 솔루션을 절단 얼음처럼 차가운, 산소 높은 자당에서 수행됩니다 포도당. 그것은 95% 산소 유지하고 7.4의 산도를 유지하기 위해 O _{5분의 2} %의 CO _2의 혼합물과 함께 부풀어 오른 모양이다. 절단 솔루션 얼음처럼 차가운 절차를 통해 유지.
2. 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 아니 ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2.5 CaCl _2, 1.3 MgCl _2, 10 : 뇌 조각이 들어있는 산소 인공 뇌척수 (aCSF) (MM)를 가득 배양 챔버에 incubated 아르 D - 글루코오스. 그것은 95% 산소 유지하고 7.4의 산도를 유지하기 위해 O _{5분의 2} %의 CO _2의 혼합물과 함께 부풀어 오른 모양이다. 부화 온도는 뇌 슬라이스가 녹화 실로 전송됩니다 ° C 45 분 후 실온에서 34까지입니다.

2. nigral 뉴런의 Electrophysiological 지문

1. 한 뇌 슬라이스는 지속적으로 32에서 산소 aCSF와 perfused 패치 클램프 녹음 챔버 ° C.로 전송됩니다
2. 패치 pipettes은 autoclaved borosilicate (KG - 33) PC - 10 풀러을 (Narishige, 도쿄, 일본)를 사용하여 유리 모세관 튜브 (1.10 mm의 ID, 1.65 mm OD, 킹 정밀 유리, Claremont, CA)에서 가져온 및 세포내 솔루션으로 가득 차 있습니다 DNase - RNase가없는 물 (피셔 과학) (135 MM KCl, 0.5 MM EGTA, 10 HEPES MM, 1.5 MM MgCl _2, 7.3로 조정 산도를 포함)를 준비했습니다. 패치 pipettes이 욕탕에 MΩ 2-3의 resistances 있습니다.
3. substantia nigra은 그 뚜렷한 해부 학적 위치 (그림 1A1 - 2)에 따라 식별됩니다. Nomarski 광학과 substantia nigra 갈 거예요 compacta (SNc)와 substantia nigra에서 60X 물 침지 렌즈, 대형 전지가 장착된 비디오 현미경 (올림푸스 BX51W1)의 영상지도하에 (SNR) (가능한 DA의 뉴런과 GABA 뉴런) reticulata 선택 갈 거예요 녹음. 기존 기가 - 옴 시일 전체 셀 구성은 (그림 1B1) 얻습니다. 현재 클램프 및 전압 클램프 분석을 수행할 수 있습니다. mRNA 저하를 최소화하기 위해, electrophysiological 녹화 (≤ 5 분) 간단한해야합니다. 한 옵션은 관심의 뉴런 (그림 B2 - 3)에 대한 electrophysiological 지문을 제공하기 위해서만 멤브레인 및 요동 치고 속성을 기록하는 것입니다. 이 간단한 녹음은 약 1 분 정도 소요됩니다.

3. 세포질의 흡인

1. SNR GABA와 DA의 뉴런의 electrophysiological 지문 및 특성 후, 부드러운 입 흡입은 세포질을 대기음에 적용됩니다. 세포 핵은 또한 게놈 DNA 오염의 결과, aspirated 수 있습니다. 시일이 고장해서는 안됩니다; mRNA를 포함하여 별도로 세포 잔해가 패치 피펫으로 빨려 및 셀 내용을 오염시킬 수 있습니다. 시일의 무결성은 -70 뮤직 비디오에서 개최 전류의 증가만큼 좋은 것은 100 PA를 초과하지 않습니다.
2. 다음 aspirated 셀 내용은 피펫 팁 및 작은 긍정적인 압력을 깨는하여 0.2 ML PCR 튜브에 퇴학입니다. 하나의 셀 내용 한 PCR 튜브에 수집됩니다. 셀 내용을 접수 후, 수집 PCR 튜브는 얼음에 사전 냉각 즉시 -20 ° C의 냉동고에 배치됩니다.
3. mRNAs를 포함할 수 있습니다 세포 파편의 오염을 배제하기 위해 패치 피펫 실제로 세포질을 aspirating 않고 조직에 져서 다음 피펫의 내용은 RT - PCR를 받게됩니다.

4. 역방향 전사 (RT)

1. 일반적으로 뉴런 10-20의 합리적인 숫자의 셀 내용을 수집 후, RT는 mRNAs의 저하를 최소화하기 위해 즉시 시작합니다.
2. 하나의 신경 세포에서 세포 콘텐츠의 수량이 너무 작은이기 때문에 RNA 분리 절차가 수행되지 않습니다. 잠재적인 오염 게놈 DNA를 제거하려면 aspirated 셀 내용을 먼저 DNase I (5 μL DNase I 1.6 μL DNase I 버퍼, 25시 5 분 ° C)에 의해 소화 수 있습니다. 다음 DNase가 나는 1.2 μL 25 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 5 분 75 ° C를 잠복기에 의해 inactivated입니다.
3. cDNA는 윗첨자 III 리버스 transcriptase 기반 전지 - 직접 cDNA 합성 키트 (Invitrogen, 표 1)를 사용하여 합성 수 있습니다. cDNA 첫 번째 가닥은 50에서 합성됩니다 ° 50 분 C는 다음 반응 ° 5 분 1 μL RNase H에 대한 C 추가됩니다 85에서 부화하여 inactivated입니다에드는 mRNA (37 ° C 20 분)를 소화합니다. 단일 좌초 cDNA는 나중에 PCR 증폭을위한 -20 ° C에 저장됩니다.
4. 게놈 DNA의 완전한 제거는 모든 다른 반응 구성 요소가 똑같은 동안 역방향 transcriptase가 생략되는 RT - 마이너스 컨트롤에 의해 확인됩니다.

5. 두 단계 PCR 증폭

1. Primers는 GenBank의 순서에 따라 설계되었습니다. 가능하다면, 인트론 - 스패닝 프라이머 쌍은 도움이 게놈 DNA의 오염을 감지 것을 사용 하였다. 프라이머 쌍 시퀀스는 표 2에 나열되어 있습니다. 프라이머 쌍의 효과는 처음에는 긍정적인 제품을 항복 전체 뇌 mRNAs에 의해 검증되어야합니다. 모든 primers는 통합 DNA 기술 (Coralville, 아이오와, 미국)에 의해 합성됩니다.
2. 첫 번째 단계에서 30 μL cDNAs 5 μL는 프라이머 쌍 (표 2)의 존재에 35 사이클에 대한 증폭됩니다. 열 자전거 타는 사람의 열 사이클링 프로토콜 (MasterCycler, Eppendorf, 표 1), 94 ° 초기 변성에 대한 C, 94 15 s의 35주기 ° C 변성으로, 55에서 30의는 ° C는 어닐링에 2 분입니다 72 45의 ° C는 최종 확장 7 분 뒤에, 연장. DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) 및 PCR 증폭에 필요한 다른 모든 구성 요소 PCR 슈퍼 믹스 (Invitrogen, 표 1)에 의해 제공됩니다
3. 두 번째 단계 PCR에서 1 ^{일 무대} PCR 증폭에서 1 μL의 제품은 템플릿으로 사용되며, 첫 번째 단계에서 사용되는 동일한 프라이머 쌍은 (표 2)이 사용됩니다. 40주기가 30 단축 연장 시간에 실행됩니다 S. 동일한 PCR 슈퍼 믹스가 사용됩니다.
4. 2 ^{차 단계의} 증폭에서 PCR 제품은 2.5 % 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분리되며, 자외선 아래에서 ethidium 브로마이드 (0.05 mg/100 ML 젤) 또는 gelgreen에 의해 시각, 그리고 (B4 그림) 사진. 긍정적인 밴드 그러면 그만 있으며, Qiagen 추출 키트 (표 1) 및 합성을 사용하여 추출하고, 대상 유전자의 게시된 시퀀스와 비교.

6. 대표 결과 :

substantia nigra compacta 갈 거예요 및 reticulata 갈 거예요 그리고 substantia nigra의 인근 GABA 프로젝션 뉴런에서 도파민 (DA) 뉴런은 reticulata을 별도로 electrophysiological 특성 (.; 땡 외 2011. 만주국 외 2006)가 갈 거예요. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 1B2는 SNR GABA의 신경은 10 Hz에서 주위에 고주파 자발적인 급상승을 나타냅니다. 스파이크 1 MS 주위 기본 기간이 있습니다. 현재 주사를 hyperpolarizing되면, SNR GABA의 뉴런이 신경에 전류 I _H (그림 1B2)의 약한 표현을 나타내는, 현재 주사를 hyperpolarizing에 대한 응답으로 약한 depolarizing 천칭자리를 표시합니다. 반면, nigral 검찰의 뉴런 (2 Hz에서 약 3) MS 주위 기본 기간을 가지고 자발적인 스파이크를 낮은 주파수를 나타냅니다. DA의 뉴런은 또한 I _H 전류 (그림 1B3) (..; 땡 외 2,011 만주국 외 2006)의 강한 표현을 나타내는, 현재 주사를 hyperpolarizing에 대한 응답으로 발음 천칭자리을 보여줍니다.

scRT - PCR은 electrophysiologically 식별 SNR GABA 뉴런에서 glutamic 산성 탈카복실화효소 1 (GAD1, GABA의 신경에 대한 GABA 합성 및 마커에 대한 핵심 효소)에 대한 mRNA를 감지하지만 DA 뉴런 (그림 1B4, 5) 인치 반면, scRT - PCR은 electrophysiologically 식별 SNc 및 SNR DA의 뉴런에서 (검찰의 뉴런에 대한 도파민 합성 및 마커에 대한 TH, 주요 효소) 티로신 hydroxylase에 대한 mRNA를 감지하지만, GABA 뉴런 (그림 1B4, 5) 인치 따라서 scRT - PCR 결과는 electrophysiological 신경 세포 식별을 확인합니다. 다음 scRT - PCR은 전압 - 활성 Kv3 채널 subunits, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4의 표현을 프로필에 사용되었습니다. 이러한 subunits 전압 - 문이 K를 형성에 기여할 ⁺ subunit 구성 (땡 외. 2011)에 따라 다양한 속성의 채널. 예제에서는 SNR GABA 신경 세포는 그림에 표시됩니다. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4에 대한 1B4, mRNAs가 발견되었습니다. 예제에서는 SNR DA 뉴런은 Fig.1B5에 표시된 Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4가 발견되었습니다. 우리 풀링 데이터, Kv3.1 더 자주 빨리 급상승 SNR GABA 뉴런 (땡 외. 2011)에서 Kv3.1의 높은 표현 수준을 나타내는 nigral DA의 뉴런에 비해 SNR GABA의 신경에서 발견되었다.

그림 1. SNR GABA 신경 및 nigral 검찰 뉴런의 Electrophysiological 식별 :.. nigral 영역이 자신의 독특한 해부 학적 위치에 의해 확인할 수 있습니다 A1은 1X 목적으로 촬영한 코로나 Nissl 묻은 부분에 SNc와 SNR의 위치를 보여줍니다. 박스 영역 captur되었습니다10X 객관적이고 중간에 표시와 에드는 화살표로 표시. 셀 - 풍부한 SNc 및 셀 - 가난한 SNR은 분명히 볼 수 있습니다. A2는 4X 목적으로 캡처 라이브, 흠없는 코로나 섹션에서 SNc와 SNR의 위치를 보여줍니다. 셀 - 풍부한 SNc 및 셀 - 가난한 SNR은 또한 분명하게 식별됩니다. VTA, 복부 tegmental 지역. B1은 전체 세포 모드로 고정되어 SNR GABA 신경 세포되는 패치를 보여줍니다. B2 현재 클램프 녹음 모드에서 SNR GABA의 신경의 전형적인 electrophysiological 속성을 보여줍니다. 이러한 뉴런 화재 자연 고주파 액션 짧은 기간의 잠재력과 현재 주사를 hyperpolarizing에 약한 나 _H - 중재 천칭자리 응답을했습니다. B3 현재 클램프 녹음 모드에서 nigral DA의 뉴런의 전형적인 electrophysiological 속성을 보여줍니다. 그들은 오랜 기간의 자연 저주파 행동 잠재력을 해고하고 눈에 잘 띄는 I _H - 중재 천칭자리 (화살표 머리) 현재 주사를 hyperpolarizing에 대응되어 있습니다. 따라서 SNR GABA의 뉴런과 뉴런 nigral 도파민의 명확. electrophysiologically 확인 B4은 electrophysiological 확인 SNR GABA 신경 세포에서 scRT - PCR 제품의 젤 사진을 보여줍 있습니다. 글루 탐 산염 탈카복실화효소 1 (GAD1)​​ mRNA 있지만 티로신 hydroxylase (TH) mRNA가 검출되었다. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4에 대한 mRNAs이 SNR GABA 신경 세포에서 발견되었습니다. B5는 SNR DA 신경 세포에의 연결을 Kv3 채널 mRNAs의 scRT - PCR 검출을 보여줍니다. 회 mRNA 있지만 GAD1의 mRNA는 electrophysiologically 확인 SNR DA 신경 세포에서 발견되었다. Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4에 대한 mRNAs이 SNR DA 뉴런. B6 풀링된 데이터를 보여줍니다에서 발견되었습니다.

7. 잠재적인 거짓 부정과 거짓 긍정적인 결과

경험을 바탕으로 여러 가지 요인이 허위 부정 scRT - PCR 결과를 초래할 수 있습니다. 이러한 요인 피펫 팁 막히는, RNase의 오염, 그리고 비효율적인 PCR primers의 패치로 인해 세포질의 충분한 양의 aspirating에 실패를 포함합니다. 패치 피펫 팁 괴롭히는은 일반적으로 비디오 모니터에 볼 수 증가와 접속 저항로 표시하실 수 있습니다. RNase 오염은 철저한 해제 및 착용 장갑에 의해 피할 수 있습니다. PCR 프라이머의 효과가 뇌 조직을 펀치에서 총 RNA를 사용하여 테스트해야합니다 (. 만주국 외 2008;. 딩 외 2011).

우리가 항상 먼저 RT 전에 우리 샘플을 치료하기 위해 DNase를 사용하여 이후, 우리는 거짓 긍정적인 결과가 발생하지 않았습니다. 이론적으로, DNase를 소화하지 않고, 게놈 DNA의 오염 때문에 유전자가 intronless 또는 뇌관 쌍을 때 false로 긍정적인 감지가 발생할 수 있습니다는 인트론 지역에 걸쳐되지 않습니다.

토론

scRT - PCR과 뇌 슬라이스의 패치 클램프 녹음의 조합은 우리가 여기 이온 채널, 수용체, 그리고 개별적 특징 뉴런의 신경 전달 물질 합성을위한 핵심 효소에 대한 mRNA 발현 프로파일을 조사하는 훌륭한 방법을 제공 보여주었다. (; 만주국 외 2009.. Surmeier 외 1996) 문제의 단백질이 발견과 같은 낮은 표현 수준 및 / 또는 적절한 항체의 부족으로 인해 immunohistochemistry 같은 다른 방법을 사용하여 현지 수없...

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