인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

요약

췌장과 같은 progenitors은 인슐린을 표현 식민지로 차별화할 수있는 3 차원 clonogenic 분석이 설명되어 있습니다. 이 방법은 메틸 셀룰로오스, Matrigel 및 성장 요인을 포함하는 반 고체의 미디어 활용,하는 하나의 progenitors는 분아 따위에 의해 중식과 차별 체외에서 인구의 기능 progenitors의 수를 부량를 허용.

초록

췌장 줄기 및 전구 세포 생물학 분야는 단일 세포의 분석을 위해 허용 체외 기능 및 정량 assays에의 부족에 의해 방해되었다. 그들은 명백하게 개별 progenitors의 혈통 잠재력을 증명하는 확실한 방법을 제공하기 때문에 단일 progenitors의 분석 매우 중요 있습니다. 방법은 하나의 세포에서 서스펜션 문화 "pancreatospheres"을 생성 고안되어 있지만, 몇 가지 제한이 존재합니다. 첫째, 단일 셀 전지의 대규모 번호를 증착, 회전 명령의 문화 매체와 공간의 대량.을 수행하려면 시간이 많이 소요됩니다 결과 pancreatospheres의 둘째, 세는 법은 pancreatosphere - 시작 progenitors의 빈도가 낮은 특히, 노동 집약이다. 셋째, pancreatosphere 분석을 다시 같은 문화의 확산과 췌장 progenitors의 차별이 모두 잘 수 있도록 효율적인 방법은 아닙니다분석의 유용성을 stricting.

이러한 한계를 극복하기 위해 췌장 progenitors을위한 세미 솔리드 미디어 기반의 식민지 분석이 개발되었고이 보고서에 표시됩니다. 이 방법은 그들이 확산뿐만 아니라 차별을 받다으로 전구 세포가 3 차원 공간에 머물 수 있도록 메틸 셀룰로오스가 언론에 점도를 제공하는 데 사용되는 조혈 식민지 분석에서 기존의 개념을 활용합니다. 풍성하게하기 위해 인슐린을 표현하는 이질적인 인구에서 progenitors을 식민지를 형성, 우리는 세포를 이용 것을 표현 neurogenin (NGN) 3, 췌장 내분비 전구 세포 마커. Murine 배아 줄기 (ES)는 향상된 녹색 형광 단백질 기자와 태그 Ngn3 표현 세포가 정렬되었습니다 잘 따라 많은 25,000으로 세포가 낮은 첨부 24 - 물론 문화 요리에 도금되었다 셀 - 파생. 다음과 같은 주요 구성 요소와 세미 솔리드 미디어의 각 잘 포함된 500 μL가 : 만났다hylcellulose, Matrigel, 니코틴, exendin - 4, activin βB 및 시설 언론 murine ES 세포 - 유래 췌장 같은 세포에서 수집했습니다. 문화의 8~12일 후, 인슐린은 - 표현 특유의 형태로 식민지 것은 형성되었으며 추가로 각 식민지의 혈통 구성을 결정하는 정량 RT - PCR과 immunoflourescent 염색법을 사용하여 췌장 유전자 표현 분석 수 있습니다.

요약 우리의 식민지 분석 쉽게 감지 및 세포의 이질적인 인구 내에서 기능 progenitors의 부량 수 있습니다. 또한, 반 고체 미디어 형식은 체외에서 세포 분열 따위에 의해 번식하고 차별화하는 데 progenitors을 활성화, 세포 세포외 기질 구성 요소와 성장 요인 유니폼 프레 젠 테이션을하실 수 있습니다. 이 식민지 분석은 단일 세포 수준에서 췌장 전구 세포의 기계론의 연구에 대한 독특한 기회를 제공합니다.

프로토콜

1. 체외에서 췌장과 같은 세포로 murine ES 세포의 차별은 식민지 분석을위한 에어컨 미디어 (CM)를 생성

murine ES 세포 유지 보수 절차는 더욱 차별 화를위한 서스펜션 문화, 첨부 파일 문화 embryoid 바디 (EB) 형성은 이전에 설명한 ^1-3이 보고서의 초점이되지 않습니다있다. 우리 차별화 프로토콜에 관련된 단계의 구조 프레 젠 테이션은 그림 1에 표시됩니다.

고품질 에어컨 미디어를 얻기 위해서는, 먼저 그들의 최소한 30-40% 적어도 150 μm의 직경의와 함께하는 6 일 된 EBS를 생성하는 것이 중요합니다. 큰 EBS는 향상된 차별화 (그림 2)를 제안 빛을 현미경으로 어두운 장소를 포함해야합니다. 고품질 소태아 혈청 (FCS)의 선택은 EBS를 생성하기 위해 중요합니다. 고품질 FCS의 제비는 differentiat을 지원하기 위해 자신의 능력에 따라 선택됩니다인슐린 1, 글루카곤과 이후 단계에서 아밀라아제의 2A의 유전자 발현 (일 18-20)으로 RT - PCR 분석에 의해 감지 대한 EBS의 이온. 그것은 부드럽게 우물의 중심에 하루 - 6 EBS를 수집 접시를 회전하는 것이 중요합니다 - 또한, 하루 - 6 EBS가 서스펜션 문화 첨부 파일 문화 (6 잘 접시에 잘 당 100 EBS 약 80)으로 전송됩니다. 이후 첨부 파일 문화 단계에 EBS에서 췌장과 같은 세포의 더 나은 발전에 세포 세포 연락처 결과를 향상 이유로 알려지지 않은, 연습하십시오.

1. 문화의 날 13 일, 새로운 첨부 파일 문화와 첨부 파일 문화 미디어 (DMEM/F-12 (1:1), 15 % 녹아웃 혈청 교체, 2 MM L - 글루타민, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML 스트렙토 마이신) 대체 미디어 containing10의 MM의 니코틴, 0.1 NM exendin - 4, 10 NG / ML 인간 재조합 activin ßB (모든 농도는 최종됩니다.)
2. 문화의 날 16 단계 1.1에서 미디어를 수집하고 0.2 μm의 polyethers를 통해 필터ulfone 막. 이 시점에서 수집된 미디어 에어컨 미디어 (CM)라고도한다. 나누어지는가 15 ML 팔콘 튜브로 CM과 -80에서 저장 ° C까지 (아래 3 항 참조) 반 고체 문화 직전.

2. 형광 활성 세포 분류기를 사용하여 단일 세포 현탁액에서 progenitors 췌장과 같은 구하기

노크 -에서 murine ES 세포 라인, ⁴ EGFP의 리포터 유전자가 Ngn3의 현장 중 한 allele는 이전에 설명한 ^2. Ngn3가 기본 포함 나선 루프 - 나선 (bHLH) 전사 인자로서 차별화된되었습니다 교체 Ngn3 - EGFP로 지정 . 개발 기간 동안 췌장 내분비 progenitors에 의해 표현 ⁵ 일 16 문화가 일반적으로 차별 Ngn3 - EGFP ^+와 Ngn3 - EGFP 얻기 위해 정렬되었습니다 ^-. 셀을 ^1,2

1. 단일 세포 현탁액으로 차별화된 세포의 분해.
   1. 부화 일 - 16 문화 WI일 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (3 분 37 ° C)는 문화 우물에서 세포를 이동시키다 수 있습니다.
   2. 트립신의 활동을 중지 10 % FCS를 추가합니다.
   3. 마그네슘과 칼슘 무료로 세포를 씻어 인산 버퍼 식염수 (PBS)가 5 분 300 XG의 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 원심 분리기를 포함.
   4. 뜨는 제거하고 단일 세포 현탁액을 만들어 4 MG / ML collagenase B 및 2000 U / ML deoxyribonuclease (DNase) I (30 분, 37 ° C)와 세포 대단히 짧은 시간을 품다. 세포 펠렛에게 분해 과정을 촉진하기 위해 매 10 분 혼란 1000 μL 피펫을 사용합니다.
   5. PBS는 0.1 % BSA가 포함된로 세포를 씻어하고, 5 분 300 XG에 원심 분리기.
   6. 뜨는 제거하고 0.1 % BSA가 포함된 PBS에있는 세포를 resuspend.
2. 분류에 대한 세포의 준비.
   1. 정렬하는 동안 세포 reaggregation을 방지하기 위해 모든 ML 세포 현탁액 2 μL DNase I (1 MU / ML) 추가합니다.
   2. 40-70 μm의의 m 통해 단일 ​​세포 현탁액을 전달대형 세포 집계를 제거하는 esh.
   3. 단일 세포 현탁액에 DAPI (1 μg / ML 최종 농도) 추가합니다.
   4. 세포 분류기에서 유동세포계측법 데이터를 수집. MoFlo MLS (베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날) 세포 분류기는이 보고서를 위해 사용되었다.
   5. 정렬을위한 세포 인구의 게이팅. Ngn3 - EGFP ^+와 Ngn3 - EGFP ^- 전지 앞으로 산란 대 측면 뿌리 처음에 문이 아르 (그림 3A), DAPI 대 사이드 분산형 (그림 3B), 펄스 폭 대 사이드 분산형 (그림 3C)에 의해 다음, 그리고 마지막으로 FL1 대 자동 형광 (그림 3D). 정렬하는 동안 세포 ^- Ngn3 - EGFP의 오염을 제한하기 위해, Ngn3 - EGFP의 최종 정렬 게이트는 ⁺ 세포는 의도적으로 오른쪽 (화살표 그림 3E)로 이동합니다. Ngn3 - EGFP ES 라인이나 같은 무대, 일 - 16 문화 등 TL1의 ES 세포 (그림 3D, 왼쪽 패널)와 같은 비 - 유전자 변형 라인에서 사용할 수에서 부정적인 제어 게이팅 들어, 중 일 - 6 EBS.
3. 정렬 Ngn3 - EGFP ^+와 Ngn3 - EGFP ^{- 세포.}

3. 세미 솔리드 문화 도금 정렬 셀

1. Matrigel 준비.
   1. 1 관 당 ML 및 사용하기 전에 -20 ° C에서 저장하는 나누어지는 Matrigel.
   2. 냉동 aliquots 4에 배치해야 ° 사용하기 직전 해동 3 시간 C 하룻밤 또는 얼음. 해동 aliquots는 resolidification을 피하​​기 위해 반 고체 문화 준비하는 동안 얼음에 남아 있어야합니다.
2. 메틸 셀룰로오스 용액 (3.3 %) 준비.
   메틸 셀룰로오스 파우더가 autoclaved 수 없습니다. 세균없는 메틸 셀룰로오스 솔루션을 얻기 위해서는, 준비 과정에서 깨끗한 무게 보트 autoclaved 볶음 바, 비커, flasks 및 기타 하드웨어를 사용합니다.
   1. 메틸 셀룰로오스 용액 준비하기 전에 어느 날, 4 멸균 증류수의 이중 저장 ML 200 ° C. 또한, 2X 500 ML 100 U / ML 페니실린을 포함 DMEM/F12 미디어 (에 가루 DMEM / F - 12를 분해하여 준비 증류수를 두 배로) 준비4 100 μg / ML 스트렙토 마이신 및 저장 ° C.
   2. 메틸 셀룰로오스 준비의 날, 위에 알루미늄 호일의 조각과 함께 1000 ML 유리 비커에 멸균 증류수 이중 500 ML를 추가합니다. 공기 방울의 물을 제거하기 위해 적어도 30 분 끓여.
   3. 2000 ML 유리 플라스크로 대형 저어 바 (길이 적어도 3 인치) 놓습니다.
   4. 끓는 물에 300 ML을 측정하고 술병에 전송할 수 있습니다.
   5. 저어 접시 (난방없이)에있는 술병을 놓습니다. 천천히 공기 방울을 생성하지 않도록 뜨거운 물을 저어.
   6. 메틸 셀룰로오스 분말의 33g의 무게를 매우 천천히 온수에 추가합니다. 온수 효율적으로 메틸 셀룰로오스 분말을 습식 및 차가운 온도의 후속 해체를 돕기 위해 필요합니다.
   7. 온도가 약 40-45로 감소 때까지 가루 저어 계속 ° C.
   8. 냉각 메틸 셀룰로오스의 혼합물로 200 ML 추위 멸균 두 번 증류수를 추가합니다. 바로후, 그 메틸 셀룰로오스가 수성 단계에 녹아있다는 것을 나타내는, 솔루션은 투명하고 점성 돌아 볼 수 시작합니다. 솔루션을 보장하기 위해 손 소용돌이 술병이 철저하게 혼합됩니다.
   9. 500 ML 추위 2X DMEM/F12 미디어를 추가합니다. 섞어 손으로 소용돌이로 진행합니다.
   10. 추운 방에 저어 접시에 술병을 놓고 천천히 24-48시간에 대한 메틸 셀룰로오스 솔루션을 저어.
   11. 125 저장 병 당 ML, 그리고 -20 ° C.에 가게로 나누어지는 솔루션을 샘플 멸균 petridish에 적절하고 ° C 배양기가 불임을 테스트하는 37에 배치해야합니다. 해동 메틸 셀룰로오스 솔루션은 최대 2 개월까지 냉장고에 보관하실 수 있습니다.
3. 에어컨 미디어 준비.
   해동의 CM은 (제 1 항 참조) 직전 사용할 수 있습니다. 세미 솔리드 문화 준비 전반에 걸쳐 얼음 CM 보관하십시오.
4. 다음과 같은 성장 요인을 준비 : 1.0 M 니코틴, 0.1 μm의 exendin - 4, 10 μg / ML 재조합 인간 activin βB, 10 & M을U, G / ML VEGF - A. ° C와 activin βB 및 VEGF - A -80 ° C에서가을 -20에서 니코틴과 exendin - 4를 저장하고, 사용하기 전에 즉시 해동. 모든 세미 솔리드 문화 미디어 구성 요소는 도금 동안 얼음에 보관해야합니다. 그 문제는 또한 VEGF - A는 나중에 식민지 형성에 필요한 찾을 수 없습니다라고 언급해야합니다 ^2.
5. 소태아 혈청 준비. FCS는 사용하기 전에 inactivated 열이 있어야합니다. 56시 30 분 FCS를 품어 ° C 보완 단백질을 inactivate하는 물 목욕 인치 초기 FCS 주식 병은 500 명 이상의 ML에 나누어지는 그 125 ML의 튜브로를 보유하고있는 경우. 증가 표면적은 전체 볼륨도 철저한 난방을 보장합니다. -20 ° C.에 저장하기 전에 병은 최소 1 시간 동안 상온에서 냉각 허용 해동 FCS는 0.2μm 사용하기 전에 필터링합니다.
6. 정렬 세포와 문화 구성 요소를 섞는다.
   의 응고를 방지하기 위해 항상 준비하는 동안 얼음에있는 세포와 모든 반 고체 미디어 구성 요소를 유지Matrigel. 를 포함하여 Matrigel 접촉 모든 소모품은 피펫 팁, 주사기와 바늘은 추운해야합니다. 사용하기 전에 -20 ° C 최소 절반 시속이 물품을 넣으십시오.
   1. 24 - 잘 플레이트에 따라 잘 씨앗으로 세포의 수량을 결정합니다. 최대 25,000 셀에 24 - 잘 따라 도금 수 있습니다. 하나는 최적의 시딩의 휴대폰 번호를 결정하는 초기 실험에서 세포 밀도의 적정을 수행할 수 있습니다.
   2. 표 1에서 설명한 순서에 스냅 캡 (세포가 조기 자극을 피하기 위해 마지막으로 추가됩니다)와 5 ML의 폴리스티렌 관에 문화 구성 요소를 추가합니다. 먼저 폴리스티렌 튜브에 3.3 % 메틸 셀룰로오스를 추가하고 정렬 세포가 마지막. 3.3 % 메틸 셀룰로오스 솔루션 수립하고 16 ½ 바늘과 적절하게 표시된 졸업 주사기로 폴리스티렌 튜브에 추가되어야합니다. 일반적으로, 순서대로 정확하게 같은 3.3 % 메틸 셀룰로오스 솔 같은 점성 솔루션의 볼륨을 측정하는ution 및 최종 문화 혼합은, 그것은 먼저 주사기의 일부 솔루션을 기음하는 것이 중요하고 즉시 공기를 추방하기 위해 솔루션을 밀어. 그것이 밖으로 그리기 너무 어려운 경우 3.3 % 메틸 셀룰로오스 용액은 실온에 예열 수 있습니다. 그러나, 그것은 폴리스티렌 튜브로와 Matrigel의 추가되기 전에 적절 후 그것이 얼음에 냉각 있는지 확인하십시오.
7. 정렬 세포를 포함하는 반 고체 미디어 판.
   1. 폴리스티렌 튜브의 뚜껑을 확인한 후 단단히 자리에 있으며, 적극적으로 그리고 철저하게 손으로 튜브를 흔들. 공기 방울이 과정에서 생성됩니다.
   2. 5 분 얼음이나 작은 기포 표면까지 튜브를 놓습니다.
   3. 내용을 대기음에 16 ½이나 18시 - 게이지 바늘로 1mL 주사기를 사용합니다. 주사기에 공기없이 점성 용액의 정확한 볼륨을 그릴 3.6.2의 조언을 따르십시오.
   4. 천천히 각 24 우물에 미디어 500 UL 하는걸. 사용오직 낮은 첨부 파일 24 잘 번호판입니다. 물론 중앙에 직접 미디어를 추가합니다. 세미 솔리드 미디어가 자동으로 우물에서 보급합니다. 각 실험 샘플을 보려면 quadruplicated 우물은 정기적으로 통계적으로 의미있는 결과를 얻기 위해 사용됩니다. 단지 가로 방향으로 24 잘 판의 4 내면 열은 문화에 사용됩니다. 세포 함유 문화의 가습을 돕기 위해 멸균 물을 남아있는 우물을 입력합니다.
   5. 37 ° C와 5% CO ₂ 공기에있는 세포를 품어.
   6. 성장 요인의 추가 지연됩니다. 문화의 개시 이후에 성장 요소를 추가할 수도 있습니다. 이러한 전술은 특정 성장 요인의 생존 효과를 주소로 사용할 수 있습니다. 물론 당 100 μL에 성장 인자 솔루션은 최대 26 G 팔분의 삼 바늘로 1 ML의 주사기를 통해 병뚜껑 틈에다 떨어뜨린하고 반 고체 미디어로 확산 수 있습니다.

4. 빛을 마이크로하에 식민지 형성을 관찰대처하다

전지는 하나의 세포가 무작위로하고 균일하게 우물 밖으로 걸쳐 분산되도록 즉시 도금 후 관찰한다. 세포 또는 결과 식민지의 대부분은 우물의 여백에서 배포하는 경우,이 우물에 반 고체 매체를 분배하면 (섹션 3.7.4 참조)도 강력한 것을 나타냅니다. 문화 우물의 가장자리에있는 초승달 모양 효과 식민지 밀도로 인해 중앙에 거주하는 사람에 비해 높을 수 있습니다.

1. 식민지 번호 부량. 매체의 3 차원 기능으로 인해, 식민지는 다른 초점 포인트에 나타납니다. 따라서, 각 식민지에 대한 초점 조정 조명 현미경으로 관찰하는 동안 필요할 수 있습니다. 두 번 같은 식민지를 등록하지 않도록하기 위해 계산하면 24 잘 미만의 격자를 연결합니다. 그리드는 NUNC petridish (Cat. No.169558)의 벽을 절단하여 얻을 수 있습니다. 가벼운 현미경에 10X 객관적인 렌즈가 obs하는 데 사용해야합니다erve과 식민지를 계산합니다.

5. 대표 결과 :

이전 실험 2.5 × 10 ⁵ murine R1 ES 세포 (50 ML 미디어 총)로 시작 하나가 약 5,000 적절한 크기의 일 - 6 EBS를 생성할 것으로 예상 수 표시했다. Ngn3 - EGFP ES 세포는 덜 효율적 있었다, 4 배 이상 세포는 일 6 유사한 크기의 EBS를 생성하는 데 필요한되었습니다. 25일 - 6 EBS는 1.88의 평균을 포함하기 때문에 ± 0.67도 × 10 ⁵ 세포, ¹ 약 37.6 X 10 ⁶ 전지는 5000 EBS에서 얻을 수 있습니다. 첨부 파일 문화 동안 세포는 2.72 ± 0.32 배 확대 예정입니다. ¹ 따라서 5,000일 - 6 EBS가 정렬되기 전에 약 100 × 10 ^육일 - 16 세포를 얻을 것입니다. 게이팅 후 Ngn3 - EGFP ⁺ 세포는 총 일 - 16 세포 인구 (프로토콜 텍스트 섹션 2.2.5 및 그림 3)의 약 10 %를하겠습니다.

photomicrogr의 예murine ES 세포에서 유래 인슐린 표현 식민지의 aphs는 그림 4에 표시됩니다. 이 식민지는 독특​​한 형태를 가지고, 작은 어둠, 그리고 빛 반사되지 않은 식민지의 개별 세포와 소형 (~ 60-100 μm의) 둥근 식민지. 이전 발행물에 ² 실시간 RT - PCR과 개별적으로 손으로 수확하고 식민지의 두 immunofluorescent 얼룩은 인슐린의 표현, C - 펩타이드 및 글루카곤을 공개했다. 이러한 결과는 내분비 세포와 같은 원시적인 첫 파도를 닮은, 동시에 적어도 두 섬 호르몬을 포함하는 세포로 차별화하는 데 하나의 Ngn3 - EGFP ⁺ 세포의 능력을 보여줍니다.

분산 단일 세포에 대한 식민지 분석이 확산하고 체외 (그림 5)에 분화를 시작하는 능력이있는 progenitors에 대한 연구를 수 있습니다. 따라서, 이것은 각각의 전구 세포의 본질적인 기능을 측정할 수있는 분석이다. capabi을 progenitors인슐린을 표현 식민지가 될 lity는 칭했다 아르 인슐린 표현 콜로니 형성 단위 (ICFUs) (그림 5). . MES 셀 - 파생 인구의 세포 ICFUs에 대한 풍부한 아르 ² 그러나 이러한 progenitors의 주파수 아직 ^- 개발 췌장에서 Ngn3 마르크 내분비 전구 세포, ⁵ Ngn3 - EGFP ^+,하지만 Ngn3 - EGFP가 없다라는 생각이 일관성있는 낮은; 일 16 문화 격리 총 Ngn3 - EGFP ⁺ 인구의 약 0.1 %로 0.6 %가 ICFUs 아르 ^2에 관계없이, 식민지 - 성형 효율성에 명확한 차이가, 최고가 다음 Ngn3 - EGFP ⁺ 세포와 예정입니다. 다음 presorted 세포, 그리고 Ngn3 - EGFP ^- 세포.

그림 1. 췌장과 같은 세포로 체외 murine ES 세포의 분화에의 타임 라인. 에어컨 미디어 (CM) 세대, murine ES cel혹시이 EBS를 생성할 수 monothioglycerol의 감소 복용 (다음 나흘 동안 첫 두 일 6.0 × 10 ^-4 M에 대해 6.0 × 10 ^-3 M)와 함께 처음으로 6 일 동안 15% FCS와 중지 재배하고 있습니다. 하루 - 6 EBS가 (물론 당 80-100) 다음 첨부 파일에 전송 6 - 물론 15 % 녹아웃 혈청 교체를 포함하는 요리. 5% FCS는 EBS의 첨부 파일을 촉진하기 위해 문화의 60-10 일 사이에 추가할 수 있습니다. 니코틴, exendin - 4, 인간 재조합 activin βB 그러면 문화의 날 13 조 (섹션 1.1 참조)에있는 미디어에 추가됩니다. 미디어는 문화의 날 16 수집이 시점에서 에어컨 미디어되고있다. 하루 16 전지는 다음 정렬 및 식민지 분석을위한 세미 솔리드 미디어로 도금입니다.

그림 2. murine 배아 줄기 세포에서 파생된 큰 일 - 6 embryoid 기관의 대표 현미경 사진. 이상적인 일 - 6 EBS는 diam에서 적어도 150 μm의 아르eter하고있다 어둡게 센터 (화살표). 초기 췌장 전구 표시 (예 : Pdx - 1과 Sox9 등)의 표현은 이러한 EBS (데이터가 표시되지 않음). ³ 향상

그림 3. MES 휴대 파생 일 16 Ngn3 - EGFP 표현 세포에 대한 게이트를 정렬. (A) 세포의 크기와 각각 세분을 나타내는 전방 측면 분산형 게이츠, 비 세포 파편을 제거합니다. (B) DAPI는 40분의 450 필터로 검색 405-413 NM 및 방출에 흥분했을 때 긍정적인 물들일 것이다 죽은 세포를 식별하는 데 사용됩니다. (C) 펄스 폭, 전자 전달 산란 펄스의 폭은 형광 활성 세포 분류기 통과되기 전에 제거되어야 doublets를 보여줍니다. EGFP의 (D) 게이트 (채널 FL1) 대 같은 TL1 (왼쪽 패널)와 같은 제어 부모 세포 라인에서 사용 autofluorescence 일 - 16 세포가 형광 진실하기 때문에 Ngn3 - EGFP를 조명 <> + 세포 인구 (오른쪽 패널)를 먹어 볼래요. (E) 적색 화살표는 거짓 긍정적인 세포의 분리를 증가 정렬하기 전에 EGFP ⁺ 게이트를 수동으로 마우스 오른쪽 단추로 이동을 보여줍니다. 둘 다 (D)와 (E) 지역에 따라 문이 아르의 이벤트 (R1 - R3)은 (AC)에 표시됩니다.

의 그림 4. 대표 photomicrographs 인슐린 표현 반 고체 문화 식민지합니다. 식민지는 임의로 배포 작은 어둠이 아닌 빛의 반사 클러스터로 나타납니다 있습니다. 개별 식민지들이 나중에 각각 RT - PCR과 immunohistochemistry 분석, (; 동영상을보고 표시되지 않음)에 의해 유전자 및 단백질 표현 assayed 수 있습니다.

그림 5. 단일 전구 세포의 기능과 양적 평가를 허용 식민지 분석. 결과 식민지의 세는 법은 주파수를 계산하는 데 사용됩니다전체 도금 세포 사이의 전구 세포 uency. 각 식민지 내에서 세포의 구성은 시작 조상의 혈통 잠재력을 나타내는 것입니다. 이 분석을 사용하여, 우리는 murine 배아 줄기 세포에서 파생된 Ngn3 - EGFP ⁺ 세포가 인슐린을 표현 식민지 - 형성 단위 (ICFUs)로 구별하는 능력이 전구 세포가 인슐린을 표현 식민지합니다. ² 농축 사실을 발견했습니다

표 1. 세미 솔리드 문화 미디어 구성 요소 및 추가의 주문.

토론

개별 췌장 progenitors의 양적 및 기능적 평가를 허용 식민지의 assays는 크게 췌장 줄기 및 전구 세포 생물학의 연구에 진전을 방해하는, 지금까지 제한하고 있습니다. 식민지 분석의 본질은 전구 세포의 기능과 혈통의 잠재력을 관찰 수 있도록, 내장 전구 세포의 능력보다는 전적으로 자신의 표현형을 측정하는 것입니다. 또한 주어진 인구 progenitors의 수를 결정할 수 있습니다 양적 도구입니다. 조혈 줄기 세포 분야에서 식민지의 assays는 식별에 중요한 역할을뿐만 아니라, 이러한 세포의 혈통의 의지를 지배하는 성장 인자 요구 사항, 상호 작용, 그리고 메커니즘을 해독했습니다. ⁶ 췌장 전구 세포 생물학, 췌장 장기 ⁷ 입력란에 ^{, 8} 또는 일괄 문화 ^9-13 고안되었습니다 그러나, 이러한 assays는 생물 학적 questi를 해결하지단일 세포 수준에서 기능. 단일 세포 분석없이, 다중 잠재적인 췌장 줄기 / progenitors의 존재는 명백하게 입증되지 않을 수 있습니다. ¹⁴

여기는 것을 보여줄 인슐린 표현 식민지 - 형성 progenitors 것은 3 차원, Matrigel 함유, 세미 솔리드 문화 시스템을 사용 assayed 수 있습니다. 서스펜션 문화 시스템 ^15,16가 분아 따위에 의해 중식 및 "pancreatospheres"로 차별화하는 데 하나의 성인 췌장 progenitors를 허용하는 개발되었습니다 있지만, 우리의 식민지 분석 추가 이점을 제공합니다. 첫째, 우리 세미 솔리드 문화 미디어 시스템은 최대 24 자 당 500 μL 문화 미디어 당 25,000 정렬 세포로의 도금 선형 범위의 결과 식민지 형성을 유지하면서. ² 대조적으로, 서스펜션 pancreatosphere 분석은 하나의 사용을 필요로 수 세포 분류기에서 전지 증착 방법은 단일 세포 분석을 허용하고, 따라서 문화 매체와 인큐베이터 공간의 큰 볼륨으로이 필요합니다. 따라서, 우리의 식민지 분석은 다른 세포의 다수가 전구 활동을 동시에 비교해야 할 때 실시하는 비교적 쉽고 비용 효과적입니다. 둘째, 우리 세미 솔리드 미디어 세포외 기질 구성 요소 및 증식과 분화가 모두 같은 잘 발생 수 성장 요인의 균일한 분포를하실 수 있습니다. 반대로, 그것은 서스펜션 문화에 세포 이러한 환경, 특히 매트릭스를 제공하기가 더 어렵습니다. 두 가지 progenitors가 무작위로 서로 양식을 한 식민지 근처에 위치 수 있으므로 우리의 방법으로 그것이 정말 로요, 각 식민지가 세포 하나에서 파생되는 것을 증명 수 없다는 것을 알고 있습니다. 그러나이 문제는 단일 세포 조작을 사용하여 보조 분석에 의해 극복할 수 있습니다. 정렬 단일 세포를 직접 손으로 따기가 정말 로요 각 식민지의 단세포 출처를 보여줍 수 있습니다.

요약에서 프로의 식민지 - 성형 활동을 인슐린을 표현반 고체 미디어 genitors 언급된 단일 세포 수준에서 췌장 progenitors의 기계론의 연구에 대한 독특한 기회를 제공합니다 설명했다. 예를 들어, 이전 보고서에서 우리는 문화에 미디어가 인슐린을 표현 세포외 매트릭스를 제안 Ngn3 - EGFP ⁺ 세포, ² 식민지 것은 형성에 필요한, Matrigel, 세포외 기질 단백질의 원유 혼합물의 추가 발견 그 progenitors 위해 중요합니다. 이 식민지 분석을 사용하여 이제 더 이상 해부하다와 같은 활동에 대한 구체적인 매트릭스 요구 사항을 정의하는 것이 가능합니다. 마우스 배아 줄기 세포에서 파생된 progenitors를 공부하는 것 외에도, 우리는 현재이 시험 관내 분석 시스템은 다른 독특한 perinatal 성인 생쥐의 췌장과 간장에서 파생된 식민지뿐만 아니라, 결여된 인간 시체 같은 췌장 조직의 형성을 지원하는지 여부를 조사하고 있습니다 islets니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
재료 / 시약	회사	카탈로그 수	댓글
1X DMEM / F - 12 (1:1)	Mediatech	15-090 - 이력서
소태아 혈청	조직 문화 체액	201	섹션을 참조하십시오 1.1
L - 글루타민	Gibco	25030-081
1X Dulbecco의 PBS	Mediatech	21-031 - 이력서
소 혈청 알부민	시그마	A8412	7.5 %
Matrigel	Becton 디킨슨	356,231	감소 성장 인자
메틸 셀룰로오스	Sinetsu 화학, 도쿄, 일본		1500 centipoise (높은 바이올렛scosity)
니코틴	시그마	N0636
사람의 재조합 Activin βB	R & D 시스템	659 - AB - 025
Exendin - 4	시그마	E7144
사람의 재조합 VEGF - A	R & D 시스템	293 - VE - 010
24 잘 접시	Costar	3473	초저 부착
60mm 페트리 접시 그리드와 함께	Nunc	169,558