애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio</em

요약

여러 발달 단계에있는 zebrafish 심장의 해부 및 격리에 대한 명확하고 표준화된 방법 설명되어 있습니다. 주석과 부량 기법도 설명합니다.

초록

Zebrafish는 배아 심장 개발 연구 (최근 리뷰 ^1-6 참조) 유익하고 실용적인 모델 생물되고있는 그러나, ^7-10을 제한되었습니다 성인 심장 개발을 통해 이후의 배아 검사 작동합니다. 성숙과 노화 마음의 변화 형태를 검사하는 것은 청소년과 어른 마음을 준비하고 분리에 사용할 기술의 부족에 의해 제한됩니다. 물고기의 수명 동안 심장 개발을 분석하기 위하여, 우리는 수많은 단계에서 zebrafish 마음을 해부하다하고 자세한 분석 ¹¹ 그들을 사진. 심장의 형태학의 기능을 쉽게 계량 할 수 있으며, 개인의 마음은 더욱 표준 방식의 호스트에 의해 분석하실 수 있습니다. Zebrafish는 변수 속도로 성장하고 성숙 물고기 성숙의 계기로 포스트 고정, 우리 사진 및 측정 물고기의 길이, 따라서, 나이보다 생선 크기가 더 연결합니다. 이 프로토콜은 30mm와 VL 1mm의 SL 또는 더 큰와 어른 100μm 뇌실 길이 (VL)의 마음으로 애벌레 3.5mm 표준 길이 (SL)에 이르기까지 zebrafish에 대한 두 개의 크기에 의존 해부 기술을, 설명합니다. 애벌레와 어른 물고기는 아주 독특한 신체와 장기의 형태 있습니다. 애벌레는 훨씬 작습되지 않습니다, 그들은 덜 안료를 각 기관은 시각적으로 파악하는 것은 매우 어렵습니다. 이러한 이유로, 우리는 뚜렷한 해부 기술을 사용합니다.

우리가 euthanization 후 직접 해부하는 마음은 다음 고정을 제거 마음에 비해 심방과 같은 매우 느슨한과 풍선과 함께,보다 변수 형태를 갖고 발견으로 우리는 사전 해부 고정 절차를 사용합니다. 물고기는 생체내의 형태와 챔버 위치 (데이터가 표시되지 않음)에 보유, 이전 절개로 고정. 또한, 데모의 목적을 위해, 우리는 심장 (심근) 특정 GFP 유전자 변형 TG (myl7 : GFP)을 활용하여 우리가 전체 마음을 시각화 수 있으며 개발 초기 단계에서 특히 유용합니다 ^{twu34 (12),} 때 심장 형태 주변 조직에서 적은 구분됩니다. 심장의 해부는 현장 하이브리드화, immunohistochemistry, RNA 추출하거나 사후 배아 zebrafish에서 쉽게 다른 분석 방법을 사용하여 심장 개발과 성숙을 기본 세포와 분자 생물학의 추가 분석을합니다. 이 프로토콜은 심장 개발 성숙과 노화 연구에 대한 귀중한 기술을 제공합니다.

프로토콜

Zebrafish는 28에서 퀸즈 대학 동물 시설 ¹³ 표준 프로토콜 ° C.를 사용하여 제기되었습니다 개인 생선 쌍 또는 그룹 matings은 preformed하고 그 결과 태아는 청소와 28 ° C 인큐베이터에 보관해야합니다. 물고기의 건강은 매일 검사해야합니다. 5 일 포스트 수정 (dpf)에서, 물고기는 물고기 10-15 밀도에서 탱크로 구분해야하며 생선 보육 시설에 들어갔다. 15, 30, 45, 60, 90, 180 dpf : 여기에서 제시한 프로토콜에 대한 zebrafish는 성인 단계를 통해 유충에서 수집된 있었다.

1. Zebrafish 제목 수집 및 고정

1. 마취로 0.2 % Tricaine에 그물과 장소를 사용하여 서식 탱크에서 물고기를 제거합니다.
2. 안락사에 15 분 동안 얼음물에 anesthetized 물고기를 배치합니다.
3. 1X에 신선한 4 % paraformaldehyde (PFA)를 확인 인산 버퍼 식염수 (PBS)를.
4. 4 다음 하룻밤 RT에서 1~2시간에 대한 4% PFA 수집 물고기를 품어 ° parafilm에 싸여 배양 접시에있는 C. 이것은 물고기 평면을 유지하고 나중에 절개가 훨씬 쉬워집니다.
5. 고정 후, 십대 초반 (PBT)로 두 번 PBS로 씻어. 물고기는 최대 10 일 4 ° C에서 PBT로 유지하실 수 있습니다.

2. 물고기와 절개를 측정

1. 페트리 접시의 절반에 장소 하나의 생선은 신선한 PBS 가득한과 그 오른쪽에 그것을 믿는다.
2. 아니라 디지털 mm 캘리퍼스 (그림 1)를 사용하여 꼬리 지느러미를 포함하여 주둥이에서 꼬리 자료 (꼬리 꽃자루)에 물고기의 측정 길이. 이것은 표준 길이 (SL)입니다.
3. 각 생선 번호 / 문자 조합을 나중에 분석을 위해 추적하는 개인 생선과 결과를 해부 심장을 허용을 지정할 수 있습니다. 부모 재고 번호, 고정, SL 측정에 나이를 포함하여 데이터, 스프레드 시트에 입력되었으며 이러한 레이블을 기반으로 조직.
4. 해부, 라벨 PCR 튜브 지정된 추적 번호와 스트립 및 PBT 또는 추가 분석을 위해 적절한 다른 솔루션을 작성하기 전에.
5. 배양 접시에있는 동양 물고기 복부 측면까지 눈과 아가미 (그림 2) 사이의 고개를 들고 집게로 시신을 안정화하면서.

작은 물고기 (12mm SL보다 작은) :

4. A) 핀 홀더에 날카로운 포셉 또는 마이크로 바늘을 사용하여 마음을 나타내기 위해 신체의 가슴 근육과 지느러미를 제거합니다. 해부 동안 포셉의 끊임없는 움직임은 물고기를 이동 PBT에 전류를 발생할 수 있습니다. 이것은 따라서 마이크로 바늘이 가슴 근육과 지느러미를 제거하고 뱃속을 열고하는 데 사용할 수있는 작은 생선, 특히 문제가됩니다.
5. A) 부드럽게 중앙홀 아래에서 구멍의 마음을 밖으로 치우도록 포셉을 사용합니다. 반면, 일부 생선에 부드럽게 주먹코 밖으로 당기하고 마음의 나머지는 따를하여 마음을 제거할 수 있습니다. 쉽게 손상될 수 있으므로이 기술을 사용하는 경우 아트리움의 위치에주의하십시오. 괜찮 후 삭제 될 수있는 마음, 함께 제공 추가 조직이있다면.
6. 물고기 같은 TG (myl7로 형광등 심장 마커가 포함된 경우) : GFP) ^twu34를 해부를위한 형광 범위를 사용하여 개화 (그림 3)에 의해 심장의 제거를 확인합니다.
7. 마음 한번)가 구멍에서 제거, 심장의 외부에서 추가가 아닌 심장 조직 및 epicardial 안감을 제거하기 위해 마음과 마이크로 바늘을 개최 포셉을 사용합니다.

큰 물고기 (12mm SL보다 큼)

4. 아가미 2 일까지 가로자를 - - 앞쪽에 배를 가로 3 컷 - 모두 상처를 연결하는 복부 측면에 화살 컷 (그림 4) 1 : B) 처리 마이크로 스프링 가위를 사용하여 1mm 깊이보다 세 incisions합니다.
5. B) 날카로운 집게를 사용하면 뱃속을 열고 심낭의 은빛 조직 (그림 5A)을 나타내기 위해 신체의 가슴 근육과 지느러미를 제거합니다. 이 pericardial 조직을 제거하고 심장 (그림 5B) 표시가 될 것입니다.
6. B) 심장에 뛰어난있는 주먹코 arteriosus에 연결된 동맥을 잘라 마이크로 가위를 사용합니다. 이 동맥이 절단되면 아트리움에 따라 포셉 팁을 넣어, 캐비티의 마음을 밖으로 치우도록 포셉을 사용합니다. 괜찮아요 나중에 제거할 수있는 마음, 함께 제공 추가 조직이있다면.
7. 심장이 구멍에서 제거되면 B), 마음을 가질 두 집게를 사용하여 마음을 가질 추가 조직, 또는 포셉 한 쌍을 제거하고 마이크로 바늘 추가가 아닌 심장 조직을 제거합니다. 부드럽게 조직을 근근이 살아가고하여 원하는 경우 그 검은 착색에 의해 분명 epicardial 안감은, 심장의 외부에서 제거할 수 있습니다.

3. 마음의 사진

1. 23g / L 영양 한천 배양 접시를 준비하고 PBS로 확정 한천을 커버.
2. 포셉 사용하여 심장이 사진 촬영을 위해 원하는 방향으로 나머지 수있는 한천에서 잘합니다.
3. Remov단단히 포셉과 구상의 끝을 잡고하여 PCR 튜브에서 E는 심장. 한천 요리에 마음을 놓으십시오.
4. 사진에 한천에 동양의 마음. 예제는 가능한 모든 방향 (그림 6) 각 사진 뒤에 회전 수 있습니다.
5. 마음을 사진에 오버헤드 가볍고 짧은 노출 시간을 사용합니다. 최고의 사진을 얻기 위해 필요한 노출을 사용하여 빛을 품질에 대한 조정을합니다.

4. 대표 결과 :

잘 해부 깨끗한 마음의 예제는 그림 6에 여러 방향으로 표시됩니다. 각 심장 전체 형태에서 약간의 차이가되지만 마음은 그대로 뇌실, 아트리움과 주먹코 arteriosus가 포함된 완료해야합니다. 전체 형태에 변화의 몇 가지 예제는 그림 7에 표시됩니다. 까만점 epicardial 조직도 마음에서 제거하실 수 있습니다.

그림 1. 주둥이에서 디지털 mm 캘리퍼스를 사용하여 꼬리 꽃자루에 생선을 측정.

그림 2. 눈과 아가미 사이 포셉로 물고기를 잡아.

그림 3과 같은 TG와 같은 심장 특정 형광 유전자 변형 마커 (myl7 : GFP). 여기에 표시 ^twu34은, 작은 생선을 해부하는 마음을 시각화에 도움이 있습니다.

그림 4 가슴 근육과 피부를 제거하는 세 incisions : 1 - 아가미 2 일까지 가로 절단 - 앞쪽에 배를 가로 3 컷 - 모두 상처를 연결하는 복부 측면에 화살 했네요..

. 주먹코 arteriosus (BA), 뇌실 (V), 그리고 아트리움 (A) : 그림 5 블랙 문자는 심장의 실 레이블을.
- 상체 구멍은 심낭의 은빛 조직을 보여주 개방됩니다.
B - 후 심낭을 제거, 마음이 보이는 쉽게 제거됩니다.

마음의 그림 6. 다른 방향이 표시됩니다. 주먹코 arteriosus (BA), 뇌실 (V), 그리고 아트리움 (A) : 블랙 문자는 심장의 실 레이블을. 앞쪽에 (A), (D) 지느러미, (P) 사후, 복부 (V), 왼쪽 (L)과 오른쪽 (R) : 회색 화살표는 위치와 방향의 중심 본문에 정상적인 위치에 대한 언급을 나타냅니다. 스케일 바는 400μm 나타냅니다.
심장의 A - 복부보기
마음의 B - 지느러미보기
왼쪽에서 C - 가로보기
오른쪽에서 D - 가로보기

그림 7. 다양한 크기의 마음의 형태론가 표시됩니다. 주먹코 arteriosus (BA), 뇌실 (V), 그리고 아트리움 (A) : 블랙 문자는 심장의 실 레이블을. 스케일 바 400 μm의를 지적했다.
이하 12mm 이상 SL과 AC - 하트 양식 물고기
12mm보다 큰 SL와 DF - 하트 양식 물고기

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토론

포스트 배아 물고기의 zebrafish 심장의 해부에 대한 이러한 방법은 손상되지 않은 마음의 완전한 제거를 허용합니다. 이 기술은 간단하고 마음을 손상하지 않도록 할 외부 상처에 대한 가이드를 제공하고 있지만, 꾸준한 손 작은 물고기를 위해 필수적입니다.

해부 중 주요 단계는 마음이 골목에서 직접입니다로 은빛 심낭을 식별하는 것입니다. 심낭을 떠올리면 뱃속을 찾는하...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
자료	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
Paraformaldehyde	EMD	PX0055	PBS에 .04g/mL
집게 # 55	FST	11295-51
마이크로 가위	FST	15005-08
핀 홀더	FST	26016-12
마이크로 바늘	FST	10130-10
영양 한천	BBL	11,472	23g / 소주 H 2 O에 L
배양 접시	BD 팔콘	351029
PCR 8 관 스트립	미국 과학	1402년부터 2500년까지
디지털 캘리퍼스	피셔 과학	14-648-17