에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans</em

요약

레이저 axotomy 시간 - 저속 영상 뒤에 것은 분석의 돌연변이의 효과를 민감한 방법입니다 C. elegans 축삭 재생에. 고품질하지만, 저렴한 가격, 레이저 박리 시스템은 쉽게 대부분의 현미경에 추가할 수 있습니다. 15시간 시간이 지남에 저속 영상은 웜주의 고정이 필요합니다.

초록

시간이 경과 현미경에 의해 다음 레이저 axotomy는 C로 축삭 재생의 phenotypes에 민감한 분석입니다 elegans ^1. 이 분석의 주요 어려움은 레이저 박리 시스템 ^2,3을 구현하는 데 필요한 인식 비용 ($ 25 100K) 및 기술 전문 지식이다. 그러나 겸손한 비용 (<$ 10K)의 솔리드 스테이트 펄스 레이저는 대상 axons은 조직의 표면에 "가까운"입니다 투명 준비의 레이저 절제를위한 강력한 성능을 제공할 수 있습니다. 시스템의 건설과 정렬은 하루에 수행할 수 있습니다. 초점 콘덴서에서 절제 레이저 빛을 제공하는 광학 경로는 편리한 정렬 가이드를 제공합니다. 제거된 모든 광학과 중간 모듈은 절제 레이저에 헌신되며 광학 요소, 레이저 박리 세션 동안 이동하지해야한다는 보장 수 있습니다. 중간 모듈에서 이색성은 동시 영상과 레이저 박리 수 있습니다. 레이저 빔 T를 중심으로O는 초점 현미경의 콘덴서 렌즈에서 나가는 빔은 시스템의 초기 정렬을 안내합니다. 렌즈의 다양한 상태로 사용하고 선택한 객관적인 렌즈의 뒤쪽 구멍을 채울 수있는 레이저 광선을 확장하고 있습니다. 최종 정렬 및 테스트는 앞 표면 미러 유리 슬라이드 목표로 수행됩니다. 레이저 파워는 최소 크기의 절제 자리를 (<1um) 제공하도록 조정됩니다. 절제 장소는 이미지 창에 고정 머리카락을 건너 마지막 kinematically 탑재 거울 미세 조정 중심이다. axotomy에 대한 레이저 전원이 대상 슬라이드 (이것은 여러분이 사용하는 대상과 다를 수 있습니다)에 최소 절제 장소에 필요한보다 높은 약 10X 것입니다. 웜는 아가로 오스 패드 (또는 microfluidic 실 ^4)에 장착하여 레이저 axotomy 및 시간 - 저속 영상에 대한 고정하실 수 있습니다. 아가로 오스 패드는 쉽게 전자 레인지에 녹인 균형 식염수에서 10 % 아가로 오스와 함께 만들어집니다. 용융 아가로 오스의 방울은 유리 슬라이드에 배치하고 서로 평평합니다패드에 유리 슬라이드 두께 약 200 음 (인접 슬라이드에 시간이 테이프의 단일 레이어는 스페이서로 사용됩니다.) "Sharpie"캡은 13mm의 군복을 입은 직경 원형 패드를 절단하는 데 사용됩니다. 마취 (1ul Muscimol 20mM)와 Microspheres (크리스 송곳니 엔 개인 통신) (1ul 2.65 % 폴리스티렌 0.1 음 ... 물속에) 그들이 왼쪽 측면에 누워되도록 지향 3-5 웜 뒤에 패드의 중심에 추가됩니다. 유리 coverslip이 적용됩니다 그리고 바셀린는 coverslip을 봉인하고 샘플의 증발을 방지하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. 레이저 박리 시스템의 구축

레이저 안전 고글을 착용하고 초기 정렬하는 동안 좋은 레이저 안전 관행을 사용합니다. 레이저가 때 oculars을 통해 보인 적이 없어요.

1. 로 그림에 표시된 브레드 보드에 구성 요소를 정렬. 1 (또한 예제 ^{2 참조).} 레이저 (필요한 경우 라이저 플레이트와 함께), 잠망경 게시 및 고가 철도 지원을 볼트.
2. 레일 축과 일치하도록 현미경을 위치. 현미경의 콘덴서 렌즈로부터 전송된 광 빔로 정렬합니다. 레일의 ​​높이 (레벨을 사용)과 조절 조리개 또는 레일에 부착된 렌즈 위치를 맞춥니다. 조리개 또는 렌즈는 콘덴서 빔에 레일의 양쪽 끝에 정렬해야합니다. 연구소 등등 레일 높이 조절과 함께 도움을 줄 수 있습니다.
3. Glan - 톰슨 편광자 및 레이저 빔에 반 파장 판을 맞춥니다. 이 정렬을 수행하는에있는 레이저가 필요하지 않습니다. Beam은 그들의 가장자리를 타격하지 않고 모두 통과해야합니다. 빔 덤프 (fig.1)에 대한 오리 엔테이션과 편리한 위치를 제공하는 편광을 회전합니다. 당신은 레이저 전원을 조정 반 파장 판을 회전합니다. 브레드 보드에 부품을 고정합니다.
4. , 레이저를 켜고 100, 연속 모드로 펄스 주파수를 설정하고 반 파장 판을 사용하여 최소 전력을 줄일 수 있습니다. 레이저 광선을 시각화하는 포스트 - 이건 참고 또는 렌즈 용지를 사용하십시오.
5. 조정 및 고가 레일의 끝에 장착하는 거울에 광선을 가져 레이저에서 순서 kinematically 탑재된 거울을 수정. 레이저 광선은 거울의 중심에 약 정렬되어야합니다. 거울은 레이저 축 (fig.1)에 약 45도를 지향한다.
6. Coarsely 잠망경 상단과 현미경에서 전송된 광 빔의 중심에 레이저 광선을 정렬하기 위해 레일의 끝에있는 kinematically 탑재된 미러를 조정합니다. 레이저 빔 및 t 모두그는 현미경의 광선을 전송 빔 경로에 용지를 삽입하여 동시에 시각하실 수 있습니다. 중간 모듈에 ND 필터와 apertures 밖으로 또는 완전히 열려 있는지 확인합니다.
7. 잘게 상단 잠망경과 레일 거울에 미세 조정으로 전송 광 빔의 중심에 레이저 광선을 맞춥니다. 가까이 레일 거울에 용지를 잡고 상단 잠망경 거울로 전송된 광 빔의 중심에 레이저 광선을 맞춥니다. 현미경 포트 근처의 용지를 잡고 레일 미러 조정 (fig.2)로 전송된 광 빔의 중심에 레이저 광선을 맞춥니다.
8. 게시물을이 위치 정렬 콘덴서 렌즈와 오픈 객관적 터렛 사이 빔의 경로에 유의하십시오. 당신은 중앙 근처에있는 작은 레이저 빔을 전송 광 빔 나타납니다. 중심 레이저 빔에 레일 거울에 정밀한 조정을 사용합니다. 클램프와 장소에서 현미경을 수정.

1 단계0.9-1.12은 선택 사항이지만 그것은 빔 확대 렌즈를 추가하기 전에 정렬과 레이저 박리을 평가하기 위해 간단하고 유용합니다.

9. 레이저를 끄고 기계 안전 셔터와 교전. 빔 경로의 50 % 이색성 밖으로 회전합니다. 더 직접적인 레이저 빛이 oculars로 전달되지 않습니다에도 불구하고, 반영 빛이 꽤 강렬 수 있습니다. 60X 오일 목적으로 고급 정렬 및 이미지의 대상 슬라이드를 탑재합니다. 슬라이드에 긁힌 자국에 중점을두고 있습니다. 중간 모듈의 ND4와 ND8 필터에 넣어.
10. 이미지 대상 사용자 CLSM과 슬라이드, 스피닝 디스크 또는 CCD 카메라 시스템입니다. 레이저 경로에 50 % 이색성 회전합니다. 절제 레이저가있는 동안이 시점에서, 당신이 oculars 통해 쳐다보지도 않을 것입니다. 절제 레이저의 전원을 켜고 100 트리거, 주파수 모드를 설정 및 펄스 번호 10. 전원이 여전히 절반 ​​웨이브 플레이트와 최소로 설정 후 기계 안전 셔터를 열고 있는지 확인하십시오. 당신은 simultaneou 수교활한 이미지와 절제 레이저를 사용합니다.
11. 이미징 대상 슬라이드를하지만, 절제 레이저를 실행. 직경 절제 명소 10-10 음의 대상 슬라이드를 확인합니다. 절제 장소가 볼 때까지 순차적으로 ND 필터를 제거합니다. 레일 거울 이미지의 센터에 절제 자리를 조정합니다. 당신은 잘게 <1 음 박리 장소를 제공하기 위해 반 파장 판과 레이저 파워를 높이기 위해 공간을 필터 ND 다시 추가하려는 것입니다. 0.2 음 / 픽셀 이하로 가늘게 이미지 센터 (512X512 이미지 위치 256256)에 절제 자리를 조정에서 이미지.
12. 레이저 빔의 초점 축의 깊이를 확인합니다. 최대 초점 아래로 1-2 음과 절제의 위치와 절제 장소 크기를 확인합니다. 레이저 빔이 axially 정렬 경우 절제 장소는 이동하지 않습니다. 무조건 레이저 빔 (상단에서 하단으로 초점 3-5 음 ...에 대한) 여러 가지 음 이상의 능력을 배포합니다.

2. 목표를 다시 채우기 위해 레이저 광선을 확장 렌즈를 추가포커스를 제어하는​​ 조리개 및 조정 융합

1. 이 시스템은 목적의 뒷면 구경 (10mm)를 채우기 위해 레이저 광선을 확장하는 듀얼 갈릴리 빔 확장기를 사용합니다. 항공사에 4 렌즈를 마운트하고 (L1f1 + L2f2 및 L3f1 '+ L4f2') 레일에 첨부하십시오. 모든 렌즈는 레이저 빔 (그림 2) 정확하게 직교 같은 광학 축에하고되도록 위치를 조정합니다.
2. 레이저의 전원을 켜고 최소의 전력과 지속적인 모드로 조정할 수 있습니다. 대략 레이저 광선을 볼 수 용지를 사용하여 각 렌즈를 통해 빔 정렬을 조정하고 현미경의 콘덴서에서 밝은 광선을 전송. 끄고 셔터 레이저.
3. 현미경의 한쪽에서 클램프를 제거하고 레이저 빔 경로의 현미경을 슬라이드. 레이저의 전원을 켜고 안전 셔터를 제거합니다.
4. 렌즈 및 레이저 빔의 벌금 정렬은 근처 벽에 확장 레이저 빔을를 확인하여 수행할 수 있습니다. 때 르 빔은 대칭을 확장하고 계약해야합니다nses가 이동됩니다. 빔 (fig.3)를 정렬하기 위해 마지막 두 kinematically 탑재된 거울을 조정합니다.
5. 정렬 및 확장 빔 프로파일은 원형과 균일한 밝기 (fig.3)의해야합니다. 빔의 크기와 균일는 함께 볼 수 이후 그것은 목표를 다시 개구의 예상 위치에 있습니다.
6. 빔은 무한대 광학 시스템의 융합 제로 조정해야합니다. 이 게시물을 - 그것은 이동 렌즈에서 더 참고 융합은 어떻게 빔 크기 변경을 지적하여 예상 수 있습니다. 레이저를 끄고 기계적 셔터를 갖습니다.
7. 올바른 정렬을 정의하는 고정 클램프를 사용하여 레이저 빔 경로로 다시 현미경 슬라이드. 현미경의 자유 측면에서 클램프를 교체하지만, 고정하지 않습니다.
8. 레이저의 전원을 켜고 안전 셔터를 제거합니다. 열린 위치로 목표 터릿 회전. 게시물 - 그게 플레이스 무대에서합니다. 당신은 전송된 빛을 B를 중심으로 확장되고 균일한 레이저 빔을가 나타납니다콘덴서에서 eam (fig.4). 당신은 현미경 클램프를 느슨해진 조심스럽게 현미경을 이끌어하여 센터링해야 할 수도 있습니다.
9. 안전 셔터를 참여하고, 모드를 실행하기 위해 레이저를 설정합니다. 장소 및 이미지 대상 슬라이드의 표면 스크래치에 60X 목표를 회전합니다.
10. , 안전 셔터를 제거 절제 레이저를 실행하고 최소 절제 명소에 대한 레이저의 파워를 조정합니다. 절제 지점은 이미지 센터 5-10 음 내에서 순환하고 있습니다.
11. 센터 kinematically 마운트 레일 미러의 미세 조정과 절제 장소. 당신은 iteratively 센터 절제 자리를 모두 레일 마운트과 최고 잠망경 거울을 조절하여 균일한 빔 프로파일을 유지하기 위해 필요합니다.
12. 한 음 단계에서 위, 아래로 체계적으로 초점을 이동하고 절제 레이저를 실행하여 레이저의 Z 초점을 평가해보십시오. , 확장 정렬된 및 컨버전스 조정 빔은 하나, 음 AB에 약하게하거나 아닌 이미지 초점에서 maximally ablate와해야ove 또는 아래 (그림 5) 중점을두고 있습니다.
13. 갈릴리 망원경 (fig.2)의 렌즈 L3를 이동하여 확장 빔의 Z의 초점을 조정합니다.

3. 레이저 axotomy과 축삭 재생의 시간 경과 현미경

1. 균형 식염수에 전자 레인지 10% 아가로 오스 (RPI 분자 생물학 학년 EEO 0.1 A20090)가 완벽하게 녹아 때까지. 장착에 사용하는 동안 그것이 녹아 유지하기 위해 뜨거운 접시에 설정합니다.
2. 용융 아가로 오스의 방울은 유리 슬라이드에 배치하고 두께 약 200 음 (인접 슬라이드에 시간이 테이프의 단일 레이어가 스페이서로 사용됩니다) 패드에 다른 유리 슬라이드로 평평합니다.
3. "Sharpie"마커 캡은 13mm의 군복을 입은 직경 원형 패드를 절단하는 데 사용됩니다.
4. 그들이 왼쪽 측면에 누워되도록 마취 (1ul Muscimol 20mM)와 Microspheres는 (크리스 송곳니 엔, 개인 통신) (1ul 2.65 %의 폴리스티렌 물 0.1 음) 위주의 3-5 웜 뒤에 패드의 중심에 추가됩니다 . 유리 coverslip이 적용하고 Vasel입니다오프라인은 coverslip을 봉인하고 샘플 증발 (fig.6)를 방지하는 데 사용됩니다.
5. 절제 레이저는 각 세션의 시작 부분에서, 위에서 설명한 바와 같이, 주목을 받게으로 정렬됩니다. 레이저 안전 셔터를 참여.
6. 대상 뉴런에 적합한 형광 마커와 레이저 정렬 대상 및 이미지 마운트 어른 벌레를 제거합니다. 비슷한 확대 (0.2 음 / 픽셀 이상 확대)과 주목을 받게 (fig.7) 아래 위치에 이미지 axons.
7. 레이저 안전 셔터를 열고 절제 레이저 이미징 동안을 트리거. 레이저를 실행 후 축삭을 평가하고 축삭이 절단 때까지 천천히 레이저 파워를 향상시킬 수 있습니다. 당신은 정렬 대상 슬라이드 (1uJ / NS 펄스에 대한)에 절제 자리를 양식하는 것보다 axons를 잘라 10X보다 레이저의 파워에 대해이 필요합니다. 우리는 일반적으로 약 0.27mW (2,500 Hz에서에서 연속으로 설정 코히어런트 FieldMaxII 파워 미터 및 레이저로 시료에서 측정 평균 전력)로 설​​정 2.5 kHz에서 전력 100 펄스와 함께 했네요. 절제레이저 전원 설정은 이후의 실험 (fig.7)에 axons를 절단에 대한 일관성있는 것입니다.
8. 성공적으로 잘라 축삭은 두 컷 종료 (fig.7)에 밝기의 손실없이 0.5-1에 대한 음의 휴식이 표시됩니다. 밝기 또는 큰 간격 (2-10 음)의 대규모 손실이 종종 캐비테이션 버블에 의해 축삭 이상의 광범위한 손상을 의미합니다. 근위 및 말초 axons은 (그림 8 동영상) 다음 삼십분 동안 철회 구근을 분리하여 형성됩니다.
9. 시간의 경과 기록을 시작하기 전에 30 분 당신의 현미경 무대로 웜을 탑재된 평형. 이것은 온도 차이와 아가로 오스의 수축으로 인해 표류을 최소화합니다.
10. ) 시간 경과 영상 매개 변수는 시스템과 연결된 이미징 소프트웨어를 사용하여 설정됩니다. 원하는 공간 해상도를 제공하는 동안 우리는 일반적으로 0.1-0.2 음 / 픽셀에서 이미지 10-20 Z 단계 (1um/step)는 이득, 핀홀, 스캔 속도 및 노출을 최소화 이미징 레이저 전원 설정을 사용합니다. 샘플링 간격은 전형적인원하는 시간적 해상도 (그림 8 영화)에 따라 15시간 이상 1-5분 니.
11. 시간 저속 이미지 데이터는 NIS 요소 또는 ImageJ를 사용하여 동영상으로 변환됩니다.

4. 대표 결과 :

이 시스템을 사용하는 레이저 axotomy는 안정적이고 일상이다. 그림 7에 표시된 결과는 전형입니다. 축삭 재생의 시간 경과 영상이 프로​​토콜을 사용하여 매우 강력합니다. 우리는 일상적으로 전동 스테이지를 사용하여 단일 슬라이드에 5 가지 웜 5 axons까지 잘라 이미지. 유일한 제한은 당신이 모든 1백80초를 샘플링하는 경우 대부분에서 9 axons (9 스택)를 맛볼 수 후 축삭의 스택을 수집하기 위해 20 초 정도 소요 경우, 각 축삭 예의 이미지를 수집하는 데 걸리는 시간입니다. 그림 8과 9에 표시된 예제는 좋은 대표적인 결과입니다. 실험의 약 10 %가 품질의 결과를 제공합니다. 나머지 실험은 재생 표현형에 좋은 데이터를 제공하지만, esthetically unappeal 아르ING 때문에 일반적으로 고정의 5~8시간 후 시작 웜 작은 jittering 움직임.

한 레이저 박리 시스템을 그림. 532 나노미터 ND : YAG 레이저는 다른 구성 요소의 높이를 가지고 라이저 접시에 탑재하고 브레드 보드에 나올 것입니다. (광 아이 솔 레이터는 옵션 그리고 아마도 필요하지 않습니다.) Glan - 톰슨 편광자 및 반 파장 판은 잘게 레이저 전원을 제어하는​​ 데 사용됩니다. 그들은 잘게 보정 회전 마운트에 있습니다. 빔 덤프 설정을 조심해. 코너 거울 낮은 잠망경 거울에 레이저 광선을 지휘하고 있습니다. 상위 잠망경 거울은 철도 거울에 빔을 연결해줍니다. 레일은 두 개의로드 지원 플랫폼에 마운트됩니다. 듀얼 갈릴래아 렌즈는 슬라이딩 레일 마운트에 붙어 있습니다. 절제 레이저 전용 추가된 중간 모듈을 확인합니다. 시스템은 광학 이솔라을 제거하여보다 간편하게 만들 수토르와 코너 거울, 그리고 브레드 보드의 뒤쪽 가장자리에 레이저, Glan - 톰슨 편광자 및 반 파장 판을 재조정.

그림 2 듀얼 갈릴리 컨디셔닝 렌즈는 제로 융합 유니폼 10mm 크기에 300 음 TEMoo 레이저 광선을 확장하는 데 사용됩니다. 실험실 잭 레일을 잡고 플랫폼 중 하나에 배치됩니다. 이것은 정렬 단계 동안 레일 높이를 조정에 도움이됩니다. Crudely 레일에 L1 렌즈를 장착하고 정렬 가이드로 콘덴서 빔을 사용하여 레일의 높이를 조정합니다. 콘덴서 빔은 레일의 양쪽에있는 렌즈의 중앙에 일치 있도록 레일을 조정합니다. 이것은 레일이 현미경의 광학 축에 평행하게 정렬되도록합니다. 당신은 레일의 광축과 일치하도록 먼저 현미경을 조정해야 할 수도 있습니다. (그림을 참조하십시오. 1) 현미경의 위치를​​ 수정하는 클램프를 사용합니다. 일를 제거전자 렌즈를 레일 마운트. 지금은 레일의 양쪽에있는 콘덴서 빔의 중심에 레이저 광선을 맞춥니다. 빔 경로에 용지가 동시에 광선을 볼 수있는 편리한 방법입니다. 가까운 레일 마운트 거울에 콘덴서 빔에 레이저 빔을 정렬 가기 잠망경 거울을 사용합니다. 레일은 레일의 끝에서 (현미경에 가장 가까운)에서 콘덴서 빔에 레이저 광선을 정렬하기 위해 미러를 장착 사용하십시오. 지금처럼 그림 레일 네 가지 렌즈를 탑재합니다. 레일의 ​​길이, 렌즈의 초점 거리 및 렌즈 배열은 현미경과 신체적 설정할에 따라 달라집니다. 중요 매개 변수는 레이저 빔 직경 선택한 목표의 뒤쪽 구멍의 크기입니다. 무한대 광학 시스템은 완벽하게 병렬 레이저 광선을 (영 융합) 초점을 맞출 것이다. L1과 L2 사이의 거리는 초점 길이, F1 + F2, 그리고 L3과 L4 사이의 거리가 correspondingly F1 '+ F2'되어야하는 렌즈의 합이되어야합니다. 일 사이의 거리E 이중 갈릴래아 쌍입니다 중요하지 않습니다. L3의 위치는 가늘게 빔 융합을 제어 조정될 수 있습니다, <1mm의 조정은 이미지 초점 레이저의 초점을 조정하는 데 필요한 것입니다. 빔 경로 (또는 그들이하는 짓을 인식하고 그에 따라 시스템을 조정)에있을 중간 모듈에서 모든 렌즈, 필터, apertures 등을 제거해야합니다.

이중 갈릴리 렌즈를 통해 레이저 빔을 3 정렬 그림. 현미경은 빔 경로의 이사 수 있도록 현미경 한쪽에서 현미경 클램프를 제거하지만, 나머지 겸자는 현미경이 정확 높이기 수있게됩니다. 레이저 안전을 생각하십시오. 레이저 전원 Glan - 톰슨 편광자있는 최소한으로 조정되어 있는지 확인하십시오. 레이저의 전원을 켜고 벽에 레이저 빔 패턴을 볼 수 있습니다. 당신은 벽에 테이프 종이가 레이저를 볼 수 있습니다 찾을 수 있습니다장소. 체계적으로 그들은 빔 크기와 모양 할 일에 대해 느낌을 얻을 수있는 렌즈의 위치를​​ 조정합니다. 당신은 패널 닮은 무언가를 볼 수 강렬한 장소가 eccentrically 주차 프로필에 위치. 패널 B. 지금 상단 잠망경을 사용하여 그림과 같이 중앙에 강렬한 자리를 조정 레일 마운트 미러를 사용 균일 주변 장치 프로파일을 제공하기 위해 미러를 장착. 모든 것이 제대로 정렬 경우 이제 렌즈를 이동하면 광선이 대칭을 확장하고 계약을 원인 것을 발견한다. 그림 2에 표시된 시작 위치로 다시 렌즈를 이동합니다. 이제 목표를 다시 개구의 거리에있는 광선을 차단. 당신 다시 조리개를 채우기 위해 충분히 큰 최소한, 그리고 균일한 밝기의 원형해야합니다. 그 동안 당신 ablations에 대한 충분한 레이저 파워를 가지고 같이 큰 경우는 괜찮습니다. 목표 뒤 조리개와 벽면의 거리에서 빔 직경 비교하여 융합을 평가해보십시오. 빔 직경한다제로 융합 빔에 대해 동일합니다. 스케일 바 10mm입니다.

콘덴서 빔에 확장된 레이저 빔을 4 정렬 그림. 셔터 레이저 및 정렬 중지로 클램프를 사용하여 레이저 빔의 경로로 다시 현미경을 이동합니다. , 켜고 정렬, 그리고 강렬한 반영 레이저 빛을 볼에서 사람을 방지하기 위해 oculars를 통해 객관적인 렌즈. 테이프 종이를 사용하여 콘덴서의 광선을 중점을두고 있습니다. 열린 위치로 목표 터릿 회전. 콘덴서 빔을 윗니와 아랫니가 맞물리다하기 위해 무대에 종이를 넣어. 연속 모드에 레이저를 켜고 기계 안전 셔터를 제거합니다. 당신은 현미경하지만 몇명 레이저 빛을 나타납니다. 현미경 클램프를 풀어 부드럽게 콘덴서 빔과 레이저 광선을 정렬하기 위해 현미경을 슬쩍 찌르다. 레이저 빔이 원형과 균일한 밝기해야합니다. 그것은 때로는 adju에게 유용합니다세인트는 렌즈 레일 마운트. 당신은 정렬이 정확하면 균일하게 레이저 광선을 확장하고 계약하실 수 있습니다. 당신은 레일 마운트 거울 최소 중심으로 콘덴서 빔 중심 계약 레이저 빔을 다음 원하는 크기로 확장할 수 있습니다. 일단 레일 미러와 계약을 체결한 빔의 위치를​​ 조정, 당신은 확장 빔의 균일한 밝기를 유지 가기 탑재 잠망경 거울이 다시 조정해야합니다. 당신이 원형을 중심으로 레이저 광선을 얻을 수 없다면 당신은 이전 정렬 단계로 돌아가서해야합니다.

그림 5 센터 절제 자리하고 최적의 초점에 대한 레이저 융합을 조정합니다. 끄고 셔터 레이저. 종이를 제거하고 미러 대상 슬라이드 (당신은 또한 대상 ^2로 coverslip에 영구 마커 잉크를 사용할 수 있습니다) 탑재합니다. 60과 미러 표면에 이미지 흠집레이저가있는 동안 지금 X 1.4na 오일 렌즈) 이미지 공촛점 또는 CCD와 표면. oculars으로 보지 마세요. 전원을 켜고 레이저를 unshutter. 모드, 최저 전력, 100 Hz에서를 실행하기 위해 레이저를 설정합니다. 10 펄스에 대해 트리거. 당신이 볼 중심의 10 음 이내에 직경 1-5 음의 절제 장소가 나타납니다. 당신이 절제 자리를 볼 수 없다면 당신은 5-10 %의 단계에서 레이저 파워를 높일 수 있습니다. 일단 절제 명소,보기의 필드 센터를 식별합니다. 512X512 이미지를 볼 경우 256, 256 좌표에 십자선을 넣어. 당신이 센터에 레이저 스폿을 조정면 그것은 확대와 위치를 변경되지 않습니다. 레일 가운데 주목을 받게으로 절제 자리를 이동 미러를 장착 사용하십시오. 그림 4에서 위에 설명된대로 제거 목적으로 빔을보고하여 레이저 빔을의 균일을 재평가. 상단 잠망경 마운트 거울과 빔 균일를 조정합니다. 절제 현장 위치의 평가를 반복합니다. 이것은 P 반복됩니다절제 장소가 중심 및 확대 빔 유니폼입니다 때까지 반복해야 rocess. 할 경우 제대로 절제 장소는 그림에서 초점에서 절제 자리에서 볼로 원형 것입니다. 다음 Z 축에 레이저 빔의 초점을 평가합니다. 중앙에 약 1 음의 절제 자리를 생산하기 위해 레이저를 트리거. 이제 옆으로 다섯 음에 대한 슬라이드를 이동하고 대상 슬라이드의 표면 아래에 한 음 중점을두고 있습니다. 당신을 가장 먼저 절제 명소에 사용된 것과 동일한 레이저 설정을 사용하여 레이저를 트리거. 대상 슬라이드의 표면 위의 한 음 집중 후 반복합니다. 레이저 빔은 이미지 초점 초점을 맞추고있다면 당신은이 그림에 표시된 것과 비슷한 패턴을 볼 수 있습니다. 가장 큰 절제 지점은 이미지의 초점 이상 아래의 절제 명소 초점 대칭 작아야만에 해당한다. 초점 비행기를 정렬 렌즈 L3를 조정합니다. 현미경에서 멀리 렌즈 L3를 이동하면 빔을 더 집중하게되고 절제 장소 가까이로 이동합니다목표. 작은 <1mm의 조정이 초점 근처에 필요합니다. 이제 axons를 잘라 준비가 된 것입니다. 스케일 바는 1 음.

레이저 axotomy 및 시간 경과 이미징을위한 그림 6 마운트 웜. 염분의 아가로 오스 10 % 완벽하게 녹아까지 가열합니다. 작은 방울은 유리 현미경 슬라이드에 배치하고 평평한 패드를 형성하는 또 다른 슬라이드로 평평합니다. 패드의 두께는 두 인접 슬라이드에 테이프로 설정됩니다. 패드는 약 1 분간 설정 허용되는 다음 슬라이드가 구분됩니다. "Sharpie"최고는 13mm 약 균일한 크기의 패드를 형성하기 위해 쿠키 커터로 사용됩니다. 10mM Muscimol 1 UL과 microspheres 1 UL은 패드의 중심 (송곳니 엔 개인 통신)에 추가됩니다. 웜은 유리 coverslip에 올려 놓기 전에 2 UL 드롭과 지향에 추가됩니다. 바셀린은 그것을 봉인하기 위해 coverslip의 가장자리에 주사기 (20-25 GA. 바늘)에서 적용됩니다.

C. elegans에서 레이저 axotomy 7 일반적인 결과를 그림. 에서는 레이저 axotomy 전후 곧 그대로 축삭을 볼 수 있습니다. 간격 0.5 - 1um에 대한 일반적이다. B는 약 1 음 떨어진 인근의 축삭 손상없이 한 축삭의 레이저 axotomy을 보여줍니다. 레이저는 약 10 %의 전력 (2,500 Hz에서에서 0.3 MW 평균), 100 펄스로 설정되었습니다. 스케일 바는 5 음.

그림 8. 일반 야생 유형 L4 중생. 이것은 절제와 축삭 재생의 시간 경과 기록을 보여주는 시간 시리즈입니다. 빠른 시일 내에 레이저 axotomy 후 0분에서 여러분은 철회 전구를 볼 수 있습니다. 138분으로 철회 전구는 먼 정도로 뽑았으며 지금은 개조하기 시작. 산발적 멤브레인 라고나할까요은 (mircospikes 또는 filopodia) 축삭 축 (화살표 138 및 324)을 따라 볼 수 있습니다.오른쪽 유세은 360 분 잘 구성된 소형 성장 콘을 확장합니다. 414분에서 모두 젊고 아름다운 여자의 성장 콘을 확대했습니다. 그들은 지느러미 신경 코드 (414, 519 및 597분) 방면으로 연장으로 초기 배아와 같은 성장 콘은 dystrophic된다. 지느러미 신경 코드 (960 분)의 짧은 dystrophic 성장 콘 스톨. 화살촉은 근위 몸통과 성장 콘을 가리 킵니다. 화살표는 근위 축삭 축 함께 막 라고나할까요을 가리 킵니다. 스케일 바 20um.

영화 1. 야생 타입 축삭 재생의 영화. 이 영화는 그림 8에 표시된 시간 지점과 함께갑니다. 프로토콜 설명과 axons은 약 10 시간 동안 매 3 분 군데 것처럼 벌레가 탑재되었습니다. Z 스택은 (20 X 1um) 각 시점에서 촬영과 최대 프로젝션 알고리즘 (NIS 요소)에 의해 하나의 이미지로 통합 하였다. 동영상을 감상하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

다른 레이저 시스템 ^3,5-11와 레이저 미세 몇 가지 좋은 토론이 있습니다. Femtosecond IR 레이저가 영상 시설과 관련된 경우 ¹² 편리한 subcellular 레이저 절제의 "금 표준"입니다,하지만 그들은 개별 사용자에 대해 종종 너무 비용이 많이 드는 있습니다. 이 때문에 화상의 깊이 화상 샘플을위한 femtosecond IR 레이저가 필요한 경우 그때는 아마 레이저 axotomy 하나가 필요합니다. 표면의 30-50 음 내의 대상 axons 투명한 조직은 아마 높은 NA의 침지 렌즈를 통해 대상 20 uJ / 펄스 범위의 파란색과 녹색 펄스 레이저로 가능 있습니다. 특히 대상 축삭 증가의 깊이로 femtosecond 레이저와 비교하여 나노 및 피코 초 레이저로 더 많은 피해있을 것입니다. C.이 elegans은 투명 모든 axons은 표면의 20-30 음 내에 있습니다. 우리는 정기적으로 표면의 5 음 내에있는 모터 axons를 잘라. 우리는 또한 쉽게 도끼를 차단표피 표면으로부터 약 20 음하는 신경 링 내에서 기능. 우리는 어른 벌레의 직경을 통해 약 30-50 음 ... 수 axons를 절단에 대한 제한을 발견했습니다. 그것은 여기에 설명한 레이저 박리 시스템이 대상 axons의 투명성과 깊이의 기준에 맞게 여러 가지 준비를 잘 작동한다고 가능성이 높습니다. 아직도, 그것은 femtosecond IR 레이저, 그 나노 및 picosecond 355 NM 및 532 nm의 레이저의 이론적 장점을 감안할 때, 조금 놀라운 것은 C로 레이저 axotomy에 대해 너무 잘 수행 elegans ^6,13. 우리는 nanosecond 440 NM, nanosecond 532 NM, 그리고 femtosecond 레이저와 IR 레이저 axotomy에 대한 응답으로 축삭 재생에 차이를 볼 수 없습니다.

솔리드 스테이트 355 나노미터 자외선 레이저는 532 nm의 다이오드는 수동적 Q - 스위치 고체 레이저 펌핑과 같은 비용에 대해 있지만, 효율적으로 이러한 짧은 파장을 통과 하나 높은 능력이나 광학을 필요로합니다. 대부분의 광학은 보이는 400과 잘 수행하기 위해 설계되었습니다 -700 NM 라이트. 355 나노미터 레이저는 ⁶ 등 감소 플라즈마 임계값, 작은 스폿 크기, 그리고 효율적으로 대상으로 절제 레이저의 100 %를 직접 샘플 신호의 손실없이 GFP의 동시 이미징을 허용 것이다 긴 통과 이색성 같은 장점을 제공합니다. 블루 440 나노미터 레이저는 가시 광선 레이저 (표준 광학 및 안전과 좋은 성능) 작업의 장점을 유지합니다. 불행히도, DPP Q - 스위치 고체 440 nm의 레이저의 가격은 현재와 비슷한 전력 355nm 또는 532 nm의 레이저의 3 배 비용입니다. 우리는 C.위한 새로운 시스템을 설계했다면 elegans은 대상 깊이는 최소한 어디에, 우리는 1 UV 투명 렌즈 (355nm에서 50-70%의 투과율과 비용 40X 1.3na 석유 렌즈에 대한 약 $ 3,000) 및 5-10 uJ / 맥박을 생산 355 나노미터 레이저을 선택 것입니다 -20에 kHz에서.

축삭의 박리는 플라즈마 형성에 의한 것으로 생각됩니다. 짧은 펄스는 낮은 전력과 플라즈마 볼륨 w에서 플라즈마 임계값을 생산합니다 병이 ⁶ 작은 수 있습니다. 목표는 가장 낮은 전원 펄스 에너지를 조정하여 가장 작고 짧은 - 살았 플라즈마를 생산하는 것입니다. 큰 긴 plasmas이 캐비테이션 거품을 생성하는 것으로 세포를 둘러싼 손상. 우리는 일반적으로 가장 높은 빈도 (예 : 2.5kHz)에서 50-100에 대한 펄스를 사용하는 것을 절제를 발견하면 최상의 결과를 제공합니다. 이것은 손상이 점차 더 손상의 정도를 제어하는​​ 펄스의 연속을 통해 통합될 수 있습니다 제안합니다. 빔을 정렬하고 정확하게 확장하는 경우 여기에 설명된 레이저 박리 시스템은 매우 용서입니다. 우리는 10 % 레이저의 파워 (0.3 MW의 평균 2,500 Hz에서에서 측정 및 1 uJ / 펄스 예상)에서 성인 벌레에 axons 절단 시작하고 14 % 전력을 통해 제한된화된 손상 절약하실 수 있습니다. 당신은 15~39% 레이저 파워 피해의 큰 영역을 볼 수 있지만, 오직 40 % 전력 (약 1 MW의 평균 2,500 Hz에서에서 측정) 위에 벌레 대형 캐비테이션 거품과 벌레의 표피 손상에 의한 폭발 않습니다.

e_content "> Steinmeyer 외. ^2010이 종이, 레이저 박리 시스템을 구축을위한 훌륭한 리소스입니다. 리온 에이버리는 또한 저렴한 N2 가스 337 NM 레이저를 기반으로, 레이저 박리 시스템의 좋은 실용적인 설명을 이뤘고, 좋은 실천을 제공합니다 조언 (elegans.swmed.edu / Worm_labs / 애버리 /). 자신의 시스템을 설계할 때 먼저 현미경 목표로 절제 레이저를 대상으로하는 방법을 결정하기 위해 귀하의 현미경 담당자와 상담해야합니다. 귀하의 현미경이 진동 절연 테이블에 장착해야합니다 (뉴 포트, TMI, 토르). 브레드 보드의 상단 최적이지만, 견고한 스틸 맨은 여전히​​ 자기 positioners와 함께 사용할 수 있습니다. 모든 광학 요소가 자리에 남아있을 수 있기 때문에 수직 범위에있는 전용 중개 모듈이 좋은 것입니다.하지만, 저렴하고 카메라 포트 (거꾸로) 또는 에피 형광등 포트에 연결된 "결합기"를 사용하기 더욱 편리있을 수 있습니다. 당신은 (에 다시 조리개와 투과율의 크기를 알아야 목적 렌즈의 blation 레이저 파장)은 당신이 사용하는 것입니다. 일단 레이저 (예 : Crylas, 가득하며, 크리스탈, 또는 CRC)는 정확한 광학 요소를 선택, 하드웨어 및 안전 장비와 관련하여 도움이 토르 또는 뉴 포트에 문의를 결정합니다. 우리는 공간을 절약하기 위해 이중 갈릴리 빔 확장기 결정하지만 간단 Keplerian의 확장기가 옵션 (f2/f1 = 팽창 계수)입니다. 사용자 정의 빔 확장기가 가장 비싼되지만, 뉴 포트, 토르, 그리고 레이저 제조 업체의 여러 우수한 품질의 상용 빔 확장기를 제공합니다. 일부 레이저 제조 업체는 비용 효율과 공간 절약있을 수 있습니다 설명서 및 전자 제어 attenuators를 제공하고 있지만, Glan - 톰슨 편광자 및 하프 웨이브 플레이트처럼 다목적 없습니다. 당신은 또한 레이저를 제어하는​​ 방법을 결정해야합니다. 당신은 레이저 회사에서 제공하는 상업 TTL 발생기, 또는 소프트웨어를 사용, LabView 기반의 컨트롤러를 디자인할 수 있습니다. 특정 레이저 제조 업체 옵션을 논의.

십t "> 우리는 일반적인 가이드에만 사용이 하드웨어의 목록을 제공합니다. 시스템은 기존 이미징 시스템에 추가할 때 $ 15,000 달러의 비용이 여기에 설명된. 가까운 물리 부서에서 자주 실질적인 소개를 제공하기 위해 기꺼이 누군가를해야합니다 안전하게 무료 빔 레이저와 협력.

고정 및 C. 시간 경과 영상을위한 대체 방법 elegans은 최근에 설명되어있다. ¹⁴

문제 해결

가장 어렵고 중요한 단계는 현미경의 광축 중심으로 확대 빔을 정렬합니다. 일단 당신이 센터에 최종 정렬에 대한 운영 미러를 사용하기 전에 현미경의 광학 축의 5 음 내에서가 정렬하려면 열심히해야 갈릴리 렌즈를 통해 중심과 확장된 광선을합니다. 현미경으로 빔을 정렬 운영 거울 과도하게 사용이 빔을 통해 축을 벗어 이동합니다팽창기. 해당 ND 필터와 함께 레이저 빔을 감쇠와 직접 반사 대상 (전면 표면 거울)에 레이저 빔 프로파일을 볼 수 각별히 조심을 사용합니다. (그것이 당신이 레일의 높이를 조정하는 데 필요한 위 / 아래 범위에 중심 수없는 경우) 당신은 부드럽게 정확 센터보기의 목적 60X 필드에 광선을하기 위해 현미경을 슬쩍 찌르다 수 있습니다. 빔 프로파일이 정확하게 중심 원형이다 빔과 대칭 "플레어"를 제공하기 위해 현미경 광학 축을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 비대칭 불을 현미경 축이 완벽하게 (또는 레일 레벨되지 않습니다) 정렬되지 나타냅니다. 마지막으로, L3를 조정하고 빔의도 및 대칭 확장과 수축이 나타납니다. 가장 작은 지점에 레이저 빔을 초점 L3 조정 후 대상 표면에 정확히 현미경을 집중합니다. 이제 LSCM 또는 CCD 시스템을 통해 몇 군데와 절제 자리 이내로 때 레이저 빔을가 중심의 5 음 사이는 것을 발견한다Z의 초점 1um.

당신이 찾아내는 경우에 당신은 벌레를 "폭파"또는 지속적으로 문제가 가장 가능성이 절제 레이저의 미세 정렬됩니다 axons를 잘라 대형 캐비테이션 거품을 생성하고 있습니다. 최소 (<500nm)가 절제 명소가 Z 초점 (L3 렌즈 컨버전스를 조정)하고 XY 신탁 지점 (마지막 kinematically 장착된 거울로 조정)에 현지되어 있는지 확인하십시오.

가까이 표면에 axons을 타겟팅하면 더 적은 레이저 전원을 필요합니다. 마찬가지로, 작은 동물 (L1 및 L2)은 성인에서 동일한 axons을 타겟팅에 비해 axotomy을위한 더 적은 레이저 전원을 필요합니다.

당신의 야생 유형 axons이 재생 또는 axons의 표백제하지 않으면 당신은 이미징 레이저 전원을 감소하거나 샘플링 속도를 감소 시도해야합니다. 당신의 벌레가 죽어거나 될 경우 병약한 1 % 단계에서 %의 아가로 오스를 줄여보십시오. 당 높은 사용하는 경우이 종종 그들이 죽는 원인이되므로이 장착 벌레 후 coverslip을 이동하지 있는지 확인centage 아가로 오스와 microspheres.

당신의 벌레가 시간 경과 세션 중에 파열 또는 죽으면 그것으로 인한 것입니다 : 1. 아가로 오스 비율이 너무 높습니다. 2. 절제 레이저로 표피 손상. 3. 장착 후 coverslip의 운동. 표피에 손상이 잘못에있다면 그것은 단지 절제 레이저 타겟으로 탑재된 웜 영향을 미칩니다.

당신의 벌레가 시간 경과 세션 중에 너무 많이 움직이면 0.5 % 단계의 비율 아가로 오스를 늘려보십시오. 건강한 웜의 건강한 axons는 항상 "적극적"이며 형광의 일관된 수준을 표시합니다. 이 형광 또는 활동에 갑자기 감소를 볼 경우 웜은 죽어 있거나 죽어있다. 여러 페르시 또는 조각 axons 죽어가는 혹은 죽은 벌레의 확인 서명이 있습니다.

당신은 전체 시간 저속 세션 동안 초점에 axons를 지키는 문제가있다면 여러 가지 문제가있을 수 있습니다. 처음 10 H 이상의 유리 슬라이드에 영상에 의해 불활성 샘플을 당신의 무대 드리프트를 확인RS. 몇 미크론 드리프트는 열 불안정으로 인해 수도 있지만 이상 5 음 아마도 현미경으로 기계적 문제로 인해 발생합니다. 장착에 문제가 더 일반적입니다. 시간의 경과를 시작하기 전에 마운트 웜 30 분 동안 현미경 스테이지와 평형합시다. 귀하의 바셀린의 인감이 시간 저속 세션 과정 중에 누출을 개발하지 않았 있는지 확인하십시오.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
535 NM 레이저	Crylas	FDSS532Q3	(가득하며, 크리스탈, 그리고 CRC도 비교 레이저를 제공합니다)
모든 광학 및 하드웨어			(토르는 비교 광학 및 하드웨어를 제공합니다)
SUPREMA 광학 마운트, 1.0에서 직경	뉴 포트	SS100 - F2KN	이
1 "직경 게시, 1"높이	뉴 포트	PS - 1	일
1 "직경 포스트 포크	뉴 포트	PS - F	일
수색 성의 제로 주문 Wavel 플레이트, ½ 웨이브의 지체, 400 - 700nm	뉴 포트	10RP52 - 1	일
회전 스테이지, 1 "Aperature	뉴 포트	RSP - 1T	일
1 "직경 게시, 1"높이	뉴 포트	PS - 1	일
1 "직경 포스트 포크	뉴 포트	PS - F	일
Glan - 레이저 방해석의 편광판, 430 - 700nm	뉴 포트	10GL08AR.14	일
편광판 회전 마운트	뉴 포트	RM25A	일
직경 게시물 ¼ "1 스페이서"	뉴 포트	PS - 0.25	일
½ "높이 1"직경 포스트	뉴 포트	PS - 0.5	일
포크, 1 "직경 포스트	뉴 포트	PS - F	일
빔 덤프	뉴 포트	PL15	일
현미경 렌즈 마운트 목표	뉴 포트	LH - OBJ1	일
1 "직경 게시, 1"높이	뉴 포트	PS - 1	일
1 "직경 포스트 포크	뉴 포트	PS - F	일
높은 에너지 ND : YAG 레이저 미러, 25.4 mm의 직경, 45 °, 532 NM	뉴 포트	10Q20HE.2	4
SUPREMA 광학 마운트, 1.0 인치 직경 통관 장착 구멍	뉴 포트	SN100C - F	이
고정밀 손잡이 조정 나사, 12.7mm 여행, 100TPI	뉴 포트	AJS100 - 0.5K	4
스레드 어댑터, ¼ -20 남성, 동경 8-32 여성	뉴 포트	SS - 1 - B	이
1.5 인치 직경로드에 대한로드 클램프	뉴 포트	340 - RC	이
로드, 높이 14 인치 (35.5 cm)	뉴 포트	40	일
X26, 스퀘어 40mm 길이 레일 캐리어	뉴 포트	CN26 - 40	4
스틸 레일, 384mm (15 ") 길이	뉴 포트	X26 - 384	일
1.5 인치 직경로드에 대한로드 플랫폼	뉴 포트	300 P	이
로드, 높이 14 인치 (35.5 cm)	뉴 포트	40	이
평요의 렌즈, 12.7mm 직경 - 25mm EFL, 430 - 700nm	뉴 포트	KPC025AR.14	이
렌즈 볼록 렌즈, 25.4mm 직경 50.2mm EFL, 430 - 700nm	뉴 포트	KPX082AR.14	일
렌즈 볼록 렌즈, 25.4mm 직경 62.9mm EFL, 430 - 700nm	뉴 포트	KPX085AR.14	일
고정 렌즈 마운트, 0.5 "직경 1.0"축 높이	뉴 포트	LH - 0.5	이
고정 렌즈 마운트, 1.0 "직경 1.0"축 높이	뉴 포트	LH - 1	이
Microspheres 0.1um	Polysciences	00,876
아가로 오스	RPI	A20090	EEO 사항
Muscimol	시그마	M1523