마우스에 γHV68 감염의 측정

요약

γ - Herpesviruses은 (γ - HVs) 자신의 호스트에서 평생 persistency을 설정합니다. γ - HV68과 생쥐의 감염은 유전자 다루기 쉬운을 제공합니다 생체내에 모델입니다. 이 프로토콜은 플라크 - 형성, 전염성 센터 및 qPCR의 assays에 의해 감염 다음과 같은 급성 및 잠재 단계에서 γHV68 감염의 탐지 및 quantitation을 설명합니다.

초록

γ - Herpesviruses은 (γ - HVs) 림프 세포 ¹ 잠재 감염을 수립하는 능력에 대해 주목할 수 있습니다. 이러한 EBV 및 KSHV 인간 γ - HVs의 좁은 호스트 범위는, 심각하게 상세한 병원성 연구를 방해하고 있습니다. Murine γ - herpesvirus 68 (γHV68) 주 γ - HVs 인간과 함께 광범위한 유전 및 생물 학적 유사성이 murid 설치류 ² 자연 병원체이다. 바이러스 감염의 다른 단계에 쥐를 근친 계통의 γHV68 감염 등, 평가는 γ - HVs 감염시 바이러스 라이프 사이클과 pathogenesis를 이해하는 중요한 모델을 제공합니다.

비강에 접종되면 폐에서 급성 viremia의 γHV68 감염 결과는 나중에 splenocytes와 호스트 ^3,4의 생활 전반에 걸쳐 활성화할 수 있습니다 기타 세포의 잠재 감염으로 해결되었는지. 이 프로토콜에서는, 우리는 엉덩이에 플라크 분석을 사용하는 방법을 설명합니다이후 비강 감염 (DPI)의 - 폐에의 전염성 바이러스 titer는 초기 단계 (7 일 5)에서 Vero 세포 monolayers에 homogenates. 급성 감염이 대부분이 취소되는 동안 - 3 주 postinfection, γHV68의 잠재 감염을 14 DPI 주변 설립 이후 생쥐의 비장에서 유지됩니다. 잠재 감염은 대개 바이러스가 잠복 숙박 및 유전자 발현의 대부분을 껐다 의하여, 감염된 조직에서 세포의 매우 작은 인구에 영향을 미칩니다. Latently에 감염된 splenocytes은 저절로 바이러스 잠재 하중을 결정하는 전염성 센터 (IC) 분석에 의해 recapitulated 수있는 조직 문화로 explanting에 따라 바이러스를 재활 성화. 더욱 심하게 및 / 또는 latently 감염된 조직, 정량 실시간 PCR의 바이러스성 게놈 복사의 양을 추정 (qPCR)는 최대한의 감도와 정확성을 위해 사용됩니다. qPCR과 플라크 분석, 및 / 또는 IC 분석의 결과를 결합 분석은 바이러스의 spatiotemporal 프로필을 공개합니다생체내의 복제 및 감염.

프로토콜

다음 프로토콜은 이론적 γHV68의와 비슷한 라이프 스타일을 공유하는 다른 바이러스에 의해 감염을 평가하는 데 사용할 수있는 마우스에 γHV68의 lytic 및 잠재 감염 사이클에 바이러스 titers 및 바이러스성 게놈로드의 연구를 설명합니다.

1. γHV68의 증폭

1. 37 ° C의 물을 욕조에 γHV68의 냉동 병을 녹여.
2. 37 10cm의 요리와 문화 감염된 세포 NIH3T12 또는 3T3 세포 배양 (~ 50% confluency)에 바이러스 inoculums 추가 ° C에서 5 % CO _2.
3. cytopathic 효과 (CPE)에 대한 현미경으로 문화를 검사하고 세포의 이상 80 % ~ 오일 감염 후 CPE 4를 보여줄 때 한 번에 미디어를 수집합니다. 바이러스의 수율을 최대화하기 위해 감염된 세포 배양은 세포 관련 γHV68을 해제 두 번 냉동 및 해동 수 있습니다.
4. 세포 파편을 제거하는 실내 온도 (RT)에서 5 분 1,000 RPM에서 수집된 미디어를 원심 분리기.
5. 조심스럽게 하단에있는 세포 파편을 건드리지 않고 새로운 튜브 (고속 원심 분리기 튜브)로 supernatants을 전송.
6. 4 12,000 rpm으로 고속 원심 분리기는 (Sorvall SA - 600) · C가 최소 1.5 시간에 대한 바이러스 입자를 집중합니다.
7. 10γ 표백 용액으로 supernatants을 취소하고 신중하게 1ml 혈청 프리 DMEM으로 펠렛을 (바이러스와 잔여 세포 파편) 다시 일시 중지합니다. 1.5 ML 마이크로 원심 튜브에 다시 정지 펠렛을 전송하고 vortexing하여 잘 섞는다.
8. 잔여 세포 파편을 제거하고 새 튜브로 (바이러스 재고) 뜨는을 전송하는 최대 속도에서 2 분 원심 분리기. 이것은 감염에 대한 최종 입소문 재고입니다. 바이러스 주식의 titer는 상패 분석​​ (아래 참조)에 의해 결정됩니다.

2. γHV68와 마우스의 비강 감염

1. 1000과 함께 세 ~ 6 주가되면 쥐를 감염 ~ γHV68 당 생쥐 5,000 상패 - 형성 단위 (PFU)를.
2. 마취복막 캐비티에 케타민을 / xylazine (80 MG / ML 케타민을 12 밀리그램 / ML xylazine의 혼합물 60 μl / 마우스)의 주사로 쥐. 쥐 발가락을 곤란하게하여 마취를 모니터링합니다. 그것은 보통 ~ 50-10 분 정도 소요됩니다. 마우스가 완전히 anesthetized하지 않으면, 그들은 바이러스를 재채기를합니다.
3. 마우스를 완전히 anesthetized 때, 느리지만 꾸준히 드롭하여 드롭 마우스로 PBS가 포함된 γHV68의 ~ 30 μl (각 콧구멍 15 μl)을 예방하기 위해 피펫을 사용합니다. 마우스 실제로 거품을 형성하려고하지 않고 방울을 흡입 있는지 확인하십시오.
4. 마우스 10-15 분 복구 및 케이지에게 반환하기 전에 생쥐 (예 : 의식, 호흡, 등)의 복지를 모니터링하도록 허용합니다. 동물은 음식, 물, 그리고 침대 조건의 질병 및 타당성에 대한 매일 확인하고 있습니다. 질병, 통증이나 고통의 임상 증상이 개발하는 경우, 병인을 결정하기 위해 일상적인 진단이 실시됩니다. 자신의 몸무게의 20 % 이상을 잃게 동물은 최대 체중 감량에 대한 기록됩니다그리고 euthanized. 안락사를 수행하는 최종 결정은 임상 수의사의 재량이며, 주요 조사와 함께 다음과 같은 상담 이루어집니다.

3. 심하게 감염된 폐 속의 바이러스 Titer를 확인하는 상패 분석

1. 바이러스 감염의 titers는 Vero 세포 monolayers에 상패 형성에 따라 결정됩니다.
2. Vero 세포는 / 잘 잘 접시 12 2.5x10 ⁴ 세포에서 상패 분석 전날 씨앗을 품고있다. 세포가 균일하게 분산되어야하며 세포 밀도가 30에 도달한다 - 40 % 상패 분석​​ 당일.
3. 0.5 % (W / V) 메틸 셀룰로오스 (MC) 오버레이 매체 (표 1) 준비합니다.
4. 5~7일 폐의 급성 상 바이러스 titers을 결정하기 위해 비강 감염 후 γHV68에 감염된 생쥐를 희생. euthanization 케타민을 HCL (80-100 밀리그램 / kg SC, IM, IP)의 IM 나 pe​​ntobarbital (30-50 MG / kg IP)의 정맥 과다 복용에 의해 다음 administrated 것입니다. 이 방법은 t의 승인을그는 미국 수의 의학 협회.
5. 폐를 수확하고 혈액 세포를 제거 1 X PBS로 두 번 씻어. 한 ML 얼음처럼 차가운 완전한 DMEM 매체에있는 폐 한 측면을 수집하고 얼음에 보관. 신속 qPCR (아래 참조)에 의해 폐가에서 바이러스성 DNA로드 검사를 위해 -80 ° C에서 폐 및 저장의 다른 측면을 동결.
6. 1 초, 냉동 및 해동 세 번의 최대 속도로 폐 조직을 homogenize하는 조직 균질 화기를 사용합니다. 예제를 변경하면 모든 단계에서 70 % 에탄올로 균 질기 씻으십시오.
7. 4 10 분 3,000 rpm으로 균질 조직을 원심 분리기 ° C. 뜨는를 수집 및 상패 분석​​을위한 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다.
8. 와동에 의해 일반 DMEM과 1.5 ML 마이크로 원심 튜브에 폐 homogenate 샘플 시리얼 dilutions (보통 10 °에서 10 ^-8)를 준비. 미리 기입 해당 540 μl DMEM과 튜브의 번호와 최초의 튜브에 60 μl homogenate를 희석. 저는 처음 튜브에서 60 μl를 전송아니라 다음, 등등.
9. 12 잘 접시에 준비 Vero monolayers에서 미디어를 기음과 역순 (10 ^-8로 10 °에서)에서 전염성 바이러스를 포함하고 / 잘 순차적으로 희석 homogenate 200 μl를로드합니다. 각각의 적정 (중복)를 두 우물을 사용합니다.
10. 37 바이러스 inoculums 1 시간과 Vero 세포를 품어 ° C. 부드럽게 소용돌이 매 15 분 균등 monolayer를 통해 바이러스를 배포하는 번호판을.
11. inoculums를 제거하고 / 잘 오버레이 매체 (표 1) 2 ML로 바꾸십시오. 37 한 주일 동안 번호판을 품어 ° C.
12. 오버레이 매체를 제거합니다 (완료 할 필요가 없다)와 수정 / 상패 분석​​의 얼룩 매체 (표 1)과 교체하고 RT 적어도 1 시간을 위해 알을 품다.
13. 접시가 건조되면, 각 희석에서 잘 절연 plaques의 수를 계산합니다. 오류를 최소화하기 위해, 10과 100 plaques 사이의 포함하는 우물이 계산됩니다.
14. follo를 사용하여 바이러스 titer를 계산날개 공식 : titer (pfu / ML) = [/ (/ 잘 plaques의 수) (inoculums / 음의 볼륨)] X 희석 요인.

4. Latently 감염된 Splenocytes의 바이러스로드를 확인하는 전염성 센터 분석

1. 바이러스 잠재로드 Vero 세포의 monolayer에 전염성 센터 (IC) 분석에 의해 결정됩니다. 6 잘 접시의 IC 분석, 종자 Vero 세포 전날 (1 -. 1.0 X 10 ⁵ 세포 / 물론 우리는 일반적으로 비장 샘플 당 11 우물을 사용하여, 10 우물이 순차적으로 희석 splenocytes 서스펜션에 사용되며 테스트들이 한 냉동 해동 사이클 후 바이러스의 재활 성화 자연.
2. 지연이 (- 십사일 감염 후 12) 설립 후 감염된 생쥐를 희생. 마우스 비장과 수영장 그들이 한 ML 차게 DME​​M에를 수확.
3. 마우스 비장의 기계를 분해. 10cm 접시에 신선한 고립 마우스 spleens를 전송하고 2% FBS DMEM과 같은 원하는 매체의 10 ML를 추가합니다. 습식이 프로스트 엔드 유리 microsc얼음처럼 차가운 매체 ope 슬라이드. 슬라이드와 닉 다른 슬라이드의 프로스트 엔드의 가장자리와 캡슐의 프로스트쪽에 비장 놓으십시오. 모두 빨간 대단히 짧은 시간은 (있을 경우에는 지방 입자를 제거) 조각되기 전까지 기계적으로 두 슬라이드 사이의 비장을 떼어 놓다.
4. 두 슬라이드에 남아있는 세포를 복구하는 DMEM과 슬라이드를 씻어.
5. 50 ML 원추형 나사 캡 튜브에 세포 스트레이너 (40 μm의 나일론 메쉬)를 통해 부드럽게 전체 조직 현탁액을 전송합니다. 필터링 동안 10 ML PBS 및 전송과 비장의 homogenates을 포함하고있는 10cm의 접시를 씻으십시오.
6. 375 XG에서 단세포 정지 10 분 원심 분리기와 뜨는 폐기. 기존의 세포 대단히 짧은 시간을 해산시키기 위해 세포 알약을 톡. 붉은 혈액 세포를 lyse 5 ML ACK 버퍼 (표 1)을 추가합니다. 5 분 부화하고 375 X G.에서 다시 원심 분리기
7. 뜨는을 취소하고 PBS에 부드럽게 아직 완전히 다시 중단 산탄,,, 2% FBS와 함께. 4 ° C. 세포 보관 에 피펫을 사용하여경우, 파편을 제거하십시오. 자동 세포 계수기 (생물 RAD)를 사용하여 가능한 세포를 세어보세요.
8. 4 분에 대한 375 XG에서 PBS - resuspended splenocytes을 돌린다. 뜨는 취소 및 4 ML 완전한 DMEM (2 × 1 ML 원래 정지의 IC 분석에 사용됩니다에있는 세포를 resuspend, 0.6 ML는 IC 분석에 시리얼 다섯 배 희석 사용, 바이러스성 DNA의 준비와 qPCR에 대한 0.4 ML, 1 ML 서스펜션은) 3 냉동 해동 사이클 후 잠재 바이러스의 재활 성화 자연을 평가하는 데 사용됩니다
9. 중복 splenocytes 서스펜션의 직렬 5 배는 dilutions (예 : 5분의 1, 1 / 25, 1백25분의 1, 1 / 250) 준비합니다. 2.4 ML DMEM과 최초의 튜브에 600 μl splenocytes 서스펜션을 희석하고 잘 혼합과 함께 미리 기입은 15 ML 원뿔 튜브. 다음 튜브로 이전 튜브에서 600 μl을 전송 등 와동하지 마!
10. Vero 세포의 준비 6 잘 monolayer에서 매체를 기음. 각 희석 dupl와 Vero 세포에 순차적으로 희석된 splenocytes의 씨 하나 MLicated (10 우물은 0, 5분의 1, 1 / 25, 125분의 1, 2백50분의 1 dilutions에 사용됩니다.)
11. 37 접시 8-12 시간에게 품어 ° C와 5퍼센트 CO _2. 24 시간을 초과하지 마십시오. 씨앗을 품고 splenocytes 서스펜션을 기음 각 잘 ~ 4 ML 오버레이 미디어 (표 1)로드합니다. 추가로 6 일간 알을 품다.
12. 플라크 분석과 같이 크리스탈 바이올렛 0.2 % (W / V)와 함께 접시 염색법에 의해 비장 전염성 센터의 수준을 결정합니다.

5. 바이러스성 게놈의 부량

1. 본 실험에서는 이러한 폐와 비장 샘플로 γHV68에 감염된 조직에서 전체 게놈 DNA를 추출합니다. 제조 업체의 프로토콜 다음 DNeasy 혈액 및 조직 키트 (Qiagen)를 사용합니다.
2. qPCR 분석에 사용되는 DNA의 동일한 금액을 보장하기 위해 각 샘플의 DNA 농도를 결정합니다. 바이러스 특정 primers를 (~ 200 BP의 amplicon은 qPCR 분석에 대한 선호) 설계. 5 &​​ PR : 우리는 γHV68 ORF56 특정 primers를 (앞으로 뇌관 사용IME, - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; 역방향 프라이머 : 5' - CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG - 3')이 분석 및 β - 굴지의 primers (앞으로 뇌관을 위해 : 5' - cacccacactgtggcccatcat - 3 '리버스 프라이머 : 5' - gtgaggatcttcatgaggtagtc - 3')로 qPCR 반응에 대한 제어합니다.
3. (- 500 NG 좋은 100) 2 X SYBR 마스터 믹스 (바이오 - RAD IQ SYBR 녹색 Supermix)와 적절한 primers DNA 샘플을 섞는다. 감염된 조직에서 바이러스 부하를 수치 바이오 RAD 리얼 타임 PCR 시스템을 사용합니다. 다음과 같은 조건에서 PCR을 수행 : 15 분 및 95 45 사이클에 대해 95 ° C ° 30 분 C, 60 ° 30 분, 72에 대한 C ° C 바이러스와 모두, 곡선 분석을 용융 다음 30 분에 대한 굴지의 amplicons.
4. , 바이러스성 genomes의 부량에 대한 표준 곡선을 만들어 순차적으로 감염되지 않은 세포에서 분리된 게놈 DNA와 γHV68 bacmid DNA 알려진 양의 희석합니다. DNAs은 infec에서 검색한와 병렬로 qPCR을 실행바이러스 특정 primers의 동일한 집합을 사용하여 테드 조직.
5. 굴지 정규화 후 게놈 DNA의 단위 당 바이러스의 DNA 복사본 번호 (예 : 100 또는 500 NG NG)로 조직에서 바이러스 게놈로드를 제시한다.

6. 대표 결과 :

그림 1은 생체내의 생쥐에 γHV68 감염의 측정을위한 실험의 전반적인 구조를 묘사. 로 상패 분석​​에 의해 결정 γHV68의 급성 감염시 폐에서 바이러스 titers의 대표 결과, 그림 2A에 표시된되었습니다. 포함 γHV68의 돌연변이 변형되지 않은 기능 바이러스성 BCL - 2 칠일 BALB / C 생쥐 (6 - 그룹당 7 생쥐)의 비강 감염 후 폐에 야생 형 γHV68에 비해 레벨에서 복제 (vBcl - 2). 바이러스의 폐 titers에 통계적으로 의미있는 차이는 두 그룹 사이에 감지되지 않았습니다. 이 데이터는 vBcl - 2가 γHV68의 급성 감염 중요한 요소되지 않았음을 나타냅니다마우스. 그러나 28 일 postinfection으로 spleens에서 vBcl - 2 돌연변이 바이러스의 titer는 6 떨어뜨 렸어 - 10 - 배와 같은 전염성 센터 분석 (그림 2B)에 의해 측정 WT에 비해 제안하는 vBcl - 2 돌연변이 γHV68 바이러스 감염 후 지라 대기의 정비에 결함이 있습니다. 감소 전염성 센터 titers와 계약에서 vBcl - 2 돌연변이 바이러스의 바이러스 게놈로드는 심각하게 그림 2C와 같이 반복 실험에서 일 28시 WT 바이러스의에 비해 감소했다. 감염의 잠재 단계에서 잠재 - HV68vBcl - 2 돌연변이 바이러스 재활 성화 전의 생체내의 바이러스 게놈로드와 주파수 사이의 가까운 상관 관계는이 돌연변이 바이러스 감염의 지연 결함을 강조 표시합니다.

그림 1. 상패 형성 수단, 전염성 센터 및 qPCR 분석하여 마우스에 γHV68 감염의 측정 도식 다이어그램S.

그림 2. 생체내에서 WT와 돌연변이 바이러스의 γHV68 Lytic 및 잠재 감염. 7 DPI (일 게시물 감염)에서 BALB / C 생쥐의 폐에서 WT와 돌연변이 vBcl - 2 γHV68 바이러스의 급성 복제는 (A) 상패 분석​​에 의해 결정되었다. (B와 C) 지라 전염성 센터 (B)와 감염된 생쥐의 spleens에서 바이러스 게놈로드 (C) 각각 전염성 센터 분석 및 qPCR에 의해 28 DPI에서 측정되었다. 레드 라인, 표시된 값의 평균. NS, 중요하지 않습니다.

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토론

γHV68 널리 인간 γ - HVs ^2,4,5의 pathogenesis을 이해하기위한 모델로 사용되고 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 생쥐의 비강 접종 후 γHV68의 급성 및 잠재 감염을 평가하는, 전염성 바이러스 titer에 대한 상패 분석​​, 바이러스 잠재 부하에 대한 IC 분석 및 바이러스 게놈 하중에 대한 qPCR을 포함하여 세 정기적으로 사용하는 방법을 설명했다.

플라크 분석은 감염된 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
재료 이름	준비 절차
바이러스성 플라크 분석을위한 메틸 셀룰로오스 (MC) 오버레이 매체	열 ~> 80 TC 병에 증류수 250 ML ° C (전자 레인지에서 3 분 끓는) 녹아까지 저열 이상의 감동, 온수 물로 점차적으로 2.5 g MC 가루를 추가합니다. 액체 사이클에서 15 분 즉시 압력솥. 4 ° C 하룻밤에 autoclaved MC 미디어를 감동. 200ml 2 250 ML MC 미디어를 결합하여 X 가상 (Gibco - BRL) + 500 ML 오버레이 미디어를주고 50 ML FBS.
수정 / 상패 분석​​을위한 매체를 얼룩	0.2 % (W / V) 20 % 에탄올에 크리스탈 바이올렛.
ACK 용해 완충액	NH 4 망할 CIA 0.15M, KHCO 3 10mM, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.1mM
완전한 DMEM	Dulbecco의 수정된 이글 배지2 MM L - 글루타민,, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (Gibco - BRL); (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS Invitrogen)과 보완.

시약의 이름	회사	카탈로그 번호
케타민을	시그마 - 올드 리치	K2753
Xylazine	시그마 - 올드 리치	X1251
메틸 셀룰로오스	시그마 - 올드 리치	M0512 - 250g
이 X 가상	생명 기술	11,935
셀 스트레이너	BD Faclon	352,340
옴니 조직 균 질기	오마이 뉴스 인터내셔널 국제	TH115
DNeasy 혈액 및 조직 키트	Qia세대	69,504
iQTM SYBRH 그린 Supermix	BioRad	170-8882
CFX96 실시간 PCR 시스템	바이오 방사선	184-5072
세포 카운터	바이오 방사선	145-0001
Sorvall SA - 600	써모 과학	096-124022