RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

요약

이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를 결합 생체내에서 이뇨 분석은 모기 유체 배설에 있습니다.

초록

이 비디오 프로토콜은 곤충에서 특정 유전자를 분해하고 배설 률을 측정하는 소설 bioassay를 수행하기위한 효과적인 기법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충의 이뇨 과정의 이해를 얻는 데 사용하며 단일 혈액 식사에서 액체의 엄청난 양의 걸릴 수있는 혈액 먹이를 arthropods의 이뇨의 연구에 특히 유용합니다.

생체내의 이뇨 분석에서와 결합된 이러한 RNAi - 중재 유전자 최저는 Aedes aegypti 모기 이뇨 ¹ aquaporin 유전자의 RNAi-매개 최저의 효과를 연구하기 위해 한센병 연구소에 의해 개발되었다.

프로토콜은 두 부분의 설정은 다음과 같습니다 첫 번째 데모는 간단한 모기 분사 장치를 구성하는 방법과 RNAi - 중재 유전자 최저에 대한 모기의 흉부에 dsRNA를 준비하고 주입하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 데모를 결정하는 방법을 보여줍니다생체내의 bioassay에를 사용하여 모기의 배설 속도.

프로토콜

부 전 - 성인 Aedes aegypti 모기에 RNAi - 중재 유전자 최저. 실험 개요는 그림 1을 참조하십시오.

1. dsRNA 합성

1. 관심과 제어 dsRNAs의 유전자에 대한 구체적인 dsRNAs을 합성. 주 : 우리는 3 '특정 cDNA ² 월말과 5 부착된 T7 뇌관 시퀀스로'에서 끝 (5'-TAA 전술 GAC TCA CTA 위치한 300-500 기본 쌍의 범위에서 PCR 단편을 위해 개발 primers를 추천 TAG GG-3 '). 파편의 특이 사항은 BLASTN 분석 ³ 확인하여야한다.
2. dsRNA를 합성하기위한 전사 반응을 T7 RNA 중합 효소를 활용 Ambion Megascript T7 높은 항복 전사 키트 (Ambion, 시약 표)를 사용합니다. 참고 : 유사한 시약 및 키트 다른 곳에서 사용할 수 있습니다.
3. dsRNA를 정화하려면 Megascript 키트와 지침에 따라 염화 리튬으로 침전.
4. purificat 후이온, 멸균 물 속에서 dsRNA 펠릿를 해산. microinjection에 대한 적절한 점도를 보장하기 위해 dsRNA 농도 2 μg / μl를 초과해서는 안됩니다.

2. 사출 준비

1. 간단한 마이크로 주입기는 튜브, 가위, 금속 바늘, 1 ML의 주사기, 그리고 한 ML 플라스틱 피펫 팁을 (그림 2 참조)을 사용하여 건설 수 있습니다. 튜브는 길이 ~ 40cm로 절단한다. 또한, 자동화된 마이크로 주입기는 그러한 Drummond Nanojet II ^4로 사용될 수 있습니다.
   1. 이 ML 눈금 표시에서 주사기의 팁 (바늘 허브)를 잘라 플런저에서 고무 플런저 헤드를 제거합니다.
   2. 고무 플런저 머리와 장소 다시 바늘 허브의 고무 플런저 머리에 금속 바늘을 사용하여 펀치 구멍.
   3. 튜브의 한쪽 끝을에 바늘 허브를 놓고 마우스 피스 (또는 10 ML 싸이로 사용됩니다 다른 쪽 끝을에서 1 ML 플라스틱 피펫 팁을 배치ringe)는 주사에 필요한 공기 압력을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
2. 고무 플런저 머리에있는 구멍에 유리 모세관 바늘을 놓고 너비는 액체를 통해 흐를만큼 큰 수 있도록 바늘의 팁을 끊다. 참고 : 바늘 끝의 최적 크기는 경험적으로 결정되어야한다 - 바늘 너비가 너무 작은 경우 바늘의 너비 이것이 외상과 높은 모기 사망률집니다 너무 큰 경우, 그것은 침투하기가 불가능합니다 모기 외골격.
3. 준비된 dsRNA 샘플에서 잠수함 주입 바늘과 마우스 피스 (또는 주사기)로 액체를 빨아하여 주사 바늘로 액체 샘플을 그립니다. 참고 :이 단계는 (아래) 생체내의 이뇨 분석 프로토콜에서 사용되는 PBS 버퍼를 비롯하여 모기에 주입되는 모든 액체 시약에 대해 동일합니다.

3. 모기를 수집하고 마취

1. Collec수거 유리병에 배터리 구동 흡인기로 하지마 모기. 수거 유리병 이상의 모자를 놓고 모기를 마취하기 위해 깨끗한 CO ₂ 패드에 병을 놓습니다. 참고 : 또한 모기가 얼음위에 anesthetized 될 수 있습니다.

4. 모기 분사

1. 수거 유리병을 열고 직접 CO ₂ 패드에 모기를 넣고 모기가 anesthetized 때까지 기다립니다.
2. 모든 남성 폐기하십시오.
3. 주사를 더욱 쉽게 액세스할 수 있도록 측면에 모기를 줄입니다.
4. 부상을 피하기 위해 다리 또는 날개에 의한 모기를 잡아. 당신은 또한 훌륭한 화필이나 모기를 조작하기 위해 깃털을 사용할 수 있습니다.
5. 첫 모기를 주입하기 위해 준비가되면 부드럽게 포셉와 흉부의 한쪽을 지원하며 흉부 반대편 (그림 2)로 바늘의 끝부분을 삽입합니다. 그것은 표피의 얇은 부분에 주입하고 바늘을 밀어 피하는 것이 좋습니다흉부에 깊이를 O.
6. 바늘이 곳에되면 모기에 액체를 폭파. 원하는 금액은 바늘의 액체 초승달 모양을 모니터에 따라 결정됩니다. 특정 볼륨에 필요한 mm의 갯수는 유리 모세관 바늘 (πr ^{2 시인데)의} 실린더 부피를 계산하여 결정하실 수 있습니다. 일반적으로 주사에 사용되는 dsRNA의 효과적인 금액은 1 μg이다.
7. 액체는 모기에 주입되면 바늘을 조심스럽게를 철회. 흉부의 외부에 대형 액체 비말 형태 않으면 모기는 폐기되어야합니다. 그리곤, 다음날 모기와 함께이 과정을 반복합니다.

5. 모기 복구 및 저장

1. 주입 후 저장 용기에 모기를 놓습니다. 예를 들어, 한 파인트 왁스는 메쉬가 마분지 뚜껑으로 안전 커버와 골판지 컵 (수프 컵) 정렬했습니다. 뚜껑이 노출되는 덮고 메쉬에 맞을 부분이 있습니다. 일단 모든 MOsquitoes가 컨테이너에 배치되며, 인큐베이션위한 환경 제어 챔버에 컨테이너를 놓고 같은 메쉬 커버의 상단에 배치 20 % 자당 젖었 면화 공 같은 음식 소스와 모기를 제공하고 있습니다. 생체내의 이뇨 분석에를 수행하기 전에, 각 모기의 수화 상태를 표준화하기 위해 12 시간 동안 물 소스의 dsRNA-주입 모기를 빼앗다.
2. dsRNA - 중재 유전자 최저의 효율이 변수가 될 수 있습니다. 유전자 입을은 주입 후 1 하루를 시작할 수 있으며 주사 후 ⁴ 육일까지 지속될 수 있습니다. 최대 유전자 최저를 달성하기위한 최적의 시간은 사용하는 모든 유전자에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 우리가 진행하기 전에 일반적으로, 우리는 dsRNA 주입 후 삼일 정도 기다리십시오.

파트 II - 생체내의 이뇨 분석에서는 Aedes aegypti 모기 성인에서

참고 :이 프로토콜은 작성자에 의해 개발되었으며황열병의 모기의 aquaporin 단백질의 RNAi - 중재 최저 사용은 aegypti ¹ Aedes. 개별 모기 사이의 다양성을 방지하려면 모기는 그룹에서 분석되어야한다. 기술적인 이유로 치료를 당 5 모기 그룹을 권장합니다 - 모기가 주사 후에 소변 나물을 시작하기 전에 첫 번째 체중 측정을 수행하는 시간을 제한 금액이 있습니다.

6. 모기를 수집하고 마취

1. 모기를 수집하기 전에 분석 정밀 밸런스를 사용하는 모자와 빈 컬렉션 유리병의 무게를 기록합니다. 이 유리병은 모든 후속 측정에 사용됩니다.
2. 흡인기로 무게 수집 유리병에 5 암컷 모기를 수집합니다. 수거 유리병 위에 뚜껑을 놓고하고 모기를 마취하는 데 몇 초 동안 CO ₂ 패드에 앉자.

7. 초기 무게 측정

1. T를 타고정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 5 모기 그는 초기 체중 측정.
2. 모기의 무게와 뚜껑으로 수집 병을 복용하고 뚜껑이있는 빈 컬렉션 유리병의 무게를 빼는 방법으로 다섯 모기 그룹의 무게를 계산합니다.
3. 수거 유리병을 열고 모기의 무게를 기록 후 직접 CO ₂ 패드에 모기를 놓습니다. 모기가 무게를 측정하는 동안 깨어하기 시작한다면, 그것을 열고 패드에 모기를 삽입하기 전에 몇 초 동안 CO ₂ 패드에 유리병을 설정합니다.

8. 사출 준비

1. RNAi - 중재 유전자 최저 프로토콜에 주어진 지시에 따라 마이크로 주입기를 설정합니다.
2. 마이크로 분사기의 유리 모세관 바늘을 놓고 바늘의 팁을 끊다 때문에 너비가 liq 충분히 크다을 통해 흐를하는 UID.
3. 잠수함 PBS 버퍼에 바늘과 주사 바늘로 버퍼를 그려,이 프로토콜에 사용할 원하는 금액은 각 모기에 대한 PBS의 1.25 μl입니다. 참고 :이 금액은 여성 모기 ^오에 의해 함락되는 혈장의 평균 금액을 모방한 것이었 지요.

9. 모기 분사

1. 마이크로 주입기로 쉽게 접근할 수 있도록 모기를 줄입니다.
2. 바늘이 곳에되면 모기에 PBS 버퍼를 날려요.
3. 액체는 모기에 주입되면, 비말은 흉부의 외부에 형성하고 있습니다. 이러한 비말은 신중하게 다음 단계 전에 제거되어야한다.
4. 다음은 모기와 함께 사출 과정을 반복합니다. 경험을 바탕으로 모기 생존율은 주사 후 거의 100 %가 될 것입니다.

10. 무게 모기

1. 주사 후에는 부드럽게 수집 유리병에 모기 배치그리고 모자. 정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 5 모기의 첫 번째 체중 측정을 가져가라.
2. 뚜껑과 모기와 수집 유리병의 무게를 복용하여 5 모기 그룹의 무게를 계산하고 뚜껑이있는 빈 컬렉션 유리병의 무게를 뺍니다. 참고 : 모기가 CO ₂ 마취 패드에서 제거 후 2 분 이내에 소변을 만들어내는 시작할 것이다, 그래서 그들이 나물을 시작하기 전에 체중 측정을하는 것이 중요합니다.
3. 그들은 소변을 만들어내는 시작됩니다 작은 용기에 모기를 놓습니다.

11. 두 번째 이후 무게 측정

참고 : 모기의 무게 측정이 30 분 간격으로 복용해야하지만, 이것은 배설 속도에 따라 짧은 이상 간격을 조정할 수 있습니다.

1. 30 분 후에, grou를 수집뚜껑과 같은 컬렉션 유리병에 흡인기 5 모기 P. 정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 모기의 다음 체중 측정을 가져가라.
2. 측정 후, 다음 30 분 동안 동일한 지주 용기에 모기를 놓습니다.
3. 시간을 원하는 금액에 대해이 과정을 반복합니다.

12. 결정 모기 배설 속도

1. 5 모기의 그룹으로 주입되었다 액체의 총 금액이 즉시 주사 후 체중에서 모기의 초기 무게를 빼는 방법으로 계산 할 수 있습니다.
2. 특정 시점에서 모기의 그룹에 의해 배설되었다 소변의 양은 특정 시점에서 모기의 무게에서 모기의 초기 무게를 빼는 방법으로 계산 할 수 있습니다.
3. 특정 시점에서 배설 율은 divi하여 계산할 수액체 주입 (표 1)의 총 금액하여이 시점에서 배설 소변 딩 금액입니다.

13. 대표 결과

유전자 최저 RNAi - 중재 및 생체내의 이뇨 분석에서이 Aedes aegypti 모기 이뇨의 aquaporins의 효과를 연구하기 위해 한센 실험실에서 사용되었습니다. Aedes aegypti Malpighian tubules로 표현되는 세 aquaporins는 모기 ¹ 제어할 비해 배설 속도에 상당한 효과를 무너 뜨 렸어되었다. 그림 4는 이뇨 분석은 Aedes aegypti 및 Culex quinquefasciatus 사이에 배설 률을 비교하는 데 사용되었습니다 실험의 대표적인 결과를 보여줍니다 서로 다른 온도에서.

1 그림. 10 모기 EA의 RNAi / 이뇨 분석의 흐름도 5. 그룹채널은 특정 유전자에 대한 dsRNA을 주사하고 십 모기 오천 그룹은 통제 dsRNA로 주입된다. PBS 200 μm의 HgCl ₂ 주입 모기의 또 다른 그룹은 긍정적인 컨트롤로 사용됩니다. 이 모기는 주입하기 전에, 3 시간 삼십분 간격의 주입 후에 무게가있다.

그림 2. RNAi - 중재 유전자 최저 및 생체내의 이뇨 분석의 간단한 미세 주입 장치. A. 유리 모세관 바늘은 주사에 사용. 회색 삼각형은 모기에 액체 주입의 양을 표시하는 바늘에 그려진 mm 단위로 나타냅니다. B. 한 ML의 주사기는 마이크로 주입기을 만드는 데 사용. 흰색 삼각형 바늘 허브를 대표하고 검정색 삼각형은 주사기의 플런저에 연결된 고무 플런저 머리를 나타냅니다. C. 관은에 마우스 피스를 장착하는 데 사용주입기. microinjection 장치의 마우스 피스로 사용됩니다 D. 한 ML 일회용 피펫 팁 (파란색 팁). E. AD 부품을 통합 microinjection 장치. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 3. 최적 모기 주입 사이트. A. 여성 Aedes aegypti 모기는 흉부에 큰 비늘 사이에 유리 모세관 바늘로 주입. 검은 막대는 크기 비교를위한 1mm를 나타냅니다. 암컷 모기 흉부의 그림 B.와 흰 반점은 모기 외골격의 하얀 비늘을 나타냅니다. 주사 바늘은 피어스 반점 사이에 모기가 주사하는 동안 사망률을 최소화해야합니다.

4 그림. 온도의 영향Culex quinquefasciatus 및 Aedes aegypti의 이뇨에 진짜야가. 이뇨 분석은 서로 다른 온도에서, 모기, Aedes aegypti 및 Culex quinquefasciatus의 두 종족으로 수행되었다. 주사 후 첫 시간 동안 배설 율은 퍼센트에 있습니다.

그룹	타라 (G)	주입하지 (G)	주입 후 (G)	1 시간 게시물 주입 (G)	평균 중량 (MG)	양을 주입 (μl)	금액 배설 (μl)	% 배설
일	7.5938	7.6057	7.6104	7.6096	2.38	0.94	0.16	17.0
2	7.8252	7.8349	7.8415	7.8403	1.94	1.32	0.24	18.2
3	7.8896	7.9026	7.9077	7.906	2.6	1.02	0.34	33.3

생체내의 이뇨 분석 결과 표 1. Aedes aegypti 4.에서 Aedes aegypti 모기 암컷으로 수행한 생체내의 이뇨 분석에서 ° C.의 원시 데이터

토론

사용되는 RNAi 프로토콜은 캘리 포니 아주 리버 사이드 ^6,7 대학에서 알렉산더 Raikhel의 연구실에서 개발 Garver 및 Dimopoulos ^사에 의해 출판 프로토콜과 비슷했습니다. 이 비디오 프로토콜에 표시된 실험적 접근 방법은 생체내 환경에의 곤충 이뇨에 관련된 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 곤충, Malpighian의 tubules의 배설 기관은 이뇨를위한 '단순'모델 시스템으로...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약이나 장비의 명칭	회사	카탈로그 번호	댓글
MEGAscript T7 고수익 키트	Ambion 주식 회사	AM1334
PBS 버퍼	시그마 - 올드 리치	P4417
플라스틱 튜브	지역 업체		PVC
한 ML 플라스틱 피펫 팁	VWR	83007-376	블루 팁
한 ML의 주사기	Becton, 디킨스와 회사	309,602
가위	지역 업체
금속 바늘	캐롤라이나 체액	654,307	크기 5
패드 들아	Genesee 과학	789,060
배터리 구동 흡인기 W / 컬렉션 유리병	UPMA 실험실	IPMM 2000
파인 팁 포셉	세계 정밀 계측기	14,095
유리 모세관 바늘	세계 정밀 계측기	1B200-6
스테레오 해부 현미경	Leica 마이크로 시스템즈	S6D
분석 정밀도의 균형	Mettler 톨레도	AB54S
자당	시그마 - 올드 리치	84,097
1 파인트들이 줄지어 종이 컵 닦았단	지역 업체		제조 수프 컵
메쉬 네트	지역 업체		플라스틱 플라이 거즈