Ferumoxytol, FDA 승인 철 산화물 Nanoparticle과 함께 줄기 세포를 라벨링

요약

우리는 FDA 승인, superparamagnetic 철 산화물 (SPIO), ferumoxytol (Feraheme)와 줄기 세포를 라벨링 및 추적을위한 기술을 설명합니다. 시각화에 대한 자기 공명 (MR) 영상을 이용하여이 세포 이미징 기술은 환자의 성공 여부에 줄기 세포 engraftments의 장기 모니터링 및 진단을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다.

초록

줄기 세포 기반 요법은 재생 의료 분야에 대한 상당한 잠재력을 제공합니다. 그러나, 많은 이식 세포의 생체내 반응 속도론에 관한 이해에 남아 있습니다. 반복 생체내에 이식 줄기 세포를 모니터하는 비침습 방법은 수사관이 직접 줄기 세포 이식을 모니터링하도록하고 성공 여부 engraftment 결과를 확인합니다.

줄기 세포의 다양한 수많은 어플 리케이션을위한 조사하고 있습니다. 인간의 배아 신장 293 (HEK293) 세포, 인간 mesenchymal 줄기 세포 (hMSC)과 유도 pluripotent 줄기 (IPS) 세포 :이 프로토콜은 3 개의 줄기 세포 집단에 초점을 맞추고 있습니다. HEK 293 세포는 가지각색으로 아데노 바이러스 5 DNA와 문화 속에서 자란 인간의 배아 신장 세포에서 파생됩니다. 그들이 쉽게 양식 때문에 이러한 세포가 광범위하게 연구에 사용되고, 빠르게 성장하고 쉽게 transfected 수 있습니다. hMSCs는 성인 골수에서 발견됩니다. 이러한 세포 CAmultipotency 또는 세포 운명의 제한된 수의으로 차별화할 가능성을 유지하면서 N은 undifferentiated 세포로 복제됩니다. hMSCs는 osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, 힘줄, 근육 및 골수의 기질을 포함 mesenchymal 조직의 lineages로 구별하실 수 있습니다. IPS 세포는 유전자 유전자와 배아 줄기 세포의 정의 속성과 비슷한 요소를 표현하기 위해 수정되었습니다 성인 세포를 다시 프로그램입니다. 이러한 세포들은 모든 세포 lineages ^1로 차별화하는 능력을 가지고 pluripotent 의미입니다. 모두 hMSCs와 IPS 세포는 조직 재생 능력 - 생체내를 증명하고있다.

함께 superparamagnetic 철 산화물 (SPIO) nanoparticle 셀 라벨의 사용과 자기 공명 (MR) 영상은 가까운 미세한 해부 해상도에 의한 줄기 세포의 생체내 추적에 효과 입증, 그 이상 혈액 반감기는 세로 이미징과를 허용 높은 sensitivitSPIO의 MR 이미징에서 제공하는 세포 감지 y는 ^2-4 nanoparticles. 또한, SPIOs의 사용과 MR 영상은 임상적으로 번역입니다. SPIOs는 플라즈마 구성 요소에서 bioreactive 철 코어를 포함하는 역할을 dextran, carboxydextran 또는 전분 표면 코팅과 철 산화물 코어로 구성되어 있습니다. 이러한 에이전트는 T2 - 가중 MR 이미지 ⁵ 감소 신호로 이어질 현지 자기장 inhomogeneities을 만듭니다. 불행하게도, SPIOs은 더 이상 생산되고 있지 않습니다. 2 세대, ultrasmall SPIOs (USPIO)는, 그러나, 대안을 제공합니다. Ferumoxytol (FerahemeTM)는 polyglucose sorbitol carboxymethylether의 코트로 둘러싸여 아닌 stoichiometric 자철광 코어로 구성된 하나 USPIO입니다. ferumoxytol의 콜로이드, 입자 크기는 빛의 산란에 의해 결정 17-30 NM됩니다. 분자량은 750 kDa이며, 2T MRI 분야에서 상수 relaxivity은 58.609 MM - 1 - 1 초 강도 ^4. Ferumoxytol은 최근 FDA 승인되었습니다신장 장애 환자 ⁶ 철분 결핍증의 치료에 S는 철 보충. 우리 그룹은 셀 라벨 응용 프로그램을위한 '오프 라벨'사용이 에이전트를 적용했습니다. 우리의 기술은 MR 이미지에 라벨 세포의 중요한 MR 신호 효과를 리드 ferumoxytol와 줄기 세포의 효율적인 라벨을 보여줍니다. 이 기술은 사전 임상 및 임상 설정에서 줄기 세포 요법의 비침습 모니터링 적용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 1 일

1) 플레이트 세포

1. 적어도 18-24시간 전에 라벨에 confluency 80 %에서 T75 플라스크에 플레이트 hMSC. 다른 선박에 대한지도를 위해 표 1을 참조하십시오.

2. 날 2

2) 라벨 솔루션을 준비합니다. 이 준비 400 μg 철 / ML의 농도와 confluency 80 % (1) T75 플라스크 레이블을 것입니다. 다른 선박에 대한지도를 위해 표 1을 참조하십시오.

1. 15 ML 원뿔 튜브 : 혈청이없는 미디어 1 ML과 ferumoxytol의 93.1 μl (30 MG / ML 주식)를 혼합하여 솔루션 (해결책 1) 만듭니다.
2. 두 번째 15 ML 원뿔 튜브 : 혈청 무료 매체와 프로타민 황산 7 μl (10 MG / ML 재고 없음) 1 ML을 혼합하여 두 번째 솔루션 (해결책 2) 만듭니다.
3. 각 솔루션은 5 분 휴식을 허용합니다.
4. 함께 해결책 1과 2를 추가합니다. 부드럽게 새로운 라벨 솔루션을 섞는다. 5 분 휴식하는 솔루션 USPIO - PRO을 허용하도록 허용tamine 황산의 단지가 형성.
5. SPIO / 7 ML의 최종 볼륨 프로타민 황산 용액의 혼합이 ML에 혈청이없는 미디어의 5 ML을 추가합니다.

3) 라벨에 대한 전지를 준비

1. 세포에서 미디어를 기음.
2. 천천히 거리에 대비 에이전트 이해와 라벨 효율에 악영향을 수 잔류 혈청 단백질 및 기타 미디어 구성 요소를 씻어 사전 예열 MG / CA - 무료로 D - PBS 또는 혈청 프리 미디어로부터 2-3 ML로 한번 세포를 씻는다. 린스 액을 기음.

4) 레이블 셀

1. 세포로 해결책을 라벨의 전체 7 ML을 추가합니다.
2. 인큐베이터 (37 ° C / 5퍼센트 CO _2)와 세포를 4 시간 동안 상표 솔루션에 품어 수 있도록 장소에 세포.
3. 10 % 최종 혈청 농도를 달성하기 위해 세포의 라벨 솔루션으로 FCS 700 μl를 추가합니다. 혈청은 세포가 익숙한 어떤의 풍부한 환경을 다시 설정하고, MI에 도움에 추가됩니다돌연 변화의 혈청이없는 환경에 24 시간 노출 초래할 수 세포 죽음을 nimizing.
4. 세포가 추가로 20 시간 라벨 솔루션으로 품어 수 있습니다.

3. 3 일

5) 표시 전지를 준비

1. 세포의 라벨 솔루션을 기음.
2. 부드럽게 미리 예열 MG / CA - 무료로 D - PBS로부터 2-3 ML로 세포를 씻어. PBS를 기음. 그것은 MG와 CA는 다음 단계에서 트립신의 효율성에 악영향을 줄 것이다대로 MG / CA - 무료로 PBS를 사용하는 것이 중요합니다.
3. 세포에 미리 예열 0.05 %의 트립신 2 ML을 추가하고 술병의 전체 표면을 보장하기 위해 앞뒤로 술병을 기울이 트립신의 얇은 층으로 덮여있다. 인큐베이터 (37 ° C / 5퍼센트 CO _2)의 세포를 놓고 세포가 접시에서 분리 시작 때까지 세포 5~7분 또는 휴식을하실 수 있습니다. 그것은 현미경으로 부대를 확인 할 수 있습니다. 부드럽게 필요한 경우 FA로 술병의 측면을 탭세포 표면 부대를 cilitate.
4. 트립신을 중화하기 위해 술병에 사전 예열 전체 미디어의 4 ML을 추가합니다. 부드럽게 여러 번 트립신 / 미디어 / 셀을 솔루션을 pipetting 아래로 술병을 씻어. 15 ML 원뿔 튜브에 전체 솔루션을 수집합니다. 5 분 400 RCF의 셀 솔루션을 원심 분리기.
5. 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는를 주의깊게 기음. 미디어 5 ML (혈청 포함하거나 혈청 무료)에있는 세포를 Resuspend. 5 분 400 RCF의 셀 솔루션을 원심 분리기.
6. 단계 5.5에서 설명한 세포 세척을 반복합니다. 전체에서 세포는 미디어와 세포의 표면에 잔류, 무료 대비 에이전트를 제거하는 세 번 씻어서 것입니다.
7. 세포가 이전 세척시 손실됩니다로서 가장 정확한 셀 카운트를 달성하기 위해이 시점에서 세포를 세어보세요. 세포의 생존 테스트를 수행합니다. 세포는 이제 이후 분석 및 실험 또는 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. MR 영상은과 T1 - W로 수행할 수 T2 - W 매개 변수, ferumoxytol는 T2 - W 대비 에이전트이지만 때문에 ferumoxytol는 T1 효과를 전시하고 있습니다. 이미지 ferumoxytol 표시 전지하는 데 사용할 수있는 대표 T2 - W MRI 매개 변수는 다음과 같습니다 : 60-80 MS의 2000년부터 2500년까지 MS와 TE의 TR와 FSE 또는 SE_Multislice 시퀀스를. T1 - W 이미지를 얻기위한, FSE에서 TE 값 또는 SE_Multislice 시퀀스를 감소하거나 높은 TR과 낮은 TE와 GRE 시퀀스를 사용합니다. 그림 4는 표시 줄기 세포 이미징에 대한 생체내 응용 프로그램에서 가능성을 보여줍니다.

4. 대표 결과 :

라벨 세포 T2 - 가중 MR 이미지에서 어둡게 또는 중대한 부정적인 대비 효과 및 T1 - 가중 MR 이미지에 이트닝이나 긍정적인 대비 효과 (그림 2)를 보여줍니다. 세로 MR 이미징 및 생존 능력 테스트는 오일 게시물 라벨이 더 큰 MR 신호 및 레이블이 지정되지 않은 컨트롤 (데이터가 표시되지 않음)에 비해 생존 능력에없이 큰 영향을 증명하지 수행.

jove_content "> 라벨 줄기 세포는 이후 다양한 세포 유형으로 차별하거나 정맥 생체내 조사에 대한 주입 수 있습니다.

그림 1. 철 산화물 nanoparticle, ferumoxytol와 함께 줄기 세포를 라벨에 대한 도식 시간 라인.

그림 2. 세포 펠렛의 세포와 화살 크로스 섹션 thrrough eppendorf 튜브의 MR 이미지. A) 컨트롤 레이블이 지정되지 않은. B) 상당한 T2 또는 부정적인 대비 에이전트 효과 T2 - 가중 FSE 또는 SE_Multislice 영상과 T1 - 가중 GRE 시퀀스에서 T1 또는 긍정적인 대비 에이전트 효과를 입증 라벨 세포.

그림 3. 셀 화소의 세포와 eppendorf 튜브의 화살 크로스 섹션수 있습니다. 조금은 10,000으로 표시 ferumoxytol 세포 T2 - W MR 영상을 통해 검색하실 수 있습니다.

그림 4. ferumoxytol - 표시 줄기 세포의 MR 시각화는 murine 대뇌 심실로 주입. USPIO - 표시 줄기 세포없이 주사로 murine barin의) 축방향, MR 이미지. B) 코로나 축방향, C) 및 D) 화살 MR 이미지는 murine 머리에 주입 USPIO - 표시 줄기 세포 (흰색 화살표)의 T2, 부정적인 대비 효과를 묘사.

다른 혈관에서 세포를 라벨에 대한 표 1. 수량 adaptions.

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토론

줄기 세포 engraftments의 효능을 개선하는 것은 재생 의료의 발전을 위해 중요합니다. 생체내의 줄기 세포에 대한 비침습 시각화 기술은 크게 성공 engraftment의 결과로 이어질 메커니즘을 이해하는 능력을 향상시킵니다. 이러한 우리가 보여준 프로 시저와 같은 MR 시각화, 대한 자기 상표는 MR 영상과 함께 줄기 세포의 생체내 추적하실 수 있습니다. 자기 (磁气) 표시 줄기 세포는 이전 대?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
D - 가상 높은 포도당	시그마	D5648	사용할 수 원하는 줄기 세포 라인을위한 또는 다른 기본 매체
D - PBS (CA + +, MG + + 무료)	GIBCO	14190-144
트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.05 %	Invitrogen	25300-120
태아 소 혈청 (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Ferumoxytol (Feraheme)	AMAG	59338-0775-​​01
프로타민 황산	APP 알약.	22,930