태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

요약

우리는 고도로 피더 glial 세포 레이어를 사용하지 않고 태아 쥐 두뇌의 hippocampal 뉴런을 정화의 문화에 대한 프로토콜을 제공합니다.

초록

쥐, murine hippocampal 뉴런의 차 문화를 널리 신경 생물학에서 세포 메커니즘을 공개하는 데 사용됩니다. 개별 뉴런을 분리하고 성장함으로써, 연구자들은 세포 인신 매매, 세포 구조 및 생화 학적 기법의 다양한 사용하여 개별 단백질 지방화에 관련된 특성을 분석할 수 있습니다. 이러한 실험의 결과는 메모리와 교육의 신경 기초를 다루는 이론을 테스트하기 위해 중요합니다. 그러나 실험의 이러한 형태의 모호하지 않은 결과가 다른 뇌 세포 유형별로 최소 오염 물질로의 연결을 문화를 성장 능력에 predicated있다. 이 프로토콜에서는 오염 세포 유형 (즉, astrocytes)를 최소화하면서 건강한 뉴런의 성장을 최적화하기위한 배아 hippocampal 세포의 신경 세포의 성장과주의 해부용으로 설계된 특정 미디어를 사용합니다. 배아 마우스 hippocampal 조직이 디위한 표본의 크기로 인해 유사한 설치류 조직보다 분리가 더 어려울 수ssection. 우리는 배아 일 19 일 (E19) 마우스 새끼에서 해마의 상세한 해부 기술을 보여줍니다. 개별 셀에 대한 최소한의 손상을 제공하면서 일단 hippocampal 조직은 고립되고, 세포의 연결을 부드럽게 분리는 트립신과 결합 조직 세포와는 별도로 고안된 기계 혼란의 묽은 농도로 이루어진다. 장애에 사용되는 pipettes을 준비하는 방법에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다. 최적의 도금 밀도는 성공적인 세포 배양을 최대화하기 위해 immuno-형광 프로토콜 제공되었습니다. 프로토콜은 마우스 hippocampal 세포에서 세포의 연결의 문화에 대한 빠른 (약 2 시간)하고 효율적인 기술을 제공합니다.

프로토콜

1. 기증 설정하기 전에

1. 신경 세포의 수확을위한 태아 새끼를 생성하려면, 19 일 전에 신경 세포 분리의 하루 성인 쥐 사이에 번식을 예약합니다. (C57BL / 6 마우스 연령대 2~8개월이 프로토콜을 개발 목적으로 matings에 사용되었다). 성공적인 짝짓기는 임신 여성, 심장의 고동이나 시각적 확인의 질 플러그의 검색으로 확인하실 수 있습니다.
2. 이전 신경 세포 분리에 일 :
   1. 들어 immunofluorescence 애플 리케이션, 3시 1분 콜라겐 1, 쥐 꼬리 가벼운 코팅 24 잘 플레이트의 코트 유리 coverslips : 폴리-D-라이신 솔루션입니다.
   2. 세포 배양 어플 리케이션, 3시 1분 콜라겐 1, 쥐 꼬리 가벼운 코팅 코트 적절한 크기의 조직 배양 플라스틱 도자기 : 폴리-D-라이신 솔루션입니다.
3. 하룻밤 자외선 아래에서 조직 문화 후드 던 접시를 놓습니다.
4. 이전 멸균 행크의 대차 소금 솔루션 (HBSS)으로 번호판을 씻으사용하는 방법. 코팅 플레이트는 HBSS 가득하고 어두운 4 ° C에서 최대 1 주일 정도 저장할 수 있습니다.

2. 조직 수확

1. 일차 전지 문화의 성장과 같은, 가장 큰주의가 가장 멸균 환경이 가능하도록 행사되어야 할 때 불임은 항상 요소입니다. 멸균 기술에 대한주의와 함께,이 프로토콜에 대한 신경 조직의 초기 절개와 추수는 오염의 최소한의 위험으로 층류 후드 외부에 완료할 수 있습니다. 초기 수확 후 모든 후속 단계는 세포 배양을위한 정격 후드 내에서 최대 무균 조건 하에서 실시되어야한다.
2. 잘린하여 약 19일 포스트 기름지게에서 임신한 쥐를 안락사. 마취가 (Stratmann, 외., 2010) 뇌 세포 죽음을 일으키는 것으로 알려져 있기 때문에 임신 여성을 안락사시켜야하는 마취의 사용은 권장되지 않습니다. 멸균 해부 가위와 집게 사용의 중반 복부 측면에 개구부를 만들마우스를 완전히 뱃속를 공개합니다. 계측기는 알코올과 열린 불꽃을 사용하여 소독 수 있습니다.
3. 태아 새끼는 마우스의 뱃속의 후부 방향으로 위치하게되며 자궁에서 쉽게 볼 수 있어야합니다. autoclaved 멸균 포셉 통해 자궁을 열고 새끼를 제거합니다. 해부 현미경 하에서 무균 거즈에 신선한 멸균 가위와 장소 제거된 머리로 새끼 목을 벨. 멸균, autoclaved 악기 불꽃 알코올 및 이전 오픈 불꽃을 사용하여 세척하고 사용하는 동안이 될 수 있습니다.
4. 멸균 가위 또는 코로 목 뒤쪽에서 강아지의 메스 오픈 두개 사용하기. 이 절차는 일반적으로 척추 구멍에 가위 중 하나 팁을 삽입 후 anteriorly 진행하여 완료할 수 있습니다. 조심스럽게 포셉으로 전체 두뇌를 제거합니다. 멸균 거즈에 머리를 놓습니다. 멸균 메스를 사용하여, 소뇌를 제거 두 반구 (그림 1)로 분리하는 뇌의 중간선을 절개 .
5. 멸균 포셉와 해마 주변 meninges의 작은 부분을 잡고 부드럽게 멀리 그것을 당기십시오. 그것이 해마를 분리하기 전에 meninges를 제​​거하는 엄격하게 필요하지 않지만, meninges의 존재는 멤브레인의 인성으로 인해 더욱 어려워 해마의 절개를 할 수 있습니다. 두 경우 모두, 해마는 meninges가 제거된 후 더 명확하게 볼 수 있습니다. 해마는 반구 및 ventrally 잠함병 (그림 2)의 말초 부분에서 시작 곡선 구조입니다. 내적, 오목, 측면 (꼬리)이 뇌실에 직면하고 있는데, 그것은 이미 무료입니다. 따라서 해마를 분리하기 위해, 하나는 볼록 바깥쪽 면을 따라 절단해야합니다. 절개 후 부드럽게 세포 배양 후드를 예열 (37 ° C) HBSS와 작은 조직 배양 접시에 무균 조직 포셉와 송금 각 hippocampi 리프트. 뇌 조직은 여러 새끼에서 조합하여 사용할 수 있습니다.

"> 3. 조직 분리

1. 100 밀리미터 조직 배양 접시에 무균 HBSS에 3 ML에 무균 메스, 부드럽게 말하다 뇌 조직을 사용합니다.
2. 15 ML 원뿔 튜브로 다진 조직 및 HBSS를 전송합니다. HBSS의 1.5 ML 5 ML의 총 볼륨에 0.25 %의 트립신 용액 0.5 ML을 추가합니다.
3. 모자와 부드럽게 튜브에게 섞어 4-5 시간을 바꾸란. 소화 조직에서 풀려나는 DNA가 거품을 준수하고 다진 조직은 튜브의 아래쪽 (그림 3)에 정착하는 대신 부유하게됩니다대로 거품을 생산하지 않도록하십시오.
4. 5 분마다 위와 같이 15 분 동안 37 ° C에서 반전 튜브를 hippocampal 조직을 품어.
5. 조직은 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
6. 조심스럽게 튜브의 하단에 그대로 조직을두고, 멸균 피펫을 사용하여 여분의 용액을 제거합니다.
7. 5 분 37 ° C에서 HBSS의 5 ML과 조직 펠릿 씻으십시오. 3 회 총을 반복합니다. 티슈가 완전히 정착하도록 허용튜브 다음 세척 단계로 진행하기 전에 때마다 하단 있습니다.
8. 조직 펠렛에서 최종 빨래를 제거하고 신선한 HBSS 2 ML로 바꿉니다.

4. 신경 세포 분쇄

1. 분쇄 단계를 시작하기 전에 화재 광택 파스퇴르의 pipettes을 준비해야합니다. Bunson 버너 사용하여 피펫 개구부의 직경은 (그림 4B) 약간 둥글게되어 크기 및 피펫 개구부의 모서리에서 약 0.5 mm까지 화염에 멸균 9 인치 파스퇴르 피펫 팁 (그림 4A)을 누르고 있습니다. 분쇄 프로세스를 시작하기 전에 완전하게 냉각 피펫을 허용합니다.
2. 정상 멸균 9 인치 파스퇴르 피펫 사용하여 부드럽게 조직에게 7 번 총 씹다. 큰 조직 조각이 시점에서 정상이며 이전 다음 단계로 이동으로 튜브의 바닥에 정착하도록 허용해야한다.
3. 신선한 멸균 50 ML 원뿔 튜브로 뜨는을 전송합니다.
4. 나머지 조직하려면, 무균 HBSS 2 ML을 추가하고 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 5 회 총 씹다.
5. 남아있는 모든 큰 조직 조각은 튜브의 바닥에 정착 4 ML dissociated의 연결을 세포 전체에 대한 이전 뜨는로 뜨는 결합하도록 허용합니다.

5. 세포 도금

1. hemocytometer를 사용하여 dissociated 세포를 세어보세요.
2. 일반적으로 한 세포 숫자가 결정되었으며, 도금 후 발생할 수있는 모든 세포 죽음을 계정에 해당 최종 숫자의 20 %를 뺍니다.
3. 셀은 아래 권장 사항을 사용하여 도금 수있다 :
   24 잘 접시에 coverslips 위해 - 6 X 10 ⁴ 셀 / 음 0.5 ML의
   4 X 10 ⁵ 셀 / 3 ML의 플레이트 - 60 밀리미터 조직 배양 플레이트에 대한
   6 X 10 ⁶ 셀 / 6 ML의 플레이트 - 100 밀리미터 조직 배양 플레이트에 대한
4. Neurobasal 도금 미디어의 지정된 볼륨 (Neurobasal와 함께 적절한 세포 숫자를 혼용B27 보충을 포함한 미디어 [1 ML / 50 ML], 0.5 MM 글루타민 솔루션, 25 μm의 제품 글루 탐 산염 (미스터 147.13 g / 몰), 페니실린 (10,000 대 / ML) / 스트렙토 마이신 (10,000 μg / ml) 쇼핑 [250 μl / 50 ML] , 1mM HEPES (미스터 238.3 g / 몰), 10 %의 히트 Inactivated 기증자 말 혈청)과 접시에 세포를 추가합니다. 소용돌이 모양의 접시는 부드럽게 골고루 세포를 배포합니다. HI-기증자 말 세럼은 성장의 첫 24 시간 동안 세포를 풍부하게하기 위해 도금 미디어에 추가됩니다. 세포는 이후 혈청에서 투약하고 각 미디어 교체시 혈청 시리얼 감소하여 세럼 - 프리 환경으로 돌아왔습니다. 이것은 높은 농도의 조미료는 여기에 추가된 낮은 농도에서,의 연결을 세포 배양에 대한 독성있는 동안, 그것 이외의 연결을 세포 ¹¹ 첨부 파일을 억제 것을 또한 지적되어야한다. 그러나, 그것은 문화의 첫 24 시간 동안 도금 미디어에 추가되어야하며 그 이후 세포의 neurotoxicity을 방지하기 위해 어떤 먹이 미디어 밖으로 떠났어.
5. 피5% CO ₂ 배양기는 하룻밤 사이에 37 ° C에서 뉴런을, 레이스.
6. 세포에서 미디어의 절반 볼륨을 제거하고 Neurobasal 먹이 미디어 같은 볼륨 (Neurobasal 미디어 B27 보충을 포함하는으로 교체 [1 ML / 50 ML], 0.5 MM 글루타민 솔루션 페니실린 (10,000 대 / ML) / 스트렙토 마이신 (10,000 μg / ML) [250 μl / 50 ML], 1 밀리미터 HEPES (미스터 238.3 g / 몰).
7. 뉴런은 오래된 미디어의 절반을 제거하고 신선한 Neurobasal 먹이 미디어의 같은 볼륨으로 교체하여 4 일에 싫증이되어야한다. 의 연결 프로세스는 1 일 (그림 5A)에 표시하며 10 일째 (그림 5B)에 의해 널리 사용되기 시작합니다.

6. 대표 결과

기본의 연결 세포를 성장 및 문화 능력은 신경 과학의 indispensible 부분이되었습니다. 차 문화는 연구자가 특정 세포 경로를 분석하기 위해 화학적 변형과 치료, 대상 LOC를 허용통제된 환경에서 alization과 성장 패턴. 이러한 절차의 대부분은 세포 반응에서 특정 변화를 시각화하는 정교한 방법론을 활용. 이 경우, hippocampal 뉴런은 그대로 뇌에 분석하기 어려운이 아니라면 불가능한 증명 특정의 연결 경로를 연구하는 데 사용됩니다. 두뇌의 특정 영역에서 뉴런의 근처 균질 인구의 준비는 뇌 기능을 연구에 중요합니다. 개별 뉴런 분자 효과는 메모리 또는 학습과 같은 높은 순서 경로를 delineating의 수단이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 glial 세포의 피더 레이어없이 hippocampal 뉴런의 비교적 순수한 문화를 듭니다적으로 이러한 뉴런 쉽게 immunofluorescence 연구에 활용하고 있습니다. 그러나, 다중 셀 유형을 포함하는 장기에서 모든 차 문화와 마찬가지로 적은 원하는 세포에 의해 어떤 오염 물질이 발생할 수 있습니다. 의 연결을 세포의 분리에서 glial 세포에 의해 오염이 일반적인 문제가 될 수 있습니다. Glial 세포 있습니다그들의 형태가 대상 뉴런 (그림 6)에서 크게 차이로 쉽게 문화의 미세한 시각화에 따라 검색됩니다. glial 세포 오염의 영향은 문화의 계획된 사용에 따라 달라집니다. 세포 immuno-형광 검사에 사용되는 경우 개별 뉴런 사진을 찍은 때, glial 오염 불편보다 더 아무것도 할 수가 없습니다. 의 연결을 문화가 생화 학적 분석에 사용하는 경우 다만, glial 세포에 의해 어떤 중요한 오염 결과에 큰 변화를 일으킬 수 있습니다. glial 세포 오염을 해결하기위한 방법은 토론에 추가로 설명되어 있습니다.

일단 뉴런이 성공적으로 격리와 문화에서 성장되어, 한 전형적인 응용 프로그램은 immuno-형광 기법 세포 프로세스를 검사하는 것입니다. 그림 7 그림과 같이 같은 mitochondria와 같은 organelles는, 해결하기 위해 이전에 문화 미디어에 추가된 중요한 염료를 사용하여 물들일 수ation. 내생 세포 단백질 표준 immuno-형광 기법 (그림 8)를 사용하여 고정 세포의 시각이 될 수 있습니다. 일단의 연결 세포를 고정하고 관심 단백질에 대한 특정 항체는 세포에 도입 수 있으며, 이러한 단백질은 형광 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 교양 뉴런은 또한의 연결 기능에 대한 개별적인 단백질 효과를 검토하는 방법으로 연구자를 제공합니다. DNA 검사 transfections, electroporation 또는 바이러스성 형질 도입을 포함한 기술의 다양한 사용하여, 단백질은 세포의 연결 (그림 9)에 overexpressed 수 있습니다. 지나친 표현 단백질의 영향에 대응하는 방법 신경 세포가 두뇌가 응답 수 방법에 대한 직접적인 inferences을 가지고 있고 약물 치료에 대한 세포 목표를 식별 가능성을 제공하고 있습니다. 실험 이러한 유형의 내용은이 문서의 범위를 넘어 그들은이 기술에 의해 준비 문화가 아래쪽의 다양한 적합한지 설명합니까tream 응용 프로그램입니다. 그러나,이 프로토콜의 전체적인 단순화가뿐만 아니라, 이들의 연결을 문화를 준비하는 데 필요한 짧은 기간이 오​​늘의 신경 과학 실험실에서 사용하기위한 이상적인 방법을 확인하십시오.

그림 1. 태아 쥐 두뇌의 해부. 첫 절개는 두 반구로 분리 뇌의 중간선에 내려갔습니다.

그림 2. 태아 마우스 뇌의 해마의 위치. striatum는 해마을 시각화하기 위해 옆으로 이동하고 각 반구의 말초 지역의 곡선 '신장 콩 "타입 구조에 의해 기록됩니다.

그림 3. 트립신 용액의 hippocampal 조직의 분리.

그림 4. 파스퇴르 피펫 팁은 hippocampal 조직의 분쇄에 사용. () 일반 파스퇴르 피펫 팁. (b)는 불타는 광택 파스퇴르 피펫 팁. 둥근 모서리의 메모와 피펫을 여는 크기가 대략 50 %의 감소를 가져가라.

그림 5. Hippocampal 뉴런이 절차와주의 미디어의 도금을 사용하여 고정. () 세포 성장 일일 포스트 도금. 의 연결 프로세스는 1 일 동안 볼 수 있도록 시작합니다. (B) 세포 성장 십일 포스트 도금은 neurites는 측쇄과 중복됩니다.

그림 6. 7 일 동안 성장 glial 세포로 오염된와 organelle 마커 MitoTracker 레드 CM-H2XRos (Invitrogen # M7515)와 transfe 물들일 Hippocampal 뉴런Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019)를 사용하여 GFP-LC3과 cted. Mitochondria는 모든 세포에서 그러나 단지 하나의 신경 세포가 성공적으로 형광 구조로 transfected되었다 볼 수 있습니다. glial 세포로 오염 시각화하기 어려운의 연결 프로세스에서 GFP-LC3 표현의 분석을 만듭니다.

그림 7. Hippocampal 뉴런은 7 일 동안 성장하고 organelle 마커 MitoTracker 레드 CM-H ₂ XRos (Invitrogen # M7513) 물들일. 이것은 중요한 염료는 조직 배양 세포에서 활성 mitochondria를 착색하는 데 사용됩니다. 세포는 4 % paraformaldehyde / PBS에서 해결하고 형광 현미경에 의해 시각되었다. mitochondria에서 산화 때까지 염료 자체가 아닌 형광등입니다. 액티브 mitochondria가의 연결 프로세스에 걸쳐 볼 수 있습니다.

그림 8. Hippocampal 뉴런은 4 % paraformaldehyde / PBS 및 단클론 항-tubulin의 β 항체 (시그마 # T0198)와 immuno 묻은로 고정. 일차 항체 따라 오리건 그린 (Invitrogen # O11033) 염소 - 안티 마우스 이차 항체를 라벨이 추가되었으며, 형광은 현미경에 의해 시각.

그림 9. Hippocampal의 연결을 문화가 Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019)를 사용하여 구조 5 일째 성장과 GFP-LC3β DNA로 transfected되었다. 7 일 때, 세포는 형광 현미경을 사용하여 외부 막에 통합 GFP 태그를 LC3β와 시각 4 % paraformaldehyde / PBS 및 aggresomes을했다 사용해 해결했다. Aggresomes는 세포 몸과 neurites 전역에 위치하고 화살표로 표시된있다.

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토론

Hippocampal 문화는 20여 년 동안 분자 생물학에서 사용되었습니다. 원칙적 동안의 연결을 문화가 두뇌의 어떤 부분에서 만들 수 있고, hippocampal 문화는 해마 ^7의 신경 세포 인구의 상대적으로 단순한 구조로 인해 가장 인기있는 것으로 입증되었습니다. Hippocampal 문화는 일반적으로 말기 배아 조직에서 만들어진다. 이 조직은 해리 쉽게이며 성숙 뇌 조직을 ^{한 사람보다} 적게 glial 세포?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	공급 업체	카탈로그 번호
쥐의 꼬리에 콜라겐 1	BD Biosciences	354,236
폴리-D-라이신 솔루션	Chemicon	-003-E
행크스 균형 소금 솔루션	Invitrogen	14175-095
트립신 솔루션 (1X) 0.25 %, 액체	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal 중간 (1X) 액체	Invitrogen	21103-049
B27 보충 (50X) 액체	Invitrogen	17504-044
액체 L-글루타민 200 MM (100X)	Invitrogen	25030-149
페니실린 (10,000 대 / ML) / 스트렙토 마이신 (10,000 μg / ml) 쇼핑	Invitrogen	15140-148
HI-기증자 말 혈청	애틀랜타 체액	S12150H