도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

요약

클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

초록

진핵 세포는 복잡한에 의존 높은 규제하고, 적절한 세포 기능에 필요한 생화학 극성을 보존 기능 뚜렷한 막 바인딩 된 구획. 효소, 단백질, 그리고 cytoskeletal 부품이 생화학 분리를 적용하고 유지하는 방법을 이해하는 것은 파라마운트 중요성을 따라서입니다. 휘황 태그 분자의 사용 또는 교란 subcellular 구획은 풍부한 지식이 나왔고 및 셀룰러 규제에 대한 우리의 이해를 전진했다와 / 현지화입니다. 이러한 형광 및 공 촛점 현미경 등의 이미징 기술은 비교적 간단 휘황 태그 작은 분자의 위치를 ascertaining 수 있도록 매우 작은 구조 그러나 해상도는 ¹ 제한됩니다.

한편, 전자 현미경은 매우 높은 해상도로 subcellular 형태의 세부 사항을 발표했다 있지만 정적 자연은 어려운 매우 동적 프로를 측정 할 수 있습니다정밀도 ^2,3와 cesses. 따라서, 동일한 샘플의 전자 현미경, 칭했다 상호 빛과 전자 ​​현미경 (클레멘 타인) ^4,5과 빛 현미경의 조합은, 전자 현미경 ⁶ 높은 해상도로 ultrafast 형광 이미징의 듀얼 장점을 갖게. 이 강력한 기술은 세포 생물학 ^5,7의 여러 측면을 연구 구현되었습니다. 처음 소개 된 이래,이 절차는 높은 해상도의 subcellular 구조와 morphologies를 구별 할 수있는 능력을 향상 시켰습니다.

여기, 우리는 클레멘 타인 (그림 1) 다음 빠른 microinjection을 수행하기위한 간소화 된 방법을 제시한다. microinjection의 클레멘 타인 절차는 직접 진핵 세포 세포질에 작은 분자 및 / 또는 단백질의 특정 수량을 소개하고 (그림 2) 멀티 나노 미터 해상도 mm의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 기술은 microinjecting을 기반으로합니다세포는 모두 공 촛점 형광 및 전자 현미경과 라이브 셀 요리와 이미지의 하단에 부착 레이저 에칭 유리 gridded coverslips에 성장. 관심 세포의 현지화 (들) 쉽게 (그림 3) 시료의 고정에 사용되는 Epon 수지에 이르기까지 관심의 세포와 함께 양도 및 이전 전자 현미경 분석에 sectioning되는 격자 패턴에 의해 촉진된다. 형광 및 EM 이미지의 중첩은 사용자가 subcellular 지방화뿐만 아니라 관심 microinjected 분자 (그림 4)에 의해 유도 된 형태학 및 / 또는 ultrastructural 변경 사항을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 microinjected 샘플의 특성에 따라 몇 시간이 ≤에서 5 초를 이르는 시간이 가리키는 의무가 있습니다.

프로토콜

1. 포유류의 세포 배양

1. 일반 쥐 신장 (NRK)는 (모든 시약에 대해 표 1를 참조하거나 셀 요리를 살고 부착 photoetched 유리 gridded coverslips에 자궁 경부암 (헬러), 또는 기타 적절한 포유류의 세포 라인 37 배양 아르 ° C, 5 % CO _2, 불후의 장치 DMEM + 10% FBS에)이 프로토콜에 사용하고 1% 펜 / 패 혈성. 주의 사항은 양식 포유류의 세포와 함께 작업 할 때 무균 환경을 유지하기 위해주의해야한다.
2. 실험 시간 선 (0~5시간 대 1~2일의 포스트 분사)에 따라 세포의 confluency는 ~ 50 %로 조정하거나 각각 25 % ~해야한다.

2. Microinjection

1. ~ 50 μl의 최종 볼륨에, 세포 문화의 복종 할 의무에 따라, 버퍼의 선택 원하는 단백질, DNA, 또는 작은 분자를 준비합니다. 이러한 텍사스 레드, 캐스케이드 블루 등의 불활성 형광 염료microinjected 셀을 표시하기 위해 포함되어 있습니다, 사출 염료 및 형광 프로브의 선택은 겹치지 여기와 방출 파장이 있어야합니다. microinjection에 필요한 관심 분자의 농도는 경험적으로 결정되어야하고, 형광등 추적 염료는 일반적으로 0.5-1.0 MG / ML에서 사용됩니다. 일반적으로, rhodamine 또는 다른 형광는 covalently 감지하지만 다른 방법은 감도에 따라 사용할 수 있습니다, 상용 키트를 사용하여 귀하의 관심 분자에 부착된다. 자세한 내용은 아래 중요 고려 사항을 참조하십시오.
2. 0.22 μm 원심 필터를 통해 injectant (~ 50 μl)를 필터링 할 수 있습니다. 원심 필터는 진공 및 / 또는 죽은 볼륨을 연결 한 주사기 여과 선호하고 있습니다.
3. microinjection의 바늘을 생성하려면, 붕규산 유리 피펫은 불타는 브라운 Micropipette 풀러 다음 제조업체의 지침을 사용하여 뽑아 있습니다. 또한, microinjection바늘은 femtotip의 microinjection의 바늘하게 Eppendorf 등의 업체에서 구입하실 수 있습니다.
4. 조심스럽게 Eppendorf 20 Femtotips를 사용하여 microinjection의 바늘의 unmolested 끝으로 injectant 4 μl를 피펫. 더 거품이 당겨 microinjection의 바늘 내에 존재하지 있는지 확인합니다. 역 현미경에 부착 된 Eppendorf FemptoJet Injectman의 micromanipulator 암에 microinjection의 바늘을로드합니다. microinjection 절차의 좋은 검토, 독자는 시각화 실험 제 ^8의 이전 저널로 이동합니다.
5. 역 Zeiss 현미경의 요리 홀더에 gridded coverslip 및 배양 세포와 라이브 셀 요리를 놓습니다. photoetched 그리드 내에서 성장하는 세포를 찾아 격자의 영숫자 식별자를 참고, 다 다음 단계에 사용됩니다. 다음 단계는 coverslip의 가장자리에서 샘플 전송을 제한하므로 이상적으로, coverslip의 중심에 셀을 찾습니다.
6. 수동으로 낮은 주입 coverslip 위에 자리로 팔, 그리고 끝이 부드럽게 교양 세포와이 시점 이후 바늘의 움직임을 방지하기 위해 언론 '제한의 표면을 만지는 때까지 micromanipulator 조이스틱 및 컨트롤, 낮은 사출 바늘을 사용하기 때문에 허약 한을 깨는 붕규산 유리를 꺼냈다. 셀 microinjection의 모든 다른 측면 Eppendorf FemtoJet InjectMan 사용자 설명서에 따라 수행됩니다. microinjection 기술은 최근에 박테리아가 ⁹ 개인 분비 독성 단백질을 이해하는 데 사용되었습니다.
7. 선택한 그리드 내의 모든 다른 셀을 Microinject. 세포가 ~ 50% confluency에서 성장으로, 하나는 600 ^μm이 그리드 당 ~ 80 셀 (예를 들어이 그림. 3A) 기대할 수 있습니다. 따라서, 형광 및 전자 현미경 검사시 ~ 30-40 실험 및 제어 세포의 N가있을 것입니다.
8. 원하는에 대한 포유류의 세포 배양 배양기에 다시 라이브 셀 요리를 놓으십시오시간은 실험 설정에 의해 결정. 또한, 하나는 이전에 고정이 관심의 특정 subcellular 구조의 모양을 기다리고 microinjection에서 시간 경과 현미경 분석에 직접 진행할 수 있습니다.

3. 형광 현미경

1. 원하는 경우, microinjected 세포의 라이브 셀 시간이 경과 형광 측정을 수행, 그 이후, 0.1 M cacodylate 버퍼 (산도 7.4)에 2.5 %의 글 루타 알데히드와 미디어를 교체하고 실온에서 10 분에 품다. 라이브 셀 측정이 필요하지 않는 경우 그러나, 세포의 성장 미디어를 버리고 10 분 동안 실온에서 1xPBS 5 ML 3.7 %의 포름 알데히드로 세포를 해결할 수 있습니다. 정착액을 취소하고 5 ML의 1xPBS로 교체, 3.2 단계로 진행합니다. 참고 : 형광 현미경이 완료 때까지 글 루타 알데히드를 추가하지 중요합니다.
2. 형광 현미경의 photoetched gridded coverslip으로 라이브 셀 요리를 장소 (공 촛점이 생 필요하지 않습니다S 단계)과 세포의 배열 (그림 4A)를 문서화하는 5-10 시야하고 적절한 격자의 형광 이미지를 수집합니다. 불활성 분사 염료 (그림 4B)의 여기 및 방출 파장을 사용하여 microinjected 된 해당 셀을 식별합니다. 이 전자 현미경을 포함한 후속 단계에 microinjected 세포의 식별을 용이하게하기 위해 다른 배율 (예 : 10X와 65x)에서 이미지를 얻는 것이 중요합니다.
3. 공 촛점 형광 현미경을 사용하여 단계 위의 2.5에서 확인 된 격자 내에서 microinjected 세포의 Z-스택을 수집합니다. 높은 배율 (100x)는 전자 현미경에 표시됩니다 subcellular 구조와 형광 이미지를 상관 관계하기 위해 필요합니다.
4. coverslips는 상업적으로 이용 가능한 coverslip 제거 유체와 함께 라이브 셀 요리의 바닥에서 제거, 5 ML을 포함하는 처녀 세포 배양 접시에 세포 측을 배치됩니다1xPBS. 아래의 설명과 같이 coverslip 그런 다음 전자 현미경에 처리됩니다.

4. 전송 전자 현미경

1. 0.1 M cacodylate 버퍼 (산도 7.4) 2 ML 2.5 %의 글 루타 알데히드와 1xPBS 버퍼를 교체하고 10 분 동안 실온에서 알을 품다. 더 이상 부화가 필요하지하면서, subcellular 구조의 유지에 도움이됩니다. 참고 : 혼자 포름 알데히드는 EM 분석을위한 충분한 정착액하지 않습니다.
2. cacodylate 버퍼 든 세 세차에 이어 30 분에 0.1 M cacodylate의 버퍼 2 ML 1 % 오스뮴의 tetroxide의 추가와 정착액 및 얼룩 세포를 제거하고 마지막으로 ddH ₂ O.있는 모든 버퍼를 교체
3. 표준 EM 프로토콜 후, 에탄올의 등급 (70 % ~ 100 %) 시리즈의 샘플을 탈수. Epon 수지가 채워진 튜브의 상단에 Epon 수지 및 장소 coverslip 세포 쪽을 준비합니다. 60에서 24 시간을위한 중합을 허용 ° C. photoetched gridded coverslip 셀 측 수행을 배치하여Epon 수지로 wn은 관심뿐만 아니라 격자 패턴의 세포 모두 (예 그림. 3B) 중합 동안 Epon 수지로 전송됩니다.
4. 신속하게 액체 질소 및 / 또는 끓는 물에 immersing하여 Epon 수지의 coverslips를 제거합니다. 관심 격자를 (: 그리드 찰싹 찰싹 소리가 미러 이미지로 전송됩니다 주) 찾을 수 쌍안 해부 범위에서 수지의 표면을 검사합니다. 관심 만 그리드 Epon 수지 블록의 정점에 있습니다 있도록 아래 멸균 면도날이나 메스, 트림 Epon 블록을 사용합니다.
5. ultramicrotome 사용하여 원하는 두께 (단층 TEM에 대한 기존의 TEM 및 ~ 250 nm의 두께에 ~ 70 nm의 두께)에 다듬어 블록의 직렬 섹션을 습득. 표준 프로토콜에 따라 uranyl 아세트산과 리드 구연산과 대비 섹션을.

5. 상호 빛과 전자 현미경

1. 에 대한 관심의 세포를 재이미지를 사용하여 전자 현미경은 이전 단계에서 얻은. 관심되면 microinjected 세포가있는 한, 관심 있던 세포 내의 지역을 식별하는 고해상도 공 촛점 형광 이미지를 사용합니다. TEM을 사용하여 높은 해상도 이미지이 있습니다. 이러한 세포 주변과 형광 Z-스택 이미지 EM이 갈라에 해당하는 결정 핵 봉투와 같은 랜드 마크를 사용합니다.
2. 선택의 이미징 프로그램을 (예 : 이미지 J, 어도비 포토샵 등) 사용, 50 %로 형광 이미지의 불투명도를 줄이고 연결합니다되는 TEM 이미지에를 입혀 라. 규모를 조정 (비율을 제한하는 것을 잊지)과 TEM 이미지와 일치하는 공 촛점 이미지의 회전에 의해 이미지를 맞 춥니 다. 형광 이미지의 대비, 선명도 등을 정밀 조정 정렬에 도움이 될 수 있습니다. 참고 : 우리는 heterochromatin, 핵 봉투, 그리고 세포 주변이 도움이 할 수있는 훌륭한 랜드 마크를 나타낸다는 것을 발견했습니다두 이미지의 방향 인치

6. 중요 고려 사항

1. 크게 주입 작은 분자를 찾는에 도움이 같은 Rhodamine 또는 Fluorescein 같은 형광 태그는 covalently 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 부착 할 수 있습니다. 추가 정보는 ectopically 전에 microinjection에 형광 subcellular 지방화 마커 단백질을 표현하여 얻은 수 있습니다. 따라서, fluorophores 및 불활성 microinjection 추적 염료의 선택이 중요합니다.
2. 가까운 coverslip의 중심에 준수하고 microinjection에 대한 셀을 선택하고 가장자리에 가까운 격자를 선택하지 마십시오. 이 관심의 세포 전자 현미경에 사용되는 Epon 수지로 전송하는 가장 큰 가능성을 제시합니다.
3. 세포의 Confluency 전S 중요한 완전히 합류 플레이트는 매우 어렵 전자 현미경에 microinjected 세포의 식별을 줄 것이라고 믿습니다. 오히려, 종자 세포들은 이러한 짧은 실험 당일 ~ 50% confluency에 도달하거나 이상의 날 (1-2 일) 실험에 ~ 25% confluency.하는 위치와 모양 세포의뿐만 아니라 방향에 랜드 마크와 같은 '빈 공간 전자 현미경 이미지를 사용합니다.
4. 공 촛점 광학 슬라이스 두께는 실험의 요구에 조정해야하기 때문에 경험적으로 ¹⁰ 결정해야합니다.
5. fixatives의 포름 알데히드 및​​ 글 루타 알데히드는 가장 높은 등급의해야합니다. 포름 알데히드는 단백질과 작은 형광 분자 (예 : Rhodamine 또는 FITC 등) 모두의 형광 특성을 보존 아직 세포가 해결됩니다. 그러나, 구조가 높은 EM 해상도를 허용 보존되지 않습니다. 글 루타 알데히드는 analy EM에 대한 높은 수준의에 멤브레인과 subcellular 구조를 유지시스,하지만 크게 형광 방해합니다. 따라서 두 단계로 고정 모두 형광을위한 중요하고 EM 현미경. 최종 고정이 글 루타 알데히드 처리에 의해 수행 될 수 있으므로 포름 알데히드 고정 단계는 라이브 셀 측정을 수행 할 경우 생략 할 수 있습니다.

7. 대표 결과

이 절차는 직접 진핵 세포의 세포질에 관심있는 분자를 제공 및 멀티 나노 미터 해상도 mm에서 휴대폰 및 organeller 건축에서의 현지화 및 / 또는 효과를 모니터링 할 수있는 능력을 갖게. 실험 설정 및 절차의 개략도는 그림 2에 표시됩니다. 이 기술은 (그림 공 촛점 현미경 후 Epon 수지에 관심뿐만 아니라 격자 패턴의 세포를 모두 양도 할 수있는 레이저 에칭 유리 gridded coverslip (그림 3A)에 성장 세포의 microinjection에 의존3B).

전형적인 microinjection의 클레멘 타인 절차는 상관이 때, subcellular 지방화와 ultrastructural 분석을 모두 허용 형광 이미지와 전자 micrographs를 산출. photoetched 유리 gridded coverslip에 성장 세포는 밝은 필드 이미지가 취득하는 후 관심있는 분자 (그림 4A)로 microinjected 있습니다. 불활성 추적 염료가 아닌 microinjected 세포 (그림 4B)에서 microinjected 세포를 구별 할 통합됩니다. 공 촛점 Z-스택은 형광 또는 관심 microinjected 작은 분자 (그림 4C)에 첨부 된 다른 식별자를 사용하여 얻을 수 있습니다. 샘플은 글 루타 알데히드로 고정하고 전자 현미경에 처리됩니다. 전자 micrographs들은 해당하는 셀 (그림 4D)에 취득과 중첩되어 있습니다. 형광 신호를 품고 영역은 (그림의 4E 높은 배율에서 더 상세하게 검사 아르 ).

그림 1. microinjection의 클레멘 타인 절차의 타임 라인. 실험 설정에 따라 microinjection 및 형광 측정은 같은 날에 수행 할 수 있습니다. 전자 현미경의 샘플을 준비하는 것은 긴 incubations 단계에 가장 많은 시간이 소요 때문입니다 후 2-3 일 지속됩니다. TEM 분석 및 전자 현미경 이미지 형광 신호를 상호 연관은 하루에 수행 할 수 있습니다.

그림 2 microinjection의 클레멘 타인 절차의 일반 그림 1 단계 :.. 레이저 에칭 유리 gridded coverslip에 성장 세포를 찾아 관심 분자를 microinject 2 단계 :.. 시야 이미지 및 microinjected 세포의 공 촛점 형광 Z-스택을 모두 캡처 3 단계 : 준비EM에 대한 coverslip 분석하고 Epon 수지에 삽입 할 수 있습니다. 전송 그리드 패턴을 사용하여 관심 등 그 세포를 차단을 다듬 꼭대기에 있습니다 4 단계 :. ultramicrotome과 시리얼 부분을 잘라 5 단계 :. EM 이미지로 형광 이미지를 상관 관계.

. 그림 3 그리드 패턴은 관심 세포의 식별을 용이하게 패널은 ~ 50% confluency로 성장 세포의 microinjection을 묘사,. 격자 식별자 AK을 확인합니다. 스케일 바는 100 μm이다. 패널 B는 관심의 그리드가 해부 현미경에서 확인 후 순차적으로 sectioned 될 polymerized Epon 수지 블록 위에 coverslip에서 전송 격자 패턴을 보여줍니다. 패널 C는 sectioning에 대비 양도 그리드 패턴을 보여줍니다 . 전송 그리드 찰싹 찰싹 소리가 수지 블록에 역에 있습니다, scal전자 바는 1200 μm이다.

.. 그림 4 microinjection의 상호의 빛과 전자 ​​현미경의 대표 결과 패널은 레이저 에칭 유리 gridded coverslip에 성장 NRK 세포의 밝은 필드 현미경을 보여줍니다, 화살표는 패널 CD에서 클레멘 타인에 의해 시각화 두 셀을 나타냅니다 패널 B의 형광을 보여줍니다. 불활성 추적 염료 때문에,이 경우에는 캐스케이드 블루, microinjected 된 셀을 식별하는 데 사용됩니다. 패널 C는 밝은 분야의 오버레이와 Rhodamine-라벨 작은 분자의 형광 서명을 보여줍니다. 여기에 표시된 두 개의 세포는 A & B. 패널 D는 시야, 형광 및 전자 현미경의 클레멘 타인을 나타내는 패널의 화살표로 표시되며,. 화살표 머리 형광 puncta이 패널 E의 높은 배율의 이미지로 나타냅니다 스케일 바는 fol과낮은 : 패널 A & B, 100 μm, C & D, 50 μm, E, 100 nm의.

토론

여기에 제시된 방법은 진핵 세포 세포질에 정화 단백질, 핵산, 또는 작은 분자의 직접 전송을 할 수 있으며 형광 및 전자 현미경의 상관 관계를 통해 초 고해상도 분석을 갖게. 이 방법의 사용은 단순하지만 강력한이 많은 기존의 핵심 시설 및 / 또는 적절하게 구비 전자 현미경 실험실와 함께 집에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 사용자가 실시간으로 휘황 태그 분자의 역학을 모니터링 할 수 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
Photoetched Coverslip와 라이브 셀 플레이트	MatTek	P35G-2-14-CGR​​D
텍사스 레드	Invitrogen	D3329
캐스케이드 블루	Invitrogen	D7132
Rhodamine 라벨 키트	열 과학	53,002
0.22 μm 원심 여과 장치	Millipore	UFC30GV00
붕규산 유리 피펫	셔터 악기	BF100-50-10
Micropipette 풀러	셔터 악기	모델 P-97	램프 테스트를 수행 한 후에는 프로그램을 # 4를 사용
FemtoJet의 Microinjection 시스템	Eppendorf	Injectman NI2
Coverslip 제거 유체	MatTek	PDCF OS 30
Technai 전송 전자 현미경	페이	Technai G2 BioTWIN
Ultramicrotombe	Leica	EM UC6