에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

요약

마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를 정의 utero에서 유전자 전달 기술 : 마우스 복부 개복술, transuterine microinjection, 그리고 생체내에서 electroporation. 우리는 중요한 실험 embryological 기술을 입증하는 디지털 비디오 현미경을 사용합니다.

초록

; utricle 및 saccule의 maculae 및 코일 달팽이관에 Corti의 기관 반원의 운하 ampullae 3 cristae : 포유류의 내이 (内耳)는 6 독특한 감각 상피 조직이 있습니다. cristae와 maculae은 Corti의 기관에서 청각 세포가 ¹ 청각의 기본 트랜스 듀서 반면 기계적 자극이 균형의 특별한 감각을 보조하다 할 transduce vestibular 세포가 포함되어 있습니다. 반원의 운하와 달팽이관 이러한 감각 상피 조직과 morphogenesis의 세포 운명 사양은 마우스의 태동의 두 번째 주 동안 자리를 대신하고 대부분이 출산 ^2,3 전에 완료됩니다. 마우스 내이 (内耳)의 발달 연구는 정기적으로 세포 및 / 또는 형태학의 phenotypes ^4,5의 분자 기초에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 배아 또는 출생 후의 단계에서 유전자 변형 배아를 수확하여 실시하고 있습니다. 우리는 utero의 발전 마우스 내이 (内耳)에 해당 유전자 전달 가설 </ em>는 이득과 손실의 기능 연구의 맥락에서 포유류의 내이 (内耳)의 개발 ⁶ 밑에있는 유전자 메커니즘의 심문에 대한 전통적인 마우스 transgenesis에 대한 무료 접근 방식을 나타냅니다.

복부 개복술 1), 2) transuterine microinjection 및 생체내의 electroporation 3) : 개발 마우스 내이 (内耳)에 유전자 misexpression 연구를 실시하는 실험적 패러다임 여기서 보여주 세 일반적인 단계로 해결됩니다. 복부 개복술은 이식 배아 ⁷ 실험적 액세스할 자궁 externalization를 허용 마우스 생존 수술 기법입니다. Transuterine microinjection은 귀의 소포 또는 otocyst의 루멘에 플라스미드 표현을 소개 beveled, 유리 모세관 micropipettes의 사용이다. 생체내에 electroporation은 전구 세포의 ^8-10로 플라스미드 표현을 운전 사각 파, 직류 펄스의 응용 프로그램입니다.

11의 각 단계에 대한 상세한 기록이 포함되어 있습니다. 마우스 실험 embryological 기술은 산문에서 배우고 스틸 이미지 혼자하기 어려울 수 있습니다. 현재 직장에서 우리는 유전자 전달 절차의 3 단계를 보여줍니다. 대부분 비판적으로, 우리는 방법 정확하게 표시하는 디지털 비디오 현미경을 배포 : 1) utero에서 배아 방향을 파악, 2) otocyst에 주사를 타겟팅을위한 배아를 방향, 3) 배아 일 11.5에서 otocyst로 추적 염료 용액과 혼합 DNA를 microinject과 12.5, 출생에서 출생 후의 선택과 5) 라벨 electroporated 배아, 4) 주입 otocyst을 electroporate. 일반적인 방법론적인 오류를 방지하는 방법을 논의; otocyst mistargeting의 가장 일반적인 원인에 그림 가이드, 우리는 성공적으로 transfected 안쪽 귀의 대표적인 예제를 제공하고 utero g에 쓰기 위해 현재 지침에너지 전송 동물 케어 프로토콜.

프로토콜

1. 복부 개복술

1. 나트륨 pentobarbital 마취 용액 (g 체중 당 7.5 μL)의 intraperitoneal 주사에 의한, 누구의 배아 배아 일 11.5 (질 플러그인이 감지 당일 정오가 배아 발달의 일 0.5입니다 E11.5)에있는 댐을 마취. 마취 용액 근무 :; 절대 에탄올 100 μL, 65 밀리그램 / ML 수성 마그네슘 황산 (자궁 음색을 modulates) 320 μL, 50 밀리그램 / ML pentobarbital 나트륨 용액 180 μL 및 프로필렌 글리콜 400 μL (와 차량 miscible을 수용액 및 유기 구성 요소).
2. 유해 자극 테스트를 실시하여 마취의 완전성을 평가 : 발자국 조르기, 꼬리 핀치, 뺨 및 vibrissae 터치 및 깜박임 반응. 각막에 무균 안과 연고를 바릅니다.
3. suprapubic 지역에서 가위로 흉곽과 훌륭한 블레이드 (Oster # 40 칼날)로 복부 모피 면도. 70 % 에탄올과 복부, 10 % povidone의 요오드 (Betadine)를 소독차 70 % 에탄올, 순차적으로. 장소는 무균 드레이프에서 마우스 복부 쪽 아래로 누른 다음 2-5 분을위한 가열 패드 또는 따뜻한 플레이트 (37 ° C)에서 설정합니다.
4. 공 - 스쳐 가위로 복부 중간선에서 복부 피부를 절개하다. 10~14mm에 대한 절개를 확장합니다. linea 알바, 복부 벽 배면의 중간선을 따라 avascular, 흰색 결합 조직 밴드를 식별합니다. 공이 가위 밀고로 linea 알바를 절개하고 절개 10~14밀리미터을 확장. 즉시 prewarmed (37 ° C) lactated 울리는의 솔루션으로 복부를 관개하다.
5. 주입 사이트에 과도한 압력을 적용하지 않고 고리 집게와 자궁의 두 뿔을를 외면 화하다. prewarmed, lactated 울리는의 솔루션 externalized 자궁 뿔이 관개.

2. Transuterine Microinjection

1. 12-16 μ : 다음과 같은 특징을 가진 두꺼운 벽으로 둘러싸인, borosilicate 유리 모세관의 microinjection 피펫을 조작m 외경과 20 정도 베벨. ; 압력 = 200; 속도 = 46; = 0를 당길 시간 = 100) 열 = 램프 테스트 플러스 3 단위 : 작은 상자 필라멘트와 셔터 P-97 피펫 풀러에서 다음 프로그램을 사용합니다. 셔터 BV-10 beveler로 대구경 pipettes 위해 104C (금색) 연마 디스크를 사용합니다. 칼슘을 무료로 인산염의 3-4 μg / μL에서 플라스미드 Resuspend 표현이 (산도 7.2-7.4) 염분 버퍼. 30 초 동안 부드럽게 농축 DNA, 와동에 결정 신속한 녹색을 추가하고 10 초간 10,000g에 스핀. 시각 주사의 효능을 추적하는 데 필요한 빠른 그린의 최소 금액은 경험적으로 결정됩니다. DNA / 빠른 그린 솔루션 beveled 피펫을 Backfill. 압력 주입기 (Picospritzer 소스 가스 등> 99% 순수한 질소를 사용하여)의 피펫 홀더에 로드된 microinjection 피펫에 연결합니다.
2. 낮은 강도, 그 주입 사이트 내에서 배아를 시각화하는 할로겐 라이트와 함께 자궁을 Transilluminate. 비 확인힘들 심장, 뇌 vesicles, 사지 꽃봉오리, hindbrain의 초기 4 ^번째 뇌실, 그리고 눈. prewarmed로 매 2 분, 수화를 유지하기 위해 울리는의 솔루션을 lactated 자궁을 관개하다. 배아의 방향과 해부 학적 경계표 위에서 언급 식별 자궁에 부드러운 압력을 적용합니다.
3. 동양은 배아 앞부분과 후부 가지의 측면 otocyst가있는 mesenchymal 지역 주요 헤드 정맥을 식별합니다. 적절한 otocyst은 자궁 transillumination로 볼 수 없습니다. otocyst은 정맥의 메인 트렁크와 함께 미국의 풋볼 경기에서 uprights 또는 goalposts의 모양을 형성, 주요 헤드 정맥의 앞부분과 후부 지점 사이의 중간에 위치하고 있습니다. otocyst는 uprights 사이의 중간입니다.
4. otocyst의 추정 위치와 라인의 궤도에있는 자궁을 통해 주입 피펫을 삽입합니다. uter 통과 후 한번 microinjector를 펄스우리는 추적 염료 및 피펫 팁의 대략적인 위치를 시각화합니다. 마이크로 미터 제어에서 피펫을 향상하고 깊이를 평가하기 위해 다시 펄스. 또한 반복 측면 헤드 mesenchyme 및 펄스로 피펫을 향상. 성공 otocyst 타겟팅 dorsally endolymphatic 덕트와 가리비 현관의 껍질 모양의 테이퍼 모양을 보여줄 것입니다. 자궁에 압력을 풀어 한 동작으로 배아 / 자궁에서 피펫을 제거하고 즉시 prewarmed와 자궁을 관개, 울리는의 솔루션 lactated.

3. 생체내의 Electroporation에

1. lactated 울리는의 솔루션과 함께 자궁을 관개하다. 갓 적용 lactated 울리는의 솔루션은 전기 부부 패들 스타일 전극에 자궁에 필요합니다. lactated 울리는의와 전극의 텅스텐 표면을 축축하게하다. 전극의 경로 센터 주입 otocyst합니다. 부드럽게 electroporation 파와 자궁을 압축ddles. 음극은 주입 otocyst과 양극이 uninjected otocyst에 인접한 자궁 벽과 접촉에 대한 측면 질 벽에와 접촉이다. electroporator에 발 페달 스위치와 함께 사각형 웨이브 펄스 열차를 실행. Electroporation 매개 변수는 다음과 같습니다 펄스 당 43 볼트와 950 밀리초 interpulse 지연에서 5, 50 밀리초 펄스. 펄스 트레인이 게재된 직후 자궁을 관개하다. 60-100 mAmps 귀의 상피 progenitors을 transfect 충분히 : 조직에 전달 전류가 기록합니다. 주사와 댐 당 4-6 E11.5의 배아를 electroporate.
2. 그의 내면의 귀있는 그 배아들 중 4 ^번째 뇌실로 수성 형광 dextran (알렉사 형석 488 플라스미드 표현식이 녹색 형광 단백질을 암호화하는 경우 플라스미드 표현식이 빨간색 형광 단백질이나 알렉스 형석 594을 암호화하는 경우)의 두 번째 독립 transuterine microinjection을 수행 정확하게 주입 및 펄스 당 전류의 최소 60 mAmps이 드했습니다electroporation시 livered. 형광 dextran은 hindbrain에서 출생에서 감지하게 내면의 귀 (3.5 참조) embryogenesis 동안 조작되었다 새끼의 선택을 가능하게합니다.
3. lactated 울리는의와 자궁 뿔이 관개. 복강으로 자궁 뿔을 꽂아. prewarmed, lactated 울리는의 솔루션 중 2-4 ML과 자궁 캐비티를 플러시하고 오버플로가 무균 드레이프로 절개 사이트 밖으로 배수 수 있습니다. 건조, 살균 소재 draping를 교체합니다. 비 절삭 바늘과 6-0 resorbable 봉합사와 복부 벽 봉합해. 우리는 복벽과 피부 모두에 대해, 다른 모든 바늘을 잠금, 실행 바늘을 선호합니다.
4. 댐 '털'을 건조하고 피하 주사에 의해 비 steroidal 안티 - 염증성 같은 Meloxicam으로 관리할 수 있습니다. 멸균 드레이프에 prewarmed 복구 케이지에 댐을 반환합니다. 모니터와 피묻은 방전을위한 댐 '호흡, 절개 사이트 명백하고, 질을 기록합니다. 출혈은 라스입니다다시 있으나, 현재와 줄지 않는 경우에 그녀가 마취하에있는 동안, 댐을 안락사. 그녀는 의식과 ambulate하려는 시도을 차릴 시간을 확인합니다. 그녀가 먹고 마시의 흔적을 보여줍니다과 둥지가 만들기 시작되면 마우스 식민지로 댐을 반환합니다. 일반적으로 이것은 12 시간 내에 발생합니다.
5. 출생시 (출생 후의 일 0), 플래시 GFP 또는 텍사스 레드 필터로 stereofluorescence 해부 현미경을 사용하여 형광 dextran을 감지할 쓰레기의 각 강아지의 hindbrain 지역은 적절하게 설정합니다. 오직 lactating 댐 hindbrain 라벨을 표시 그 새끼로 돌아가기.

4. 대표 결과

1 그림. 개발 달팽이관에 Electroporation - 매개 유전자 전달. E11.5 otocyst은 (펄스 tra 표현 플라스미드 인코딩 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)와 electroporated 맞았 었소매개 변수 : 다섯, 50 밀리초 / 펄스와 950 밀리초 interpulse 지연)에서 43 볼트 104. otocyst 달팽이관의 중간 회전을 통해 기지에서 EGFP 표정을 보여주 E11.5에 주입하고 electroporated되었다 강아지 출생 후의 일 6 (P6)에서) 담당자 내이 (内耳). 달팽이관의 측면 벽은 중간 턴하 꼭대기에서만 제거되었습니다. 꼭대기에 야기할 E11.5의 progenitors은 transfected되지 않았습니다. B)에 달팽이관의 immunostaining 전체 마운트는 () 헤어 셀 표식으로 마이 오신의 7A (Myo7a)는 해당 EGFP 표현은 Corti의 기관의 궤도를 따라하고 조잡한 머리카락 세포 베어링 감각 상피에 현지 나타냅니다. otocyst E11.5에 주입하고 electroporated되었다 E18.5 배아로부터 C) 대표 내이 (内耳). 레이저 공촛점 투영은 Myo7a - 긍정적인 감각 세포에서 EGFP 표현을 보여줍니다. EGFP expressio을 나타내는 Corti의 E18.5 기관에서 달팽이 감각 상피의 D) 레이저 공촛점 투영N 내부 세포의 (ihc), 바깥쪽 세포 (ohc), 내부 phalangial 세포 (IPC), 기둥 세포 (PC) 및 Deiters '세포 (DC). (B)의 규모가 막대는 ()에 적용됩니다.

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토론

개발 마우스 내이 (内耳)에 유전자 이체 : 마우스 내이 (内耳)는 postimplantation 개발 ^12,13의 첫 주 동안 귀의 placode에서 개발하고 있습니다. 배아 일 9.5 (E9.5)으로 placode는 invaginated했으며 otocyst ^2라는 액체가 채워진 소포로 morphed. 소포에 귀의 엽 성의 전구 물질이 성숙한 내이 내의 감각과 nonsensory 세포뿐만 아니라 vestibular과 청각 감각 상피 조직에 기계적으로 민감한 세포?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이크로 살균 사례	ROBOZ	RS-9900a	8X8.5X1.25 인치
공 - 스쳐 가위	파인 과학 도구	14109-09
링 포셉	파인 과학 도구	11106-09	4.8mm ID/6mm OD
Adson 조직 집게	파인 과학 도구	11027-12
니들 드라이버	파인 과학 도구	12502-12
알레르기 주사기 트레이	Becton Dickison	305,536
봉합해​​ 6-0	Syneture	GL-889	0.7 메트릭 위장 봉합사
Lactated 울리는의 사출 USP	벡스터	2B2323
빠른 그린	시그마 알드리치	F7258
Borosilicate 유리 모세관	하버드 장치	30-0053
Nembutal 나트륨 솔루션	박수 제약 주식 회사	NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O	피셔 과학	M63-500
프로필렌 글리콜	피셔 과학	P355-1
에탄올	시그마 알드리치	E7023-500
Meloxicam	Boehringer Ingeheim	나다 141-219
Micropipette 풀러	셔터 인 스트 루먼트	P-97	FB255B 상자 필라멘트, 셔터 악기에서 피펫 요리책을 참고
Microelectrode의 Beveler	셔터 인 스트 루먼트	BV-10	대형 pipettes를위한 104C beveling 디스크는, 이론을 beveling에 대한 설명서를 참조
Micropipette 홀더	워너 인 스트 루먼트	MP-S15T	Picospritzer 튜빙을위한 1.5mm 외경의 피펫과 여성의 압력 포트.
족집게 스타일 전극	Protech 인터내셔널	CUY650P5	5mm 외경
스퀘어 웨이브 Electroporator	Protech 인터내셔널	CUY21EDIT	Footpedal 권장
PICOSPRITZER III	파커 Hannifin	051-0500-900	Footpedal 권장
수동 제어 Micromanipulator	하버드 장치	640,056
수평 층류 클린 벤치	Envirco		LF 630-10554로 정의 수정. 후드의 약도에 대한 보충 정보를 참조하십시오.
Leica stereofluorescence는 Lumencor 솔라 라이트 엔진 microcope을 해부	Bartels와 스타우트와 Lumencor	Lumencor 솔라 라이트 엔진과 MZ10F	MZ10F을 집중하고 솔라 라이트 엔진을 실행하는 데 Footpedals 추천합니다
알렉사 형석 594 Dextran	Invitrogen	D22913	10mg/ml, 수성
알렉사 형석 488 Dextran	Invitrogen	D22910	10mg/ml, 수성
Enviro-dri	목자 특수 아빠ERS		www.ssponline.com