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Drosophila 달걀 챔버는 mRNA의 지방화의 메커니즘을 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 지방화의 과정을 버팀목을 대다 역동적인 이벤트를 캡처하기 위해서는 살아있는 조직의 급속한 고해상도 이미지가 필요합니다. 여기서는 절개와 최소한의 중단과 라이브 시료의 이미징을위한 프로토콜을 제시한다.
라이브 세포 이미징은 축 사양, 세포 분화 및 organogenesis 1과 같은 주제를 조사하기 위해 모델로 사용 Drosophila 조직의 숫자에 적용하는 중요한 기술입니다. 실험 샘플의 올바른 준비는 매우 중요합니다, 종종 무시, 단계입니다. 준비 과정의 목표는 생리 관련을 보장하기 위해 최적의 영상 조건을 확립하는 것입니다. 조직 생존을 유지하기 위해서는 탈수, hypoxia, 과열이나 매체 저하 2를 피하는 것이 중요합니다.
Drosophila 계란 챔버 바디 patterning, mRNA의 현지화 및 cytoskeletal 조직 3,4로, 제한된 관련된 질문을 검토하지만위한 잘 구축 시스템입니다. 초기 및 중간 단계 달걀 챔버의 경우 할로 카본 기름에 장착하면 그것이, 산소의 무료 보급을 허용 탈수와 hypoxia 방지 및 현미경을위한 최상의 광학 특성을 가지고 거기에 생존을위한 좋은 것입니다. 임형광 단백질의 노화 것은 계란 챔버 또는 라벨 RNA, 단백질 또는 5-7 항체의 물리적 주입으로 transgenes의 도입을 통해 가능합니다. 예를 들어, 동물의 게놈에 MS2 구조의 첨가 oocyte 8 mRNAs의 실시간 관찰이 가능합니다. 이러한 구조는 코트 단백질 9 MS2 박테리오 파지 RNA의 줄기 루프 상호 작용의 활용을 통해 mRNA의 생체내 라벨에 대해 허용합니다.
여기, 우리는뿐만 아니라 여성의 Drosophila에서 개별 ovarioles와 달걀 회의소를 격리 등 난소의 추출을위한 프로토콜을 제시한다. Drosophila oogenesis 보이고 앨런 C. Spradling (1993, 2009 재판) 10에 대한 자세한 설명하십시오.
해부 사전에 1. Drosophila 준비 (E. Gavis, 프린스턴 대학교에 따르면)
참고 : 또는 premix 별도의 용기에 붙여넣은 효모와 주걱으로 유리병에 붙여넣기를 추가합니다.
2. Drosophila의 난소의 해부
3. 격리 ovarioles
참고 : 각 난소는 문자열 10 구슬처럼 배열 여러 단계 중 6-10 에그 챔버로 구성되어 16 대한 ovarioles가 포함되어 있습니다.
참고 : 사전 ovarioles를 격리에 조명이 샘플에 대한 얕은 각도로 치지 않도록, 해부 현미경에 광원을 조정합니다. 이것은 샘플로 명암을 제공하고 젊은 무대 달걀 회의소의 시각화 수 있습니다.
참고 : 이전 단계가 전체 난소에서 분리 되 기엔 너무 큰만큼 전문가 ovarioles가 어린 단계 (germarium 10를 위해 얻은) 사이에 깰 것이다.
참고 : 해부 프로브와 함께 늦은 무대 oocyte를 펑쳐링 것은 기름에 누출되는 세포질의 결과 및 개별 ovarioles의 추출이 매우 어려운 것입니다. 늦은 무대 oocyte가 구멍 경우 신선한 난소로 이동합니다.
참고 : 그것은 오히려 실험을 위해 파리의 N 수를 늘리기 위해 더 적은 파리에서 양쪽 난소를 해부보다는 여러 파리에서 한 난소 각 해부 것이 좋습니다.
참고 : ovariole의 러프 처리는 건강에 해롭습 oocytes 초래할 것이며 실험의 유물로 이어질 수 있습니다.
참고 : Oocytes은 난소 (F로 그림 7E을 비교)에서 해부를 거쳐 40 분 스트레스 때문에 phenotypic 변화를 표시하기 시작합니다.
4. 분리 각 늦은 무대 달걀 챔버 (E. Gavis, 프린스턴 대학교에 따르면)
참고 : 늦은 무대 달걀 챔버 스를 해부하면서 oocyte를 펑쳐링 제가 해부 해와 같이 비난은 아냐어린 단계에 대한 ndividual ovarioles.
참고 : 단계 14 달걀 챔버의 경우, 방향에 대한 지느러미 appendages을 파악하기 위해 집게를 사용합니다.
5. 사출 준비
주 : 중간 단계 oocytes의 주입 들어, 동양 ovarioles 수직 커버 슬립의 긴 축합니다.
6. 형광 RNA의 분사
당신이 시작하기 전에 : 주입 장치 및 주입 바늘이보기의 필드의 중앙 위에 위치하는지와 같은 마이크로 속이는 사람 컨트롤을 설정합니다.
참고 : 지점 방문 기능이 자동 스테이지를 사용하는 경우는 주사에 대해 8-9 oocytes 시작하기 전에 모든 단계를 표시하는 것이 좋습니다. 이것은 쉽게 방문하여 선택한 oocytes의 주입을 허용합니다.
참고 : 올바르게 실행될 때 전체 사출 공정은 10 초도 소요됩니다. 찔러 또는 oocyte에 바늘 안쪽으로 느린 광범는 계란 챔버에 심한 손상을 것입니다.
참고 : 주입하는 동안 실수가 이루어졌다면, 다음 표시된 oocyte로 이동합니다. 손상된 oocytes에 시간을 낭비하지 마십시오.
참고 : needle을 주입 세션 동안 막힌 될 수 있습니다. 이 경우, coverslip에있는 기름에 깨진 유리 조각에 인접한 바늘을 이동합니다. 재치H 동일한 초점 평면에서 유리와 바늘이 부드럽게 유리 (그림 6H)로 바늘을 충돌. 바늘은 사출 버튼을 누르면하고 유체가 종료 바늘의 팁을 경우 확인하여 unclogged되었는지 테스트합니다.
참고 : 오랜 기간 에그 챔버 고립과 oocyte 분사 사이에 경과된 경우 oocytes 스트레스와 연관된 phenotypic 변화를 주입하고 전시하기 어려울 것입니다. 비슷한 문제 oocyte 또는 과도한 볼륨의 분사 (인물 6I을 비교, J, K)의 거친 취급으로 발생할 수 있습니다.
7. 이미징 실험적인 디자인을하다
8. 대표 결과
알렉사-546 grk RNA 합성에서는 체외은 Me31B :: GFP 계란 챔버 (그림 7A)에 주입. RNA는 oocyte의 등 지느러미 앞부분에 localizes하고 핵 주위 캡 (그림 7B)을 형성하고 있습니다. RNA 로컬 라이제이션의 예를 들어 MacDougall N., 외군요. (2003) 11.
형광 표시된 단백질 (타우-GFP, 그림 7C) 또는 RNA 태그 시스템 (grk * mCherry, 그림 7D)을 표현 중순과 하순 무대 oocytes는 주입하지 않고 몇 군데하실 수 있습니다.
1 그림.
그림 2.
그림 3.
4 그림.
그림 5.
6 그림.
그림 7.
라이브 세포 이미징은 실시간으로 세포 프로세스를 검사를위한 강력한 분석이다. 간단한 명시야 관찰 이외에 단백질과 관심 RNAs에 형광 레이블 외에 많은 혁신으로 리드하고 있습니다. 여기에서 우리는 유전자와 생화학 assays와 함께 활용할 수 이미징 개인 생활 oocytes를위한 프로토콜을 설명했습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 실험적으로 주입하여 생활 oocytes를 조작하는 방법에 대해 설명합니다. 직접 RNA 로컬 라이제이션 (배짱과 데이비스되지 않은)과 단백질 6 기능을 억제 항체로 분석에 이차 구조의 능력을 형광 레이블 RNA를 합성에서 체외 포함하여 투입하는 자재에 대한 많은 가능성이 있습니다. 미래의 작품은 가능성이 다른 라벨 구성 요소 및 분자 메커니즘을 테스트할 수 있도록 생활 oocytes에 휴대 기기의 도입을 볼 수 있습니다.
T "> 라이브 세포로 작업할 때 조직의 생존과 건강은 필수적입니다. 보존이 프로토콜에서는, 우리는 계란 챔버 스트레스로 이어질 수있는 단계의 번호를 지정하십시오. 예를 들어, 기름 이미징을위한 최상 임에도 불구하고 기름에 확장된 문화가 계란 챔버에 스트레스를 가져올 수 있습니다. 이것은 쉽게 (Figure7F에 그림 7E을 (악센트가없는) 비교 (스트레스 왜곡과 물집됩니다 핵 형태와 위치, oocyte 막을 검사하여 명시야 노출 아래 모니터할 수 있습니다 )) 강조했다. 스테이지는 9 에그 챔버 스는 RNA의 현지화 및 여러 시간 동안 국경 셀 마이 그 레이션 12 보여줍니다. 그러나 단계는 8분의 7 에그 챔버가에서 제거되고있는 난소 중 약 40 분 후에 헤일로 탄소 기름의 병에 효과를 보이기 시작합니다 여성. 늦게 무대 달걀 실, 14 ~ 스테이지 11, 때문에 이러한 단계 13 살이 소낭 세포에서 알 껍질의 분비의 기름이나 수성 매체 중 하나에서 정상적으로 개발할 수 있습니다. 그것은 repo되었습니다수성 곤충 매체에 대한 인슐린의 추가가 6시간 14 germaria까지 14시간 15에 대해 9 단계 oocytes를 유지할 수있는 rted. 그것이 oocytes를 강조하고 생존을 감소로 모든 경우에서, 계란 챔버의 적극적인 책략은 피해야한다. 이미징 계란 실 적은와 치료 돌보는 각각 부드럽게 최적의 생존을 보장하는 가장 좋은 방법입니다.우리는 공개 할게 없다.
이 작품은 제가 데이비스에 Wellcome 트러스트 수석 연구 활동에 의해 지원되었다.
해부에 사용된 도구는 깨끗한 있어야하지만 autoclaved 할 필요가 없습니다. ETOH와 도구를 닦아주고 시작하기 전에 건조하실 수 있습니다.
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