일반 잉크젯 프린터를 사용하여 과도 세포막의 세공 만들기

요약

bioprinter로 HP 데스크젯 500 프린터를 변환하는 데 사용 방법의 설명입니다. 프린터 멤브레인에 과도 모공의 원인이 생활 세포를 처리할 수있다. 이러한 모공은 인쇄 세포에 형광 G-actin을 포함한 작은 분자를, 통합하기 위해 활용할 수 있습니다.

초록

Bioprinting은 조직 공학, 직접적인 세포 응용 프로그램 요법, 그리고 바이오 센서 microfabrication 포함한 애플 리케이션 및 의의 광범을 가지고 있습니다. 최근 ^1-10을 열 잉크젯 프린팅은 또한 유전자 transfection에 사용되고 있습니다. ^8,9 열 잉크젯 프린팅 공정에 표시되었다 일시적으로 세포 생존에 영향을주지 않고 세포 세포막을 중단. 멤브레인의 과도 모공은 달리 세포 세포질에, 멤브레인을 통과하기에는 너무 큰 것입니다 분자. ^8,9,11을 소개하는 데 사용할 수 있습니다

여기를 시연중인 응용 프로그램이 세포에 fluorescently 레이블 G-actin의 단량체의 설립을위한 열 잉크젯 인쇄의 사용이다. 세포로 분자를 주입하기 위해 열 잉크젯 프린팅을 사용의 장점은 기술은 세포에 비교적 양성이라는 것입니다. 인쇄 후 ^{8, 12} 세포 생존 능력은 표준 셀 괞찮아과 비슷한 것으로 표시되었습니다힘들 방법 ^1,8. 또한, 잉크젯 프린팅 수동 microinjection보다 훨씬 빠르다있는 분이면 세포의 수천을 처리할 수 있습니다. 인쇄에 의해 만들어 모공은 약 두 시간 종료 표시되었습니다. 그러나, 작은 단백질 및 / 또는 입자와 세포를 주입에 기술을 제한 이러한 인쇄 기술과 (~ 10 nm의)를 만들었 기공의 크기에 제한이 있습니다. ^8,9,11

표준 HP 데스크젯 500 프린터가 삭제되었습니다 ⁸ 프린터의 ^{커버, 3, 5.} 세포 인쇄할 수 있도록 수정 및 용지 피드 메커니즘이 기계 레버를 사용하여 무시였습니다. 무대는 직접 프린트 헤드 아래 현미경 슬라이드 및 coverslips의 배치 수 있도록 만들었습니다. 잉크 카트리지가 개설되었습니다 잉크가 제거되었고 그들은 세포와 함께 사용하기 전에 청소했다. 인쇄 패턴 그런 다음 간단한 인쇄 명령을 통해 프린터를 제어 표준 그리기 소프트웨어를 사용하여 만들었습니다. 3T3 fibro폭발은 합류로 성장 trypsinized 후 인산으로 resuspended 것은 용해 fluorescently 레이블 G-actin의 단량체와 염분 버퍼되었다. 세포 현탁액은 잉크 카트리지로 pipetted되었고 세포 라인은 유리 현미경 커버 전표에 인쇄되었다. 살아있는 세포는 형광 현미경을 사용하여 몇 군데되었으며 a​​ctin은 세포질 전반에 걸쳐 발견되었다. 세포에 형광 actin의 설립은 짧은 시간 cytoskeletal 역학 이미징 가능하며 어플 리케이션의 광범위한 유용합니다. ^13-15

프로토콜

1. HP 데스크젯 500을 변환

그것은이 기법은 많은 상용 잉크젯 프린터에서 작동해야한다고 지적한다. 그러나 이전 프린터들은 쉽게 방해할하지 않는 큰 직경의 노즐과 잉크 카트리지를 사용하는 더 효과적 경향이 있습니다. 또한, 구형 프린터는 무시하기 쉽게 기계적 용지 공급 센서를 사용하는 경향이 있습니다. 광학 센서가있는 프린터는 속임수를하지만 각주기 동안 프린터의 먼 가장자리에 종이의 작은 스트립을 사용하지만, "트릭"으로 기계적 시스템보다 약간 더 어렵습니다 수 있습니다. 가장 효과 현재 상용 프린터는 낮은 해상도 (DPI)가.

높은 해상도의 프린터는 더욱 쉽게 방해할 경향이 있습니다. HP 데스크젯 500의 해상도는 300 DPI입니다. 600 DPI의 해상도를 가지고 여러 상용 프린터 (HP 데스크젯 시리즈 등)가 있습니다. 프린터 이러한 종류의 노즐에서만 작은 증가와 함께 사용할 수 있습니다(섹션 3) 신중 청소를 사용하여 완화 할 수있는 문제를 막힘.

1. 프린터 하단의 기지로부터 여러 가지 플라스틱 클립을 풀어 천천히 상체를 리프팅하여 프린터의 상단 플라스틱 케이스를 제거합니다.
2. 프린터의 상단에서 나사가 빠지다는 버튼 / 디스플레이 라이트 패널, 그것이 프린터의 메인 보드에 연결되어 떠나.
3. , 잉크 카트리지가 달려 인쇄가 발생, 특히 지역을 프린터 내부를 청소합니다.
4. 용지 피드 메커니즘에 전원을 공급하는 케이블을 찾아 마더보드에서 그들을 뽑습니다.
   1. HP 데스크젯 500 년, 이들은 단지 전면의 왼쪽을 향해 용지함 아래 찾을 수 있습니다.
5. 종이 탐지 메커니즘을 찾습니다. 문자열 또는 수동 끌어 오기 손잡이 역할을하는 와이어 루프를 affixing하여 메커니즘을 우회.
   1. HP 데스크젯 500, 용지 감지 메커니즘 인쇄 / 용지 피드 메커니즘 위에 그리고 뒤에 발견 회색 플라스틱 레버입니다.
6. 단지 카트리지 인쇄 머리 아래 수준으로 원하는 인쇄 슬라이드를 가지고 순서에 따라 용지 피드 메커니즘 (리포트가 진저리를하고 입금해야 할 장소) 앞에서 무대를 만듭니다.
   1. 실험 내용은, 15 ML의 원심 튜브에 대한 발포 배송 홀더가 원하는 높이에 슬라이드의 마지막 수준을 가지고 인쇄 영역의 위치에 테이프로 여러 개의 현미경 슬라이드와 함께 사용되었다.
7. 무균 기술을 유지하려면 프린터는 표준 생물 학적 캐비닛이나 탁상 층류 후드 안에 들어갈 수 있습니다.
8. 그것은 상용 잉크젯 프린터를 수정하는 것은 일반적으로 프린터의 제조 업체 보증이 무효화됩니다 것이 중요합니다.

2. 전환 증권의 HP 잉크 카트리지 (HP 26 검정 잉크 카트리지)

1. 당분간 프린터 연락처 및 인쇄 머리를 덮고있는 보호 테이프를 떠나, 그 포장에서 카트리지를 제거합니다.
2. 몸을 안정어떤 장애물의 녹색 최고 명확한를 떠나는, 클램프 또는 바이스 (단순히 단단히 보통 잘 역임 손으로 카트리지를 300 명 그들의 창과)와 중 카트리지 (검정색 부분)의.
3. 펜치 또는 조절 렌치를 사용하여 카트리지의 녹색 정상을 파악하고 돌파 때까지 앞뒤로 여러 번 비틀어.
   1. 이것은 많은 힘을받지해야하지만, 최고는 더 이상 필요하지 않습니다, 그래서 그것을 제거할 때라도 부러지면 그것은 괜찮습니다.
4. screwdrivers를 사용하여 현재 노출된 투명한 플라스틱 조각을 잘라낸 캐내다.
   1. 다시,이 힘이 크게 들지는 않으한다지만, 그것은 필요하지 않습니다, 그래서 그것이 제거 중에라도 부러지면 그것은 괜찮습니다.
5. 어느 저수지에서 나머지를 비웁니다.
6. 프린터 연락처 및 인쇄 머리를 덮고있는 플라스틱 보호 테이프를 제거합니다.
7. 철저하게 물을 저수지를 플러시.
   1. 채널을 통해 물을 밀어 피펫이나 주사기를 사용합니다.
   2. 물이 가능성 중에 프린트 헤드로부터 세어 나갑니다이 과정;이 허용이며, 카트리지의 기능 손상을 일으키지 않습니다.
8. 물이 맑은 실행되면 카트리지가 건조 수 있습니다.

3. 잉크 카트리지 청소

1. 깨끗한 인쇄 환경을 유지하기 위해서는 잉크 카트리지는 사용 전후에 세척해야한다.
   1. 이것은 또한 소금과 폐색을 일으킬 수있는 카트리지에있는 다른 생물 학적 물질의 결정화을 피하고를 도와 주실 겁니다.
2. 완전 잠수함 드 이온화된 물을 가득 비커에 카트리지 및 인쇄 전후 15 분 동안 sonicate.
3. sonication 후 물에서 카트리지를 제거하고 여분의 물을 흔들어 봐.
4. 더 무균 환경을 창조하는 카트리지에 스프레이 70 %의 에탄올.
   1. 에탄올은 bioink 인쇄 솔루션을 추가하기 전에 건조되었는지 확인하십시오.

4. 세포 현탁액을 만들기 - "바이오잉크 "

1. 통로로 문화 전지까지 준비.
   1. 3T3 섬유아 세포의 경우 : 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 약 1.3x10 ⁴ 셀 / Dulbeccos 수정일 이글스 중간 (DMEM)에서 cm ^{2 시에} T-75 flasks에 종자 세포. 37 인큐베이터에서 이틀 동안 문화 세포 ° C에서 5 % CO _2.
2. 농도의 형광 G-actin 주식 솔루션을 만들어 50 μg / 인산염 완충 용액 (PBS)의 ML.
3. 항로 세포.
   1. 3T3 섬유아 세포의 경우 : 플라스크에서 미디어를 제거하고 PBS로 두 번 헹굼. 5 분 동안 5 ML 0.25 % 트립신 + EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화로 세포를 커버.
   2. 신선한 매체의 5 ML을 추가하고 5 분 1,000 rpm으로 15 ML 원추형 원심 분리기 튜브와 원심 분리기로 세포 현탁액을 피펫. 대기음이 매체를 보냈다.
4. bioink를 만드는 형광 G-actin 주식 솔루션 PBS로 세포를 Resuspend.
   1. Bioink은 10 μg / ML 및 세포의 공동 G-actin의 최종 농도가 있어야1x10 ⁵ 셀 / ML의 ncentration. 이 농도는 프린터 헤드의 방울과 막힘 당 세포의 크기를 제한하도록 최적화되었습니다 ^8.
   2. bioink 250 μl는 그림 2에 표시된 패턴을 세 가지 표지 전표를 인쇄합니다.

5. Bioprinting

1. 에 전원 및 프린터 리필 해 보자.
2. 장소는 단계 1.6에서 준비한 무대의 중앙에 위치 (여기서, 우리는 22mm X 22mm의 coverslips 사용) 인쇄 표면을 원하는.
3. 인쇄 패턴 파일을 만듭니다.
   1. 오픈 Microsoft Word의 (또는 다른 그리기 소프트웨어), 그리고 원하는 패턴을 그립니다.
   2. premade 파일의 셀 인쇄 원하는 인쇄 패턴을 선택하십시오.
4. 원하는 세포 현탁액으로 준비한 카트리지를로드합니다.
   1. 잘 카트리지 구획의 하단에있는 작은 원형으로 피펫 현탁액. 솔루션의 약 100-120 μl를 사용하십시오. 인쇄 드롭 크기 130 없구picoliters ^8.
5. HP 데스크젯 500 프린터와 함께 파일을 인쇄합니다.
   1. 최상의 결과를 얻으려면, 워드 프로세싱 프로그램에서 원하는 복사의 양을 변경하여, 작은 패턴을 여러 번 (5)를 인쇄할 수 있습니다.
6. 프린터가 다시 데워 다음, 카트리지는 '준비 자세'로 이동합니다.
7. 카트리지 준비 자세 (조금도 이하로 잉크 방울의 왼쪽에 그곳 유지)로 이동하면, 용지 피드 메커니즘 와이어에 올려, 인쇄가 시작됩니다.
   1. 인쇄의 여러 복사본 들어, 용지 피드 메커니즘은 모든 사이클 또는 페이지가 인쇄된 후에 출시해야한다. 카트리지는 다음 "준비"위치로 반환하고, 용지 피드 메커니즘 와이어 다시 제기해야합니다.
8. 프린터 (그림 2 참조) 단계 5.2 인쇄 무대의 중심에 놓여 coverslip에 출력합니다.

6. 대표 결과

표준 재고품의 HP 데스크젯 500 전체 전환 과정의 대표적인 결과는 표준 HP 26 시리즈 카트리지는 전에 말한 바와 같이 분석의 여러 유형에 셀 솔루션을 인쇄 기능이있는 프린터를 생성합니다. 변환 후 완료 프린터로 현미경 커버 슬립을 배치하기 인쇄 무대로, 그림 3에 표시됩니다. 프린터를 포함한 다양한 분야에서 분석에 유용할 수 있지만 이에 국한되지 수 : 단일 세포 역학, 조직 공학, 유전자 transfection, 바이오 센서 micropatterning, 그리고 직접적인 세포 요법 ^{1-10, 16-22.}

이 예제에서는 HP 데스크젯 500 프린터 및 HP 26 시리즈 잉크 카트리지는 bioprinting 위해 수정되었습니다. G-actin의 모노머 용액에서 fibroblast의 세포 현탁액으로 구성된 bioink이 프린터 설정을 사용하면, 전지는 유리 현미경 coverslips에 인쇄되었다. 그림 1은 대표적인 입술을 보여줍니다 통합 형광 actin의 단량체를 보여 인쇄된 fibroblast 세포의 ults. 결과는 세포가 사용자 정의 패턴으로 인쇄되었다되는 통제된 무균 환경에서 획득했다.

이 예제에 사용된 패턴은 마이크로 소프트 워드 (그림 2)에서 만들었습니다. 이 패턴은 현미경 슬라이드의 대부분에 걸쳐 인쇄 솔루션의 지속적인 라인을 만들었습니다. 그림 4는 bioink와 세포 상호 입금되는 직선을 보여줍니다. 이것은 세포가 정지되는 bioink 솔루션, 무료 과잉 형광 actin의 단량체가 들어 있기 때문에 바로 인쇄 후, 배경 형광의 증가가있다는 것을인지해야합니다. 이 배경 형광은 크게 기판에서 초과 단량체을 씻어 세포 (그림 1)에서 성장 미디어뿐만 아니라 이후 감소.

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그림 1. 3 시간 수정된 잉크젯 프린터를 사용하여 인쇄 후 3T3 섬유아 세포의 대표 이미지. 세포의 내부는 통합 fluorescently 태그가 actin의 단량체를 보여줍니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.

그림은 2. bioink를 인쇄하는 데 사용되는 디자인합니다.

그림 3. 스티로폼 무대와 변환 후 프린터. 가운데 주황색 와이어는 종이 이송 레버 센서를 우회합니다.

그림 4. 지역화된 인쇄 영역에서 인쇄 3T3 섬유아 세포의 대표 이미지입니다. 현미경 이미지는 20x 배율에 인쇄 후 5 분 촬영.

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그림 5. 3시간 internalized 형광등 actin의 단량체와 fibroblast를 보여주는 인쇄 후 촬영한 형광 이미지 (40x 배율). 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.

그림 6. 십오분 인쇄 후 촬영한 세포의 형광 현미경 (20x 배율). 이미지는 모두 G-actin (녹색)과 핵 (파란색)를 보여줍니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 : G-actin 알렉사 형석 488와 핵 DAPI, 그리고 모두의 오버레이와.

그림 7. 3시간 인쇄 후 라인 패턴에서 두 섬유아 세포를 보여주는 형광 현미경. 왼쪽의 이미지는 세포 내부 fluorescently 분류 actin의 단량체를 보여줍니다. 오른쪽 이미지는 표시할 배경 이미지와 형광 채널의 오버레이는하지만 그슬라이드 (왼쪽 하단)의 일부 부스러기가있을 수 있습니다, 그것은 형광하지 않습니다. 크기는 맨 오른쪽이 fluorescently 태그를 단량체로 3 시간 동안 incubated 비 인쇄 세포의 컨트롤 그룹입니다 표명하지 않을 경우 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 컨트롤은 단량체가 세포 인쇄하여 멤브레인 permeabilization 않고 세포막을 뚫을 수없는 보여주는 것입니다.

토론

bioprinting위한 표준 잉크젯 데스크탑 프린터를 변환하는 과정은 특별히 어렵지 않습니다. 가장 어려운 단계는 사용하는 프린터의 브랜드와 모델에 따라 달라집니다 용지 피드 메커니즘을 우회하는 방법을 결정합니다. 여기에 설명된대로 용지 공급 센서가 기계적 때 그러나 이것은 비교적 간단합니다. 광학 공급 센서가있는 모델의 경우, 다른 기술은 종이를 사용하는 생각으로 프린터를 속일 고용해야 할 수도 있습니다, 그것은 현미경 슬라이드를 인쇄하는 동안 예를 들어, 하나는 프린터를 통해 종이의 작은 조각을 실행할 수 있습니다. 용지 피드 메커니즘을 우회하는 것은 다른 프린터 모델이 절차를 적용하는 가장 어려운 단계가 될 가능성이 높습니다.

인쇄 coverslips을 잡아 무대를 구성하면 올바른 정렬과 높이를 확보하는 것이 중요합니다. 단계는 인쇄 영역의 중앙에 배치되는 coverslip 수 있도록해야합니다. 또한, PL해야적절한 높이의 에이스는 coverslip 인쇄 카트리지에 대한 허가는 그것을 중단하지 않고 슬라이드를 통해 전달할 수 있도록합니다. 무대의 정확한 높이는 프린터 모델에 따라 달라집니다.

인쇄된 전지가 씻겨되지 않도록하려면 슬라이드를 즉시 추가적인 세포 성장 매체가 추가되기 전에 세포 부착이 가능하도록하기 위해서 약 30 분 동안 인쇄 후 인큐베이터에 배치되었다. 세포는 PBS 대량의 세포가 건조하고 실용적 남아 않았을 포함하는 용액에 인쇄하고 있었 으니까. 전지 셀 (5-7 피규어 1) 내부의 태그를 G-actin의 단량체의 분포를 시각적으로 형광 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. 3T3 섬유아 세포로 인쇄하면 그림 5는 actin이 형광하기 위해 세포의 많은 원인이 있지만, 향상된 밝기의 라인을 보여주는 함께 대표적인 결과를 보여줍니다. fluorescently cytoskeleton에 G-actin 태그의 정관은cytoskeletal 역학과 세포 역학 연구하는 데 유용합니다. ^12-15이 기술의 한계는 약 10 nm의보다 작은 직경을 가지고 분자와 단백질에 대해서만 적용한다는 것입니다.

그 세포가 실제로 변환된 프린터에 의해 처리되고 있었다 보장하기 위해 DAPI는 (PBS에서 1:5000) 순수한 PBS의 볼륨의 절반 대신에 bioink에 추가되었습니다. 형광 얼룩 DAPI는 핵에있는 DNA의 아미노산 풍부한 부분에 바인딩합니다. 따라서 DAPI가 인쇄된 세포의 fluorescently 이미징 핵에 유용 얼룩이다. 그림 6은 알렉사 형석 488 (actin)과 모두의 오버레이 이미지와 DAPI (핵) 형광을 모두 표시하는 세포의 대표 이미지를 보여줍니다. 그림 7은 또한 방법을 보여줍니다 샘플로 입금되었습니다 비 생물 학적 물질 때문에 absenc의 형광되지 않습니다 동안 세포는 G-actin의 단량체가 통합되어 한 형광 빛이 나겠G-actin의 단량체의 전자.

bioprinting위한 하나의 중요한 고려 사항 bioink에 사용되는 수성 미디어입니다. 그것은 혈청과 표준 세포 성장 미디어를 사용하면 일관성없는 결과를 굴복 것으로 나타났습니다. 이것은 대부분 혈청 단백질에 의한 프린트 헤드 노즐의 막힘으로 인한 것입니다. PBS의 사용은 인쇄 패턴의 일관성을 증가하고 세포의 숫자는 입금. PBS를 사용하는 한 가지 단점은 세포가 시간의 장시간 기간 동안 정학에 남아해서는 안된다는 것입니다. 그러나 이러한 예제에있는 섬유아 세포는 세포 생존 능력에는 변화와 함께 적어도 한시간 동안 bioink 조건을 용인할 수 있었다. 이것은 열 잉크젯 메카니즘을 통해 인쇄된 전지가 높은 생존 속도를 가지고 나타난 것으로보고 몇 가지 사전 조사 결과와 일치합니다. ^2-8

이 수정된 프린터 설정은 전지 인쇄가 아닌 다른 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 등 콜라겐이나 fibrone 등 ^16-22 매트릭스 단백질,ctin, 쉽게 세포 patterning에 대해 유용할 수 있습니다이 기술과 기판에 인쇄할 수 있습니다. 예를 들어, 콜라겐 타입의 경우 전 라인 패턴으로 성장 요인을 포함하여 매트릭스 단백질, 기타 분자 이외에 체외 세포 배양 연구 인치 ^17에 사용할 수있는 정렬 콜라겐 기판집니다 인쇄, 안정적으로 세포 연구를 위해 기판에 현지하실 수 있습니다 그리고 잠재적인 치료 응용 프로그램입니다. ¹⁸

위의 단계에서 설명한 디자인의 주요 한계는이 프린터가 하나 이상의 차원에서 인쇄할 수 없다는 점입니다. 여기에는 비계 인쇄와 같은 패턴 응용 프로그램에 사용하기위한 잠재력을 제한합니다. 3D 인쇄를 허용하려면 전문 단계는 사용해야합니다. 무대 bioink의 계층별로 레이어 증착에 대한 증분 높이 조정이 필요 해요.

Bioprinting은 조직 공학을위한 효율적이고 비용 효과적인 방법으로 약속을 보여주었다, 유전자 transfection, micropatterning 및 microarray 제조 ^{1-12, 16-22} 장치의이 유형의 미래 애플 리케이션 등 다양한 있습니다. 공사장 공중 발판 진입 통제 및 패턴 셀룰러 microenvironments, 세포 세포질에 macromolecules의 설립, 그리고 세포의 증착의 창설 그리고 자연적으로 또는 효과적으로 발생하지 않는 구조.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HP 데스크젯 500	휴렛 팩커드	C2106A	제조 업체에서 되었지. 개조된 12 월 상인을 구입했습니다.
HP 26 검정색 잉크 카트리지	휴렛 팩커드	51626A
토끼 근육에서 Actin, 알렉사 형석 488 켤레축, 200 μg	Invitrogen	A12373
인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼	MP의 Biomedicals	ICN1860454
Dulbeccos 수정일 이글스 중간 (DMEM)	써모 과학	SH3002201
태아 소 혈청	시그마 - 올드 리치	F4135
Amphotericin B	시그마 - 올드 리치	A2942	세포 배양 매체에서 0.5 %로 사용
페니실린 - 스트렙토 마이신	시그마 - 올드 리치	P4333	세포 배양 매체에서 0.5 %로 사용
단방향 흐름 클린 벤치	Envirco	VLF 797	프린터가 무균 유지하기위한 선택적 주택