측면 흐름 기술을 사용하여 Haematological 강한 악의 환자에서 침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증의 탐지

요약

침입 폐 아스 페르 길 루스 증에 대한 신속하고 정확한 포인트의 케어 테스트는 제공됩니다. 그것에 바인딩 특정 단클론 항체를 사용하여 수평 흐름 기술을 활용 Aspergillus 항원이 폐의 감염 동안 분비. 검정은 혈청 및 brochoalveolar 세척과 호환되며 질병 진단을위한 소설 부가 시험을 나타냅니다.

초록

침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증 (IPA)는 병적 상태와 haematological 강한 악의 환자와 조혈 줄기 세포 이식받는 ¹ 사망률의 주요 원인이다. IPA가 탐지되면 무서운 진단 도전을 상징하고, '황금 표준'의 부재에서, 임상 데이터 및 미생물학과 조직 병리학 가능의 조합에 의존하고 있습니다. IPA의 진단은 연구 및 치료 암과, "검증된" "가능성"과 "가능성"침략 곰팡이 질환 ^2를 정의 알레르기 및 전염병의 균류학 연구 그룹 (EORTC / MSG) 합의의 국립 연구소를위한 유럽 조직을 따라야합니다 . 현재까지는 핵산 기반 검사가 외부 IPA 감지하고 그래서 중합 효소 사슬 반응 (PCR)에 대해 검증되지 않은 현재의 EORTC / MSG 진단 기준에 포함되지 않습니다.

histological 섹션 Aspergillus의 식별로 인해 시미의 문제가다른 침투성 곰팡이 병원균 ^3, 검증된 식별과 hyphal morphologies의 larities는 순수 문화의 etiologic 요원의 절연이 필요합니다. 문화 기반의 접근 방법은 생검 샘플의 가용성에 의존하지만, 이들은 항상 아픈 환자에 액세스할 수 있으며, 획득한 때 항상 문화 가능한 propagules를 얻을 수 없습니다.

Aspergillus의 pathogenesis에 중요한 기능은 angio-침공, 혈청 및 bronchoalveolar 세척 (BAL) 유체의 특성 antigenic 서명 분자를 탐지 검사를 사용 immunologically 균류를 추적할 수있는 기회를 제공하는 특성입니다. 이것은 Aspergillus galactomannan 및 보존 곰팡이 세포 벽 구성 요소를 감지 (1 → 3)-β-D- '범 - 곰팡이'분석을 (Fungitell 테스트) 감지 Platelia의 효소 면역 분석법의 개발 (GM-EIA)로 이어졌다 글루칸,하지만 그들의 세포 벽의 ^1,4에서이 구성 요소를 결여 mucorales 인치 인가차세대 단클론 항체의 최근 개발 (MAb) 기반 감염 ^1.5의 대리 마커를 감지 assays하게되었다 이러한 테스트 ^1,4-6의 정확성을 둘러싼 피소.

손튼 ⁵ 최근 IPA의 포인트의 케어 (POC) 진단을위한 immuno-색층 측방 흐름 장치 (LFD)를 개발하는 하이 브리 도마 기술의 사용을 사용하여 Aspergillus-특이적인 mAb (JF5)의 생성을 설명했다. LFD의 가장 큰 장점 MAb JF5는 균류 ^5의 적극적인 성장 중에 분비되는 세포외 당단백질 항원에 바인딩 이후로 활동을 감지하는 기능입니다. 이러한 Aspergillus의 포자는 흡입된 공기의 일반적인 구성 요소이기 때문에 IPA를 진단하는 폐암 BAL과 같은 유체를 사용하는 경우 이것은 중요한 고려 사항이다. IPA를 진단 장치의 유틸리티는 LFD는 향상된 감도와 사양을 표시 감염의 동물 모델을 사용하여 증명되었습니다ificity는 Platelia GM과 Fungitell (1 → 3)-β-D-글루칸의 assays ^7로 비교했다.

여기서는 인간의 혈청 및 BAL 체액에서 Aspergillus 항원을 감지하는 간단한 LFD 절차를 제시. 그것의 속도와 정확도가 haematological 강한 악의 환자에서 IPA의 진단을위한 소설 외래 포인트의 케어 테스트를 제공합니다.

프로토콜

1. 수집, 보관 및 세럼과 Bronchoalveolar 세척 유체의 작성

1. 4에서 응고하는 데 사용할 ° C 및 -20시 aliquots 같은 매장 혈청 ° C 이전에 혈액을 허용하여 치료 혈액 샘플에서 혈청 수집합니다. Bronchoalveolar 세척 유체 (BAL)도 -20 ° C.에 aliquots로 저장해야합니다 참고 : 스토리지의 혈청과 aliquots가 반복 테스트 동안 샘플 동결 - 해동 반복에 의한 대상 항원의 저하의 가능성을 제한으로 BAL.
2. 영유권 샘플 및 14,000 rpm으로 1 분 용 vortexing하고 원심 분리기에 의해 철저하게 혈청 및 BAL 샘플을 섞는다.
3. 인간 혈청 시료의 일상 테스트를 위해 조직 배양 매체 (중의)와 혈청 1시 1분 (V / V)를 희석. 중의는 RPMI-1640 배지, 10 % (V / V) 소태아 혈청, 200mM L-글루타민 솔루션의 1 % (V / V) 및 방부제 등 나트륨 azide (0.02 % W / V)로 구성되어 있습니다. 매체는 사전에 준비하고 몇 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. dilut 100 μl를 적용LFD에 에드 묘약.
4. 인간 BAL 체액을 위해, 그리고 동물 모델에서 BAL 체액을 위해, 아니 미리 치료, LFD으로 깔끔한 샘플을 100 μl를 적용합니다.
5. 동물 모델에서 혈청, 인산은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 끓는 물에 목욕, 14,000 rpm으로 5 분을위한 원심 분리기의 3min위한 열을 4% (W / V)를 포함하는 식염수를 버퍼로 혈청 1시 2분 (V / V)를 희석, 100을 적용 LFD 장치에 스트레이트로 뜨는의 μl.

2. 측면 흐름 장치로 혈청 및 BAL의 응용

1. 실온 (23 ℃)에서 측면 흐름 장치를 보관합니다. 이 온도에서는 장치는 12 개월 동안 안정. 수준의 표면에 자신의 파우치와 장소에서 장치를 제거합니다.
2. 멸균 피펫 팁을 사용하여 장치의 릴리스 포트에 사전 처리 혈청 또는 스트레이트 BAL 시료 100 μl를 적용합니다.
3. 분석은 테스트 결과가 기록되어야하는 시간에 실온에서 15 분, 실행 여유를 두십시오. 참고 : 초 이내에 유체가 SE 될 것입니다욕실이 관찰 윈도우에서 nitrocellulose 막 따라 모세관 현상에 의해 마이 그 레이션합니다.

3. LFD 결과 녹음 및 통역

1. LFD는 내부 제어 라인 (플라스틱 하우징에 문자 C로 표시)과 테스트 라인 (글자 T로 표시)으로 구성되어 있습니다. 제어 라인은 항상 혈청이나 BAL 샘플에 관계없이 Aspergillus 항원에 나타납니다. 이것은 분석이 제대로 실행되었는지 보여줍니다.
2. Aspergillus 항원이 혈청이나 BAL 샘플에 존재하는 경우, 테스트 라인은 또한 예제 응용 프로그램 중 15 분 이내에 나타납니다. 테스트 라인의 강도는 샘플에서 Aspergillus 항원 선물의 양에 비례하기 때문에, 테스트 라인 (+) 약한 양성으로 나타날 수, 중간 양성 (+ +) 또는 강한 긍정 (+ + +) . 그러나, 어떠한 긍정적인 테스트 라인은 관계없이 강도의, 예제에서 Aspergillus 항원의 존재를 나타내는 것입니다. 일 년Aspergillus 항원의 전자 부재도, 테스트 라인은 표시되지 않습니다, 그리고 결과는 부정적으로 기록됩니다 (-).

4. 대표 결과

BAL 및 혈청 샘플과 부정, 약한 긍정, 적당한 긍정, 강한 긍정 LFD 결과의 대표적인 예는 그림 1에 표시됩니다.

(AML) 환자 EORTC / MSG 진단 기준에 따라 진단 급성 골수양 백혈병에서 BAL 유체를 사용하여 항원 양성 LFD 테스트 (약한와 강한) 또는 부정 LFD의 시험 결과는 표 1에 표시됩니다. 해당 임상과 mycological (galactomannan 문화) 데이터, 각 환자에 대한 성 Bartholomews 병원 ⁸ 시에 개발된 Aspergillus 특정 PCR 검사의 결과가이 표에 포함되어 있습니다. 질병의 진단은 호스트 요인 (neutropenia, 코르티 코 스테로이드의 장기간 사용, 기타 인정 T-세포 immunos 치료에 기초되었다uppressants), 임상 기준 및 BAL에 대한 GM의 양성 (여기서는 GM의 인덱스 값> 0.8으로 정의). 2002 년 EORTC / MSG 가이드라인 ^10, 환자 12, 13 및 16에서 호스트 요인 및 임상 기준이나 GM의 양성에 기초하여 '가능한'아이오와 진단했다. 각각 임상 데이터 및 균류학에서 증거를 지원 동반하지 않는 한 개정 (2008) EORTC / MSG 지침 ^2, 호스트 요인과 GM의 양성 혼자 또는 호스트 요인 혼자 임상 기준에 따라 '가능성'침략 곰팡이 감염을 가리키지 않을 것입니다. 환자 6 인해 호스트 요인, 주요 및 사소한 임상 특징과 GM의 양성 모두 2002 년과 2008 가이드라인 아래의 '가능성'아이오으로 진단되었다. 참고, 그 LFD이나 PCR의 assays도 현재 EORTC / MSG 가이드라인에 포함하는 동안, BAL 예제에서 Aspergillus 항원 및 핵산의 존재를 나타내는 두 assays와 상업 galactomannan 테스트 간의 강력한 합의가 환자 6과 12의. IPA를 진단 LFD와 PCR assays의 효능을 보여주는 재판의 추가 결과는 존슨 외 ^8에서 찾을 수 있습니다.

그림 1. 혈청 및 BAL을 사용 LFD 테스트 결과 (제어 및 테스트 라인) 제외 (단 제어 라인)과 긍정. 테스트 라인 반응의 농도는 혈청 및 BAL 샘플의 대상 항원의 농도에 비례합니다. 반응은 일반적으로 범위 약한 (+) 중간 통해 (+ +)에 대한 강한 (+ + +). 관계없이 테스트 라인 강도, 세 가지 혈청 긍정적인 반응이 혈류에 Aspergillus 항원을 순환의 존재로 인해 침입 폐 아스 페르 길 루스 증 질환을 나타내는 것입니다. 긍정 BAL 반응 (약한, 중간 또는 강한)는 포자와 폐의의 잠재적 병원성 균사 개발 발아를 나타낼 것이다.

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환자 안돼.	Pati엔트 정보	임상 기준 1	BAL 배양이	GM EIA 색인 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus PCR 결과	LFD 결과
6	-	주요 중부 표준시 표지판 (결절과 후광)과 사소한 일	부정	0.9 (긍정)	유망한 후보자	유망한 후보자	긍정적인	(+) 긍정적인 나약
12	추정 이전 곰팡이 감염	마이너 아무 주요 한도	칸디다 glabrata	6.43 (긍정 강한)	가능한	없음	긍정적인	강한 긍정 (+ + +)
13	Coagulase-음성 포도상ylococcus와 E 혈액에서 대장균	더 중요한 두 사소한 없습니다	부정	0.25 (음수)	가능한	없음	부정	마이너스 (-)
16	가슴 감염	새로운 침투 플러스 복수 유출을 포함한 세 미성년자 기준	부정	0.16 (음수)	가능한	없음	부정	마이너스 (-)

계산된 tomography 스캔 ¹ Nodules 또는 halos은 곰팡이 감염의 암시이다
그것이 정상적인 인간의 식물 ⁹ 일부로 격리 일반적인 두 번째로 효모이므로 BAL 액 ² 칸디다 glabrata는 오염 물질로 간주됩니다
BAL의 GM EIA 시험에서> 0.8의 ³ 색인이 Aspergillus 감염의 지표입니다
⁴ 'possibl에 대한 2002 년 EORTC / MSG 진단 기준에 따라E ','가능성 '또는'검증된 침입 곰팡이 병 ^10
5 '가능한'에 대한 개정 (2008) EORTC / MSG 진단 기준, '가능성'또는 '검증된'침략 곰팡이 ^병이를 바탕으로

표 1. LFD 가능성 IPA로 및 제어 AML 환자 (감염의 증거도없고)에서 급성 골수양 백혈병 환자에서 BAL 샘플을 테스트하고, 감염의 EORTC / MSG 진단 결과.

토론

IPA의 최종 식별은 진정한 생검 샘플에서 etiologic 대리인의 분리에 의해 달성될 수 있지만, 적절한 샘플 회복이 매우 아픈 환자에 자주 불가능하며 Aspergillus는 혈액에서 드물게 복구할 수 있습니다. 주요 진보는 IPA 진단에 가슴 스캔 계산된 단층의 사용되었습니다 있지만, 이러한 "헤일로"또는 "공기 초승달"간판 등 폐 IPA의 암시가 특징 중 일시적이거나 호흡 유물에 의한 것이 또는 다른 곰팡이 감염 ^{11,12합니다.} 이러한 데이터는 따라서 환자의 혈청에서 순환되는 체액이나 BAL, 가래 또는 소변 샘플 ¹³ 존재 그 곰팡이의 서명 분자를 (GM과 β-글루칸)를 식별하는 것을 목표로 serological 기술을 보충하고 있습니다. 이 테스트는 만족스러운 감도를 표시하는 동안, 그들은 특정 조건 하에서 ^1,6 충분한 특이성이 부족하거나 간섭에 시달리다 .

IPA 검출을위한 LFD 테스트는 여기에 제시하는 것은, 대부분의 유명, 바이러스, 박테리아, 기생충 및 독소 ^14-19의 검출을위한 테스트에 날짜와하는 데 사용되었습니다 IPA와 공격의 기술 '포인트의 케어'진단을 가능하게 첫째 1988 년 Unipath에 의해 도입된 검사 가정용 임신은입니다. 여기에서 설명한 Aspergillus LFD에서 Aspergillus-특이적인 mAb JF5는 다공성 nitrocellulose 막에서 캡쳐 영역 (테스트 라인)로 고정됩니다. 별도의 영역에서 막에 고정 안티 - 마우스 면역 글로불린은 내부 통제 (제어 라인)을 역임했습니다. 릴리스 포트에 혈청이나 BAL 액의 추가에서 분리 패드의 MAb JF5-콜로이드 골드 켤레축가 대상 항원에 바인딩하고 복잡한 그리고 모세관 현상에 의한 다공성 멤브레인 따라 전달합니다. 캡처 영역에 고정화 MAb JF5은 빨간색 테스트 라인의 결과 JF5-콜로이드 골드 항원 복잡한에 바인딩합니다. 모든 언바운드 JF5-콜로이드 골드켤레축는 분석이 제대로 실행되었는지 나타내는 내부 컨트롤에 바인딩합니다. 빨간색 제어 라인에서이 결과를.

테스트를 수행하는 데 단 15 분 복용, 신속한이며, GM과 β-글루칸 검출을 기반으로 혈청 및 BAL 검사에 비해 저렴하고, 고가의 장비 또는 실행할 수있는 다양한 실험 시설을 필요로하지 않습니다. 또한, MAb JF5는 GM과 β-글루칸 테스트 ^1,4,6의 허위 - 긍정적인 반응을 일으키는 것으로 표시되었습니다 약물이나 오염 물질과 교차 반응하지 않습니다. 현재 진단 테스트를 통해 추가적인 큰 장점은 Aspergillus 종의 침략 성장을 나타내는 것입니다 활동을 감지하는 LFDs 능력입니다.

LFD 프로 시저에서 중요한 단계는 장치에 대한 혈청 또는 BAL 샘플 신청 후 결과 15 분을 읽을 필요가있다. 시험이 5 월 바이어스 결과 interpretati로 결과를 기록하기 전에 이상 15 분 동안 남아있을 수 없습니다에. 약한 반응은 배양 기간을 연장 향상되지 않습니다. 감염 동물 모델에서 혈청의 열처리는 분석 감도를 향상시키는 것으로 확인되었습니다. 시험의 한계는 그것이 질적이라는 것입니다, 그리고 양성의 주관적인 평가를 할 수있는 연산자에 의존합니다. 테스트 라인의 농도는 혈청 및 BAL 샘플 (그림 1)의 항원 내용에 따라 다릅니다. 그러나, 어떤 긍정적인 반응 (알려진 제외 비교에 의해 결정) Aspergillus 항원 따라서 감염의 존재를 나타냅니다. LFD assays의 주관을 제한하려면, 휴대용 디바이스는 LFD 테스트 라인 농도의 부량을 허용하고 항원 검출 ²⁰ 문턱 값의 설립을 활성화하는 사용할 수 있습니다.

LFD 앞으로의 개발은 상용화 및 기타 침입 곰팡이 병원균의 동시 검출을 허용 멀티 플렉스 LFD의 개발을 포함매우 구체적인 MAbs에게 ^3을 사용.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Aspergillus LFD	은 Exeter 대학교		요청시 해당 작성자의 가능
RPMI-1640	시그마	R0883
L-글루타민	시그마	G7513
태아 송아지 혈청	Biosera	S9100	소태아 혈청의 다른 소식통은 중의의 준비에 사용할 수
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	피셔 과학	BPE120-1