염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

요약

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석을위한 방법입니다 드 노보 감지,.

초록

Genomes은 마이크론 크기의 핵 대 ⁷ 내부의 고차원 ^{conformations, 2, 12,} 도입, 3 차원 구조로 구성됩니다. 이러한 아키텍처는 무작위 아닌 유전자 발기인 및 규제 요소 ¹³ 사이의 상호 작용을 포함. 구체적인 규제 시퀀스에 전사 요소의 바인딩은 전송 규제와 조정 ^{1, 14} 네트워크에 대해 제공합니다.

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석은 이러한 고차원 염색질 구조에게 ^5,6를 식별할 수 있도록 개발되었습니다. 세포 고정하고 상호 작용하는 loci는 공유 결합의 DNA-단백질 상호 링크에 의해 점령된다. 불특정 노이즈를 최소화하고 복잡성을 줄일뿐만 아니라, 염색질 상호 작용 분석의 특이성을 높이기 위해 위해 염색질 immunoprecipitation (칩)은 근접 내고 전에 관심 염색질 조각을 풍부하게하기 위해 특정 단백질 요인에 대해 사용됩니다. 하프 linkers 관련된 내고 그 후 개별적인 염색질의 단지 내에 함께 곁에의 DNA 조각의 쌍 사이에 공유 결합 링크를 형성하고 있습니다. 하프 linkers의 측면 Mm​​eI 제한 효소 사이트는 MmeI는 소화시 이점 끝 태그 - 링커 - 태그 구조 (애완 동물)의 추출이 가능하다는 특징을 가지고있다. 하프 linkers는 biotinylated하므로 이러한 PET 구조는 streptavidin-자석 구슬을 사용하여 정화하고 있습니다. 정화 애완 동물 차세대 시퀀싱 어댑터와 상호 작용하는 조각의 카탈로그 같은 Illumina 게놈 분석기와 같은 차세대 sequencers 통해 생성된과 출혈도 잡았있다. 매핑 및 생물 정보학 분석은 다음 ^여덟 사이트 칩 농축 바인딩 및 칩 농축 염색질 상호 작용을 파악하기 위해 수행됩니다.

우리는 칩의 품질 ChIA-PET 라이브러리의 결과에 중요한 역할을 담당로서 특히 ChIA-PET 프로토콜, 칩의 준비의 중요한 측면을 설명하는 동영상을 제작했습니다. 프로토콜은 것처럼오래만이 중요한 단계는 비디오에 표시됩니다.

프로토콜

A. 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) (그림 1 참조)

1. 염색질 - 바운드 단백질 및 세포 수확의 듀얼 Crosslinking

(비디오 2시 10분에서)

염색질 immunoprecipitation (칩)은 ChIA-PET 라이브러리를 구축에 관련된 중요한 첫 단계입니다. 이 단계는 복잡, 배경 소음 수준을 줄이고 특이성을 추가하는 것이 중요합니다. 칩의 준비 관심 세포 유형 및 요인에 최적화된해야합니다. 이 프로토콜은 저희 연구실에 지어진 MCF-7 세포 ^{9 시부터} 준비 RNA 중합 효소 II의 ChIA-PET 라이브러리를 기반으로합니다. 결과로 도서관이 충분 복잡한지 확인하기 위해 칩 자료를 준비하기 위해 1 X 10 ⁸ 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 표적 세포 라인에 따라 얻은 생산량은 100 300 NG NG로 사이가 될 수 있습니다. 우리는 100 NG 칩의 최소가 공동으로 사용해야하는 것이 좋습니다시퀀스 중에 중복을 최소화하기 위해보다 적은 20여 PCR 사이클로 ChIA-PET 라이브러리를 nstruct. 칩 재료의 높은 금액은 도서관의 품질을 개선, 중복의 추가 감소를 허용합니다.

1. 인산과 배 1 X 10 ⁸ MCF-7 세포 (2 × 10 ⁷ 세포 다섯 500cm ^두 사각형 접시에 상응) 워시 버퍼 식염수 (PBS) 37시 사전 예열 ° C.
2. 1.5 MM와 Crosslink MCF-7 세포는 신선한 화학 퓸 후드의 회전 상온 (22 ° C)에서 45 분 동안 EthylGlycol 비스 (SuccinimidylSuccinate) (EGS)를) 준비.
3. 화학 퓸 배출 후드의 회전 상온 (22 ° C)에서 20 분 동안 1 %의 최종 농도 37 %의 포름 알데히드를 추가합니다.

4. 200 mm의 최종 농도로 2 M 글리신을 추가하여 crosslinkers을 끄다. 실온에서 10 분 동안 품어(22 ℃) 회전.

5. 폐기물 플라스크에 침묵 crosslinkers을 취소하고 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻는다.
6. 부서에서 PBS 및 수확 세포를 폐기하십시오. 빙판에 수확한 세포를 유지. 세포의 모음을 최대화하기 위해 PBS 5ml (테아제 억제제와 함께 ( "+ PI") 제조 업체의 지침에 따라 추가)로 접시를 린스.
7. 4에 10 분 1,800 XG (3,000 RPM)에서 펠렛은 세포 ° C. 뜨는 취소 및 세포 용해를 진행합니다. 또는 -80시 펠렛을 저장 ° C.

2. 세포 용해

(비디오 4시 15분에서)

1. Resuspend 펠렛 철저히 pipetting 15 ML 0.1 % SDS의 용해 완충액 (50 밀리미터 HEPES pH7.5, 150 MM NaCl, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X-100, 0.1 %의 나트륨 Deoxycholate, 0.1 % SDS + PI) 인치 4 ° C.에 15 분 동안 회전
2. 펠렛은 800 ×에서 세포를 lysed4에 10 분 g (2,000 RPM) ° C.
3. 뜨는을 취소하고 한 단계의 2.1 및 2.2 당 세포 용해를 반복하십시오.
4. 고립된 핵 펠렛은 핵 용해 준비가되었습니다. -80시 또는 저장소 펠렛 ° C.

3. 핵 용해

(비디오 5시에서)

핵 용해는 염색질 조각화 전에 가교 염색질을 공개하기 위해 수행됩니다. 핵 막의 부재에서, 가교 염색질은 gentler 조건을 사용하여 sonicated 수 있습니다. 그대로 핵을 원심 분리 후 폐기되기 때문에 가끔 sonication 강도 사건의 핵 멤브레인을 깰하기에 충분하지 않을 수 있습니다 덜 염색질을 얻을 것입니다. 그러나, 다른 세포 유형은 서로 다른 조건을 요구할 수 있습니다.

1. Resuspend 고립된 핵 펠렛 15 ML 1퍼센트 SDS 용해 완충액 (50 MM HEPES pH7.5, 150 MM NaCl, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X-100, 0.1 %의 나트륨 Deoxycholate, 1 % SDS + PI). 고속 - 원심 튜브 (오크 릿지의 원심 분리기 튜브 (폴리 프로필렌))에 핵 서스펜션을 전송 및 4 ° C.에 15 분 동안 회전
2. 펠렛은 4 ° C.에서 30 분간 47,810 XG (20,000 RPM)에서 핵 펠렛을 lysed
3. P1000 피펫 팁과 가만히 따르다 뜨는 및 휴식 펠릿.
4. 30 ML 0.1 % SDS 용해 버퍼 (+ PI)와 펠렛 씻으십시오.
5. 4 ° C.에 15 분 동안 회전
6. 4 ° C. 30 분 47,810 XG (20,000 RPM)에서 펠릿 염색질
7. 뜨는을 취소하고 염색질 조각화로 진행하기 전에 3.6 단계 3.4에 따라 한번 씻어 반복한다. 또는 -80시 매장 염색질 펠릿 ° C.

4. 염색질의 분열

(비디오 7시 3분에서)

1. 14 ML의 폴리스티렌 원형 바닥 시험관으로 환승 염색질 펠릿.
2. 염색질 PE 1 ML 0.1 % SDS 용해 버퍼 (+ PI) 추가llet. 이 sonication 효율에 영향을하므로 혼합물에는 거품이 없습니다 확인하십시오.
3. 브랜 슨 디지털 Sonifer 세포 장애 (진폭 35%, 9 분 (삼십초에서 오프 30 초))와 수행하여 과열을 방지하기 위해 모든 시간에 샘플을 냉정하게 유지할과 200-600 기본 쌍의 크기 전단 염색질-DNA 차가운 방에서 sonication (그림 2 참조).
4. 염색질의 나누어지는을 역방향 - crosslink 다음과 같은 단계를 조각화 효율성을 확인합니다. (다음 단계는 비디오에 표시되지 않습니다.)
   • sonication 후 염색질의 나누어지는 10 μl.
   • 원심 분리기는 4 ° C.에서 5 분 16,110 XG (13,200 RPM)에서 염색질을 sonicated
   • 새로운 튜브에 뜨는 전송 및 Proteinase K 용액 2 μl를 추가합니다.
   • 50 30 분 동안 품어 ° C.
   • 1.5 % 아가로 오스 겔에 대한 리버스 - 가교 염색질를 해결합니다.
   • 반복 하오하지마 sonication DNA의 크기가 예상보다 큰 경우.
5. 4에서 30 분간 16,110 XG (13,200 RPM)에 남아있는 lysate를 원심 ° C와 전송이 자기 ​​구슬과 함께 preclearing 전에 새로운 튜브로 염색질 (뜨는)을 sonicated. 충분한 염색질이 칩을 시작 수집되는 ° C까지 또는 저장소가 -80에서 염색질을 sonicated.

5. 비즈에 대한 항체의 씻음 Preclearing 및 코팅

(비디오 8시 17분에서)

1. 염색질의 Preclearing
   1. 하나의 IP에 대해 자성 단백질 G 비즈 300 μl를 사용하십시오.
   2. 5 ML 비즈가 (PBS, 0.1 % 트리톤 X-100) 버퍼를 씻어로 세 번 구슬을 씻는다. 자기 단백질 G 비즈를 포함한이과 향후 세차장은 다음과 같이 구성되어 있습니다. 자석 구슬 밖으로 건조하지 않도록.
      • 자기 입자 농축기를 사용하여 구슬을 되찾기.
      • 디뜨는 iscard.
      • 버퍼로 구슬을 Resuspend.
      • 4 ° C.에서 5 분간 회전
      • 4에 1 분 129 XG (800 RPM)에서 원심 ° C.
      • 자기 입자 농축기를 사용하여 구슬을 되찾기.
      • 뜨는 폐기하십시오.
   3. 구슬로 염색질의 구속 배경을 제거하려면, prewashed 주판으로 sonicated 염색질이 결합되어 있습니다.
      • 정량 PCR (qPCR)에 의한 후속 농축 체크 "입력"으로 sonicated 염색질의 10 μl 보관하십시오. 4 ° C.에 저장
   4. 4에서 하룻밤 회전 ° C.
   5. 원심 분리기는 4 ° C.에 1 분 129 XG (800 RPM)에서 염색질을 sonicated
   6. 자기 입자 농축기에 튜브를 놓습니다.
2. 마그네틱 비즈로 코팅 항체
   1. 새로운 튜브에 자석 단백질 G 비즈의 나누어지는 300 μl.
   2. 5ml 비즈 워시 버퍼 (PBS, 0.1 % 트리톤 X-100)로 세 번 구슬을 씻는다.
   3. 비즈 워시 버퍼의 동등한 볼륨을 (5.1.3 단계)를 추가합니다.
   4. RNA 중합 효소 II (8WG16) 단클론 항체의 35 μg을 추가합니다.
   5. 4에서 하룻밤 회전 ° C.
   6. 5 ML 비즈 워시 버퍼와 함께 두 항체 코팅 구슬을 씻는다.
   7. 자기 입자 농축기를 사용하여 항체 - 코팅 구슬을 되찾기.

6. 염색질 Immunoprecipitation

(비디오 10시 3분에서)

복잡 배경 소음 수준을 줄이기 위해 특정 단백질 인자에 대한 항체가 근접 내고 ⁶ 전에 관심있는 특정 염색질 조각을 풍부하게하는 데 사용됩니다.

여기서는 단클론 마우스 RNA 중합 효소 II를 사용단백질의 개시 양식을 인식 항체 (8WG16). RNA 중합 효소 II, 라이브러리의 특이성있게 증가 수와 관련된 풍요로운의 DNA 조각으로 적극 장려하고 해당 규제 지역 ⁹ 사이의 장거리 염색질 상호 작용의 식별.

1. 자기 입자 농축기의 도움으로 항체 코팅 구슬에서 버퍼를 씻어 폐기하십시오.
2. 전송은 항체 - 코팅 구슬 (단계 5.2.7부터)에 자성 입자 농축기의 도움으로 염색질을 (단계 5.1.6에서 표면에 뜨는) sonicated.
3. 4에서 하룻밤 회전 ° C.

7. Immunoprecipitated DNA-단백질 단지의 세탁과 용출

(비디오 11시 13분에서)

1. 5 ML 0.1 % SDS의 용해 완충액으로 세 번이나 염색질-immunoprecipitated 구슬을 씻는다.
2. 5 ML 높은 소금 워시 버퍼 (50 밀리미터 HEPES의 산도 7.5와 함께 한 구슬을 씻는다350 MM NaCl, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X-100, 0.1 %의 나트륨 Deoxycholate, 0.1 % SDS).
3. 5 ML 리튬 염화 워시 버퍼 (10 MM 트리스 산도 8.0, 250 MM LiCl, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.5 % Nonidet P-40, 0.5 % 나트륨 Deoxycholate)와 함께 한 구슬을 씻는다.
4. 한 ML TE 버퍼로 버퍼와 resuspend 씻은 구슬을 씻어 폐기하십시오.
5. 4 ° C.에서 5 분간 회전 예제 quantitation 및 칩 농축 체크 준비가되었습니다. 일단 충분한 칩 자료는 예제 ChIA-PET 라이브러리로 건설 준비가 수집되었습니다. 이 단계는 매우 중요하고 성공적인 ChIA-PET 라이브러리 구축을 보장하기 위해 수행되어야합니다. 칩 농축 구슬은 4에서 최대 2 주까지 동안 저장될 수 있습니다 ° C quantitation, 칩 농축 수표, 그리고 충분한 자료 축적을 진행하는 동안.
   1. Elute 및 역방향-crosslink "입력"DNA와 칩 농축 구슬 다음 단계로. (다음 단계는 비디오에 표시되지 않습니다.)
      • 200 μl 칩 용출 버퍼 (50 MM 트리스 산도 8.0, 10 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS)으로 칩 농축 구슬의 20 %를 Elute. 37에서 30 분간 회전 ° C. 4에서 1 분 6,100 XG (800 RPM)에서 eluted 구슬을 원심 ° C. 자기 입자 농축기의 도움을 새로운 튜브에 eluted 칩 단지를 (뜨는) 전송합니다.
      • 50에서 2 시간 2 μl Proteinase K (0.2 G / ML의 최종 농도) ° C.있는 리버스 crosslink "입력"과 eluted 칩 단지
      • 전송 리버스 - 가교 "입력"DNA와 eluted 칩 DNA는 2 ML MaXtract 고밀도로 (각각). 화학 퓸 배출 후드에 튜브 200 μl 25:24:1 페놀 - 클로로포름 - Isoamyl 알코올 산도 7.9을 추가하고 잘 혼합하는 바꾸란. 실온에서 16,110 XG (13,200 RPM)에서 5 분 튜브를 봐.
      • 새로운 튜브로 위 수성 위상을 전송하고 침전하는 가교의 DNA 재치 역방향H 20 μl 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.5, 200 μl 이소프로판올 1 μl 15 밀리그램 / ML Glycoblue. 4 ° C.에서 16,110 XG (13,200 RPM)에서 30 분 30 분 펠릿 DNA를 -80 ° C에서 부화
      • 이소프로판올 시켰던 DNA를 원심 분리 후, 20 μl TE 버퍼에 두번 75% 얼음처럼 차가운 에탄올로 DNA를 펠렛을 씻고 resuspend DNA 펠릿.
   2. picogreen 분석 ¹⁰ "입력"DNA (단계 5.1.3부터)와 칩 DNA를 Quantitate.
   3. 정성 PCR (qPCR)를 통해 농축 검사를 수행합니다.

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)를 사용 B. 염색질 상호 작용 분석

비디오의 후반은 ChIA-PET 라이브러리의 건설의 주요 단계를 강조 표시됩니다.

1. 칩의 DNA 파편의 최종 Blunting

동영상이 장에서는 두 가지 미터 강조아무것 포인트, 자석 구슬과 관련된 효소를 제거하기 위해 자석 구슬을 세정하고 이전 반응 (스텝 1.1 비디오 12시 22분부터 12시 54분까지) 및 효소 반응을 설정 절차의 소금을 버퍼링의 단계별 절차 반응 혼합물 (스텝 1.2, 비디오 12시 54분에서 13시 25분까지) 인치

1. 얼음처럼 차가운 TE 버퍼로 한번 칩 농축 구슬을 씻는다. 자기 구슬을 포함한이과 향후 세차장은 다음과 같이 구성되어 있습니다.
   • 4에서 1 분 6,100 XG (800 RPM)에서 원심 ° C.
   • 자기 입자 농축기를 사용하여 구슬을 되찾기.
   • 뜨는 폐기하십시오.
   • 구슬에 버퍼를 추가합니다.
   • 작업을 flicking하여 버퍼로 구슬을 섞는다.
   • 4에서 1 분 6,100 XG (800 RPM)에서 원심 ° C.
   • 자기 입자 농축기를 사용하여 구슬을 되찾기.
   • 뜨는 폐기하십시오.
2. 대리하려면 sonicated overhangs는 T4의 DNA 중합 효소, 7 μl 10 밀리미터 dNTPs와 615.8 μl nuclease없는 물을 70 μl 10 × 버퍼가있는 마스터 믹스를 준비합니다. 철저하게 섞어서 마스터 믹스로 씻은 구슬을 resuspend. 7.2 μl 9.7 U / 700 μl의 최종 볼륨 μl T4의 DNA 중합 효소를 추가합니다. 37 섞어서 40 분 동안 품어 ° 회전 C (U는 = 60 Palico 생명 공학 Intelli-믹서 RM-2L, F8, 30 RPM, U = 50을 사용). 다음 단계와 이후의 모든 효소 반응을 수행합니다.
   • nuclease없는 물과 반응 버퍼를 희석.
   • 희석 버퍼에 다른 모든 시약을 (효소 제외) 추가합니다.
   • 철저하게 섞는다. 반응 혼합물에 구슬 / 펠렛을 Resuspend.
   • resuspended 구슬 / 펠릿 (최대 효소 활동을 보장하기 위해 항상 benchtop 쿨러 박스에 효소를 유지)에 효소를 추가합니다.
   • parafilm으로 튜브를 밀봉합니다.
   • 구슬은 전체 incubatio 걸쳐 잘 섞어한지N.
3. 반응 혼합물을 취소하고 얼음처럼 차가운 세척 완충액 (10 MM 트리스-CL 산도 7.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 500 MM NaCl)을 세 번이나 떨어진 잔류 버퍼 소금과 효소를 씻는다.

2. 칩 DNA와 Biotinylated 하프 Linkers의 결합

동영상이 장에서는 ChIA-PET의 건설과가 아닌 구체적이고 특정 결합 제품 (13시 28분에서 14시 24분까지) 사이에 구별하는 염기 바코드 구성의 사용에 사용되는 하프 링커 oligonucleotides의 특성을 강조 동영상). 챕터도 반 링커 내고 반응 (스텝 2.2, 비디오 14시 24분부터 15시 54분까지)를 설정하는 단계별 절차를 보여줍니다.

biotinylated 하프 linkers의 두 가지 유형이 프로토콜에 소개하고, 넷 세포핵 (TAAG 또는 ATGT)의 내부 바코드 및 종류 IIS 제한 효소 MmeI (TCCAAC)에 대한 인식 사이트로 설계되었습니다. 칩은 풍성 후, 표준은 염색질의 파편 두 aliquots으로 동등하게 나누어집니다 sonicated 및 상반기 - 링커 또는 반 링커 중 B 조 ^5,9의 과잉과 출혈도 잡았있다.

1. 또는 반 linkers B 각각 biotinylated 반 linkers에 의한 DNA 반 링커 내고 두 aliquots로 칩 농축 구슬을 나누십시오. 염기 바코드로,이 두 반 linkers은 (ATGT 0.5 링커 B 반 링커 TAAG 포함) 역할 가운데 네 개의 세포핵을 제외하고, 동일한 염기 서열을 가지고. 두 개의 다른 칩 단지 사이의 근접 내고, 랜덤이 아닌 특정 ligations 동안 결합​​ heterodimer 순이 linkers와 시퀀스의 인구에서 확인할 수 있습니다뿐 homodimer AA 또는 BB의 linkers과 시퀀스의 인구에서 확인할 수 있습니다 특정 ligations 비해 .
2. PEG 갖춘 140 μl 5 X T4의 DNA ligase 버퍼와 Ligate 칩 강화 구슬, 3.5 μl 200 μl / NG biotinylated 반 linkers 또는 B, 553.5 μl nuclease-무료 물 3 μl 30 U / μl T4의 DNA ligase (ligases도 얼음 불안으로 항상 benchtop 쿨러 박스에서 T4의 DNA ligase 유지). parafilm으로 튜브를 밀봉 및 16에서 하룻밤 품어 ° C를 회전.

3. 용출 및 칩의 DNA 파편의 근접 내고

동영상이 장에서는 구슬에서 염색질 단지의 용출하는 동안 버퍼 EB, SDS 그리고 Triton X-100의 역할을 설명하고 있으며 circularization 반응 (스텝 3.9, 15시 54분로 설정하는 단계별 절차를 보여줍니다 비디오의 17시 10분).

염색질 조각으로 절반 linkers을 ligating 후, 두 분수가 결합하여 염주를 벗어 eluted있다. 상호 작용의 DNA 조각은 다음 근접 내고 중에 완전한 링커 시퀀스로 연결됩니다.

염기 바코드 구성 사용하여 시퀀스는 세 가지 범주로 나눌 수, 즉 WI를 시퀀스일 heterodimer 순이 linkers (바코드 ATGT / TAAG) 및 homodimer AA 또는 각각 ^9가 아닌 구체적이고 특정 내고 제품을 구별하는 BB 탄 linkers (바코드 TAAG / TAAG 또는 ATGT / ATGT)와 시퀀스.

따라서 서로 다른 염기 바코드 두 반 linkers의 사용은 다른 실험 명세를 허용하거나 복제는 물론 다른 칩 단지 ⁵ 사이가 아닌 특정 키메라 내고 속도의 모니터링에 대해서.

1. 얼음처럼 차가운 워시 버퍼 (10 MM 트리스-CL 산도 7.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 500 MM NaCl)와 함께 세 번이나 반 링커 - 출혈도 잡았 구슬을 씻는다.
2. 다음과 같은 방식으로 반 링커 - 출혈도 잡았 구슬을 모두 튜브를 결합.
   • 자기 입자 농축기를 사용하여 반 링커 - 출혈도 잡았 구슬의 튜브 중 하나를 ( "튜브") 개간하다.
   • 얼음 반 링커 - 출혈도 잡았 구슬 ( "튜브 B")의 다른 튜브를 유지.
   • (단계 3.2.1에서) 버퍼를 씻어 f를 삭제롬 튜브와 튜브로 튜브 B에서 반 링커 - 출혈도 잡았 구슬을 (단계 3.2.2에서) 전송은 자성 입자 수집기에 여전히 튜브 동안.
   • 잔여 반 링커 - 출혈도 잡았 구슬을 수집하고 반 링커 - 출혈도 잡았 구슬 두 튜브가 제대로 결합되도록 튜브 B 700 μl 심심풀이 워시 버퍼를 추가합니다. 튜브 A.로 세탁 버퍼를 전송하면 빈 튜브 B.에게 삭제
3. 70 μl 10 × T4 DNA ligase 버퍼 (코), 616 μl nuclease없는 물, 14 μl 10 U / T4의 DNA 폴리 뉴클레오 타이드의 키나제의 μl와 Phosphorylate 반 링커 - 출혈도 잡았 구슬. 회전 37 ° C에서 50 분 알을 품다.
4. 자기 입자 농축기를 사용하여 phosphorylated 반 링커 - 출혈도 잡았 구슬을 되찾기과 반응 믹스를 버리고.
5. 200 μl 신선한 용출 버퍼 (TE 버퍼, 1 % SDS)으로 절반 링커 - 출혈도 잡았 염색질-DNA의 복잡한을 Elute. (상온에서 30 분간 22 품어 °C) 회전.
6. 새로운 튜브에 eluate 전송 900 μl 버퍼 EB으로 구슬을 헹굼. elutions을 결합하기 위해 동일한 튜브에 뜨는 전송합니다.
7. 상온에서 일분 (22 ° C)에 16,110 XG (13,200 RPM)에서 두 원심 분리기 튜브 필터 및 원심의 필터 컵에 수집된 eluate를 전송합니다.
8. 90 μl 20% 트리톤 X-100을 추가하여 SDS를 격리하고 잘 섞어 바꾸란. 37에서 1 시간 동안 품어 ° C.
9. Circularization은 바람직하지 키메라의 DNA 분자를 야기할 것이 다른 염색질의 단지 사이를 내고 이벤트를 최소화하면서 개별 교차 연결된 염색질의 단지 내에 내고 이벤트를 선호하기 위해 매우 묽은 조건 하에서 수행됩니다. 얼음에서 일하는, 50 ML 팔콘 튜브에 침묵 eluate를 전송하고 7,776 μl nuclease없는 물, 1000 μl 10 × T4 DNA Ligase 버퍼 (코)와 33.33 μl 30 U / μl T4의 DNA ligase를 추가합니다. 16 살이 밤새 품어° C.

4. 역방향 - Crosslinking와 DNA 정제

4.4 단계에서 원심 분리 후 pelleted DNA의 클로로포름 추출 (스텝 4.3 17시 11분에서 17시 59분까지)과 근접 : 동영상이 장에서는 페놀의 단계별 절차를 보여줍니다.

1. 역방향 - crosslink 100 μl 20 밀리그램 / ML Proteinase K 용액을 추가하여 저하 단백질. 50 ° C.에서 2 시간 동안 품어
2. 50 ML MaXtract 고밀도로 염색질의 DNA를 전송 19 ML의 최종 볼륨을 얻기 위해 9ml nuclease없는 물을 추가합니다.
3. 화학 퓸 배출 후드의 튜브에 19 ML 25:24:1 페놀 - 클로로포름 - Isoamyl 알코올 산도 7.9을 추가하고 잘 혼합하는 바꾸란. 상온에서 1,800 XG (3,000 RPM)에서 5 분 튜브를 봐.
4. 1.9 ML 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.5, 19 ML isopropan로 50 ML 오크 릿지의 원심 분리기 튜브 (테플론 FEP)와 침전물 염색질의 DNA에 위 수성 위상을 전송좋았 5 μl Glycoblue. Glycoblue는 펠렛의 가시성을 향상시키기 위해 추가됩니다.
5. 적어도 시간 동안 -80 ° C에서 품어. 4 ° C.에서 30 분간 38,720 XG (18,000 RPM)에서 centrifuging 전에 해동하는 냉동 솔루션을 허용
6. 이소프로판올 시켰던 DNA를 원심 분리 후, 34 μl 버퍼 EB에 두번 75% 얼음처럼 차가운 에탄올로 DNA를 펠렛을 씻고 resuspend DNA 펠릿. 1.7 ML의 DNA를 LoBind 튜브로의 DNA 혼합물을 전송합니다.
7. 34 μl 버퍼 EB에서 Resuspend DNA 펠릿.
8. (후속 세척 및 ChIA-PET 프로토콜의 정화 단계로서 RNA와 사내 도서관에서 ChIA-PET 시퀀스의 수동 검사는 RNA 오염 흔적을 표시하지 않은 오염 제거하는 역할 RNase 처리는 선택 사항입니다.)
   • 10 μl RNase ONE 10 × 반응 버퍼, 55 μl nuclease없는 물 1 μl 10 U / μl RNase 한 Ribonuclease를 추가하여 RNase의 소화를 수행합니다. 37 알을 품다한시간 동안 ° C에서.
   • 2 ML MaXtract 고밀도로 염색질의 DNA를 전송합니다. 화학 퓸 배출 후드에 튜브에 100 μl 25:24:1 페놀 - 클로로포름 - Isoamyl 알코올 산도 7.9을 추가하고 잘 혼합하는 바꾸란. 실온 (22 ° C)에서 16,110 XG (13,200 RPM)에서 5 분 튜브를 봐.
   • 새로운 튜브와 10 μl 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.5와 100 μl 이소프로판올와 침전물의 역방향 가교 DNA로 상부 수성 위상을 전송합니다. 4 ° C.에서 16,110 XG (13,200 RPM)에서 30 분 30 분 펠릿 DNA를 -80 ° C에서 부화
   • 이소프로판올 시켰던 DNA를 원심 분리 후, 34 μl 버퍼 EB에 두번 75% 얼음처럼 차가운 에탄올로 DNA를 펠렛을 씻고 resuspend DNA 펠릿.

5. Streptavidin 비즈로 ChIA-PET의 DNA의 부동화

존재에 대해 장 회담의 도입MmeI 인식 사이트 및 태그 - 링커 - 태그 구조 ( "애완 동물"비디오 18시 2분에서 19시 10분까지)의 추출을 용이하게하는 반 링커 oligonucleotides에있는 biotinylated T니다. 또한, 동영상이 장에서는 또한 단계 5.2 PCR 반응 (스텝 6.1, 비디오 19시 10분부터 20시까지)를 설정하고 성공을 절개의 단계별 절차의 신속한 전반적인보기를 제공합니다 ChIA-PET의 DNA (스텝 6.9, 20시에서 20시 반까지).

하프 linkers A와 B는 이러한 유형의 IIS 제한 효소가 결합하여 태그 - 링커 - 태그 구조를 생산, 염색질 조각의 짧은 "태그"를 생성하는 스트림 타겟 구속력이 사이트의 20분의 18 기본 쌍자를 수 있도록 MmeI 인식 사이트를 측면이 포함 ( "애완 동물").

ChIA-PET 구조의 캡처 및 정화를 허용, streptavidin - 코팅 자성 구슬, 반 링커와 B 모두 비오틴과 수정에 의한 PET 구조의 정화를 설정하려면 다음과 같이하십시오.

1. 출시합니다5 μl 10 추가하여 aptured ChIA-PET DNA를 갓 500 μm의 (10 ×) S-adenosylmethionine (SAM) 1 μl 2 U / resuspended DNA와 μl MmeI을 준비 X NEBuffer 4, 5 μl. MmeI에 대한 반응 혼합물에 5 μl 비 biotinylated 반 linkers을 추가하여 초과 MmeI를 끄지 것은 초과 자기 억제가 될 수 있습니다. 37에서 2 시간 동안 품어 ° C.
2. 유전자 LoBind 튜브에 resuspended M-280 streptavidin 비즈의 발표 ChIA-PET의 DNA, 전송 50μl를 캡처합니다. 이 x는 바인딩 및 (: 10 MM 트리스-HCL 산도 7.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2 M NaCl이 X B & W) 버퍼를 씻겼지로 두 번 구슬을 씻는다. 50 μl이 X 흑백 버퍼의 Resuspend 구슬과 같은 튜브에 소화 믹스의 50 μl를 (단계 5.1에서) 전송합니다. 잘 섞어서 회전 실온에서 45 분 동안 품어.
3. 자기 입자 농축기를 사용하여 구슬을 되찾기하고 뜨는 버리고. 150 μl 1 X 바인딩하고 (: 5 MM 트리스-HCL pH는 7.5, 0.5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M NaCl 1 X B & W) 버퍼를 씻겼지로 두 번 구슬을 씻는다.
Ligate 454 GS20 Adaptors,이 단계에서 사용 Ligase 버퍼 해당하는 같은 회사입니다 T4의 DNA Ligase), 4 μl 200 μl / NG 454 GS20 아답터, 4 μl 200 μl / NG 454 GS20 어댑터 B, 36 μl nuclease없는 물 1 μl 30 U / μl T4의 DNA ligase를 공급합니다. 회전 16 ° C에서 밤새 품어. ChIA-PET의 DNA는 우리가 Illumina에서 구입한 PCR 프라이머 PE1.0 및 PCR 프라이머 PE 2.0을 사용하여 라이브러리의 증폭을 추천하는 경우에, Illumina-NN 어댑터와 함께 출혈도 잡았 수 있습니다.
4. 자기 입자 농축기를 사용하여 구슬을 되찾기하고 뜨는 버리고. 150 μl 1 X 흑백 버퍼로 세 번 구슬을 씻는다.
5. 5 μl 10 닉 번역 ChIA-PET의 DNA는 X NEBuffer 2, 2.5 μl 10 밀리미터 dNTPs, 38.5 μl nuclease없는 물과 4 μl 10 U / μl 에스 대장균의 DNA 중합 효소 전에서 하룻밤을 품어회전 상온 (22 ° C).
6. 자기 입자 농축기를 사용하여 구슬을 되찾기하고 뜨는 버리고. 150 μl 1 X 흑백 버퍼로 세 번 구슬을 씻는다.
7. 50 μl 버퍼 EB으로 구슬을 Resuspend.

6. ChIA - 애완 동물의 DNA 증폭

1. 2 μl 구슬 서스펜션과 PCR 반응, 21 μl nuclease 무료 물, 1 μl 10 μm의 Illumina 1-454 프라이머, 1 μl 10 μm의 Illumina 2-454 프라이머 및 25 μl Phusion 하이 피델리티 마스터 믹스를 설정합니다.
2. , 시퀀싱을위한 충분한 PCR 제품을 생성하는 데 필요한 사이클의 수를 결정하는 16, 18, 20 사이클 세 가지 테스트 PCR 반응을 설정합니다.하려면 우리가 매우 낮은 도서관의 복잡으로 그렇게 결과를하는 것으로 나타났습로 20주기를 초과하지 마십시오.

초기 단계	삼십초	98 ° C	(변성)
18-25 사이클	십초	98 ° C	(변성)
	삼십초	65 ° C	(어닐링)
	삼십초	72 ° C	(내선)
마지막 단계	오분	72 ° C	(최종 연장)

3. ChIA-PET의 DNA의 길이는 223 기본 쌍의 밴드의 존재를 확보, SYBR 녹색 내가 가진 4-20%의 기울기 TBE 겔과 염색법에 대한 PCR 반응을 실행하여 가능한 한 최저 사이클 번호를 확인합니다.
4. 아직 시퀀싱을위한 충분한 수율을 얻는 동시에 가능한 몇 가지 PCR 사이클 등으로 대규모 PCR의 ChIA-PET의 DNA 바인딩된 streptavidin 비즈의 나머지 부분을 확대.
5. 다시이 새로운 유전자 LoBind 튜브에 뜨는 자기 입자 농축기와 풀을 사용하는 모든 PCR 반응에서 클레임 구슬. 60 μl 3 M의 아세트산 나트륨, 2 μl GlycoBlue 및 풀링된 반응에 이소프로판올 600 μl를 추가하여 뜨는 각각의 튜브를 침전.
6. 30 분 -80 ° C에서 품어. 4 ° C.에서 30 분간 16,110 XG (13,200 RPM)에서 원심 분리기
7. 100 μl TE 버퍼와 5 μl 6 X로드 염료의 75% 심심풀이 회 에탄올과 resuspend DNA를 펠렛과 이소프로판올 시켰던 DNA, 세탁 DNA 펠렛의 원심 분리 후.
8. 균등하게 6 % TBE 겔의 우물에 PCR 제품을 배포합니다. 35분 200 V에서 1 X TBE 버퍼에서 젤을 실행하고 SYBR 녹색 저도 다크 리더 Transilluminator로 젤을 떠올으로 얼룩.
9. 조심스럽게 소비세 223 BP의 겔에서 밴드와 다음과 같이 "겔 호감 '의 DNA 추출 프로토콜을 수행합니다 :
   • 0.6 ML microc에 excised 겔 조각을 놓으십시오21 G 바늘로 하단에 피어싱되었습니다 entrifuge 튜브.
   • 4 ° C.에서 5 분 16,110 XG (13,200 RPM)에서 1.5 ML 스크류 캡 튜브와 원심 분리기 내부에 각각의 튜브를 배치
   • 각 튜브 200 μl TE 버퍼 산도 8.0을 추가하고 겔 조각이 완전히 버퍼에 열중하고 보장합니다.
   • 37 ° C 하룻밤의 시간 부화를 위해 -80 ° C에서 정지해.
   • 4 ° C.에 10 분 16,110 XG (13,200 RPM)에서 원심 분리기 튜브 필터와 원심 분리기의 필터 컵 각 튜브의 버퍼와 함께 겔 조각을 전송
   • 200 μl TE 버퍼 산도 8.0 첫 번째 스핀 완료되면 각 필터 유닛에 전송 rinsing 버퍼로 각각 1.5 ML 튜브를 씻어.
   • 풀 이소프로판올 가진 필터-통해 침전물.
   • 15 μl TE 버퍼로 Resuspend DNA 펠릿.

7. 품질을 확인ChIA - 애완 동물의 DNA D 증폭

1. 애질런트의 DNA 1000 검정 또는 애질런트 Bioanalyzer 2100에서 애질런트 고감도의 DNA 분석을 사용하여 품질 검사를 진행합니다.
2. 애질런트의 DNA 분석의 electropherogram는 Illumina 게놈 분석기 IIx 시퀀싱을하기 전에 평면 기준과 함께 하나의 피크를 표시해야합니다.
3. Illumina 게놈 분석기 IIx 시퀀싱 이전 ChIA-PET의 DNA가 이상적으로 10 nm의 최소 농도가 있어야합니다. 흐름 전지에 로드할 시료의 양을 결정하기 위해 Illumina qPCR의 부량 프로토콜 가이드에 따라 4 % 포인트 정량 PCR을 수행합니다. 또는 다음과 같이 한 지점 정량 PCR을 수행합니다 :
   • 100시, 10 시부터 1 시까지 컨트롤 템플릿을 희석. 으로 Illumina qPCR의 부량 프로토콜에서 설명한 컨트롤 템플릿은 Illumina 플랫폼에서 시퀀싱을 준비하는 라이브러리로 정의되며, 그것은 측면에서 최대한 유사해야템플릿 크기, GC 컨텐츠 및 라이브러리 유형입니다.
   • ChIA-PET의 DNA 10 시까지를 희석.
   • PCR은 로슈 응용 과학 LightCycler 480 리얼 타임으로 0.1 μl qPCR의 프라이머 1.1, 0.1 μl qPCR의 프라이머 2.1, 5 μl LightCycler480 유전자 SYBR 녹색 나는 마스터 믹스, 3.8 μl nuclease없는 물과 템플릿 1 μl로 각각 희석의 triplicates 설정 PCR 시스템. 템플릿으로 nuclease없는 물 1 μl를 사용하여 두 부정적인 컨트롤을 포함합니다.
     • 초기 변성
       • 95 ° C 오분 4.8 ° C / S
     • 확대
       • 95 ° C 십초 4.8 ° C / S
       • 60 ° C 일분 2.5 ° C / S
       • 72 ° C ~ 삼십초 4.8 ° C/ s의
     • 용융 곡선
       • 95 ° C 오초 4.8 ° C / S
       • 65 ° C 일분 2.5 ° C / S
       • ° C 당 95 ° C 5 인수
     • 냉각
       • 40 ° C 십초 2.0 ° C / S
   • 부정적인 컨트롤이 더 증폭 보여주 없다는 것을 확인하고 CT 값에 대한 표준 편차는 컨트롤 템플릿 dilutions에서 생성된 표준 곡선을 기반 라이브러리 서식 파일의 농도를 계산하기 전에 0.1보다 적습니다.
4. 오후 1시 5분 INT를로드하여 Illumina 흐름 세포 표면에 클러스터를 생성화면의 지시에 따라 O Illumina cBot 클러스터 발전 시스템.
5. 도서관의 품질을 보시려면 단일 차선 Illumina 3-454 시퀀싱 프라이머와 Illumina 4-454 시퀀싱 프라이머를 사용하여 Illumina 게놈 분석기 IIx의 순서 ChIA-PET의 DNA를 진행합니다. -20 ° C.에 남아있는 ChIA-PET의 DNA를 저장 도서관에 좋은 자료가있다면, 같은 18-20000000 고유 읽기를 얻기 위해 샘플 차선 결과에 따라 필요한 4-8 차선의 추가 실행을 위해 샘플을 준비합니다.
   • 유동 세포에로드 ChIA-PET의 DNA의 양은 시퀀싱 데이터 분석 소프트웨어, Illumina의 시퀀싱 제어 Studio의 버전에 따라 크게 달라집니다. 버전 2.9 들어 한 3 분의 1에서 여과 약 21,000,000 패스로 equates 각 타일, 최대 용량의 절반으로로드 농도 범위는 만 9.5에 대해서는 애완 동물의 읽기와 함께 읽습니다.
   • 절감 로딩이 정확베이스 - 전화 f를 보장하기 위해 필요아니면 linkers의 바코드 시퀀스. 이 오류는 링커가 순서가되면 유사한 세포핵의 높은 숫자가 순서가되면, 같은 barcoding 정보를 얻으려면, 경우에 발생합니다. barcoding 정보는 원하는되지 않고 linkers 그런 다음 전체 로딩 농도를 사용할 수 있고, 읽지 못하는 경우.
6. 오프라인 기본 호출하여 변환된 qSeq 파일은 더욱 ChIA-PET 도구 설치 매뉴얼 (버전 4.1) ^8에 따라 ChIA-PET 도구를 사용하여 분석할 수 있습니다.

C. 대표 ChIA-PET 결과

우리는 성공적으로 위에서 설명한대로 칩 소재의 672 NG를 사용하여 MCF-7 세포 (CHM160 및 CHM163) ^9에서 RNA 중합 효소 II 항체 (8WG16)를 사용 ChIA-PET 라이브러리를 잽니다. 초기 진단 겔은 같은 ChIA-PET 프로토콜의 단계 6.2에 언급,이 PCR - 증폭 도서관 운영에 밝고 잘 정의된 밴드를 표시(그림 4 참조) 사용되는 모든 PCR 사이클을위한 223 기본 쌍의 예상 크기입니다.

16 PCR주기는 ChIA-PET 라이브러리를 증폭하는 데 사용되었으며 17.1 NG의 총 수율을 얻은 것입니다. ChIA-PET 프로토콜 (그림 5 참조) 단계 7.1에 언급했듯이 하나의 강렬한 electropherogram 피크는 애질런트 DNA 1000 분석을 통해 223 기본 쌍의 예상 크기로 관찰되었다.

1 그림. 칩 개요. MCF-7 세포는 spatially 인접 염색질 사이에 공유 결합 링크의 결과로 순차적으로 EthylGlycol 비스 (SuccinimidylSuccinate (EGS)과 포름 알데히드와 교차 연결되어 듀얼입니다. 교차 연결된 염색질은 세포 용해에 의해 고정 MCF-7 세포로부터 얻은 것입니다 그리고 핵 용해가. 염색질 그때 200-600 기본 쌍의 크기 범위로 단편화를 받게되었다. Protei와 sonicated 염색질을 사전에 삭제 후이외의 특정 유전자를 제거하는 N G 자성 구슬은 사전 허가 염색질은 관심 염색질을 캡처하는 항체 코팅 구슬과 함께 하룻밤 immunoprecipitated되었다.

그림 2. sonicated 염색질 조각의 젤 분석. 100 BP의 DNA 사다리가 크기 참조를 위해 처음이자 마지막 차선에 표시됩니다. sonicated 염색질은 장거리 염색질 상호 작용을 캡처하는 이상적이다 200-600 BP 사이의 강한 강도를 표시합니다.

그림 3. ChIA-PET 개요. 조각난 염색질의 파편은 최종 병신 게이야 및 측면 MmeI 제한 사이트가있는 biotinylated 반 linkers에 출혈도 잡았 있습니다. 그대로 염색질의 단지 그런 다음 상호 작용의 DNA 조각이 pref가 같은 것을 매우 묽은 조건 하에서 비즈 떨어져 eluted과 근접 내고를 받게됩니다erentially 서로 출혈도 잡았. 리버스 후 DNA-연관된 단백질을 제거하는 상호 연결, MmeI의 소화 그러면 streptavidin 구슬에 대한 선택적 바인딩에 의해 정화되는 태그 - 링커 - 태그 (PET) 구조를 발표할 수행됩니다. PET 구조는 높은 처리량 시퀀싱을위한 어댑터와 함께 출혈도 잡았있다.

4 그림. PCR 증폭 후 ChIA - 애완 동물의 젤 분석. 25 BP의 DNA 사다리가 크기에 참조할 차선 1에서 5로 표시됩니다. 2-4 차선은 각각 비드-고정화 템플릿 2 μl에서 PCR의 16 이후에 생성된 제품, 18 PCR 증폭의 20주기입니다. 이것은 223 BP의 예상 크기에 밝고, 잘 정의된 밴드로 표시 성공적인 라이브러리입니다. 각각의 PCR 반응의 가장 낮은 밴드는 프라이머의 dimers 구성되어 동안 PCR 사이클의 수가 증가하는 경우가 아닌 특정 얼룩이 생성됩니다.

그림 5. 223 BP의 예상 크기의 하나의 강렬한 피크와 함께 성공적인 라이브러리를 프로 파일링 애질런트 2100 Bioanalyzer의 electropherograms의 Illumina-454 어댑터 - 출혈도 잡았 ChIA - 애완 동물. 화면 캡처를 정화의 애질런트 2100 Bioanalyzer 분석. 애질런트 Bioanalyzer 분석은 일반적으로 약간 높은 예상보다 크기를보고합니다,이 경우, 원하는 피크 대신 223 BP의 237 BP에 표시됩니다. 이것은 애질런트 분석의 10 % 오차 범위 내에 있습니다.

토론

ChIA-PET는 전사 조절에 장기적인 상호 작용을 파악하기 위해 개발된 방법입니다. ChIA-PET 라이브러리의 품질을 결정하는 중요한 요인 중 하나는 칩 재료의 품질입니다.

동영상에 표시된 프로토콜은 세포를 상호 연결 EGS와 포름 알데히드의 사용을 포함합니다. 긴 스페이서 팔을 베어링 두 번째 가교 시약과 함께 포름 알데히드의 사용은 혼자 ^3,11,15 포름 알데히드에 의해 구속 수없는 단백질의 바인딩에 도움이 될 수 있습니다. 우리는 강력한 구속력 사이트와 원거리 상호 작용 ^9를 증명하고있다이 방법으로 도서관을 건립했습니다. 그러나, 교차 연결 및 칩 조건 관심의 각 요소에 최적화된되어야하고, 가교 너무 많이는 sonication하여 조각의 어려움을 초래하므로 그렇지 과잉 crosslink 중요하게, 그리고 아마도 가짜 염색질 상호 작용을 초래할 수 . 염색질 상호 작용ChIA-PET으로 식별이 같은 형광에 원위치 하이브리드화 ^4와 같은 다른 방법에 의해 검증되어야한다.

우리는 염색질 소재의 100 NG의 최소 권장합니다. 우리는 염색질 소재의 50 NG에서 양질의 라이브러리를 구축했지만, 우리는 시작 물질의 다량이 허용하는 나쁜 자들이 미만 16 PCR주기,이를 최소화 amplicons과 각 도서관의 중복과 ChIA-PET 라이브러리의 건설. 이것은 낮은 중복되므로 시퀀싱의 적은 차선과보다 포괄적인 염색질 상호 작용지도를함으로써, 높은 고유의 매핑 태그와도 사용할 데이터의 높은 비율로 상호. 각 튜브에있는 구슬의 최종 포장 부피는 각각 자석과 세파 로스 구슬 50 μl, 100 μl 있어야합니다. 포장 비드 볼륨이 명시된보다 작으면 DNA 베어링 구슬의 손실을 최소화하기 위해 유사하게 사전 허가 빈 자성이나 세파 로스 구슬과 최소 포장 볼륨 가져후속 단계들. 잘라 버렸군 오프 팁 또는 대형 코어 팁은 세파 로스 구슬을 pipetting 동안 사용해야합니다.

다음과 같은 수정은 이전에 다음 ID로 출판 ChIA-PET 프로토콜 ^다섯 따라 통합되었다. 첫째, 자기 G 비즈는 세차장 중에 샘플의 손실을 최소화하기 위해 사용되었습니다. 또한, 우리는 스스로 출혈도 잡았 반 linkers 또는 / 및 어댑터의 amplicons로 100 BP 138 BP의 대략적인 크기가 아닌 특정 밴드를 발견. 따라서, 우리는 PCR 증폭하는 동안이 아닌 특정 대역을 최소화하기 위해 biotinylated 반 linkers 및 454 GS20 어댑터의 농도를 감소. 근접 내고 볼륨은 이후 정제 단계 중에 샘플의 손실을 최소화하고 또한 시약 비용을 절감 50 ML에서 10 ML로 축소되었다. 우리는 또한 streptavidin 비즈에서 ChIA - 애완 동물의 DNA 최대한의 캡처를 보장하기 위해 구슬로 ChIA-PET DNA를 고정하기 위해 배양 시간이 증가하였습니다.

근접 내고 단계 동안, 키메라 ligations THAt는 필연적 아닌 구체적이고 랜덤 방식으로 생성되는 생체내 염색질의 상호 작용에 진실을 대표하지 않습니다. 따라서, 어떤 ChIA-PET 실험에서 데이터의 품질을 평가하기 위해 chimerism의 비율은 특정 염기 바코드 TAAG 및 ATGT ⁵ 두 개의 다른 반 linkers의 사용으로 추정된다. 높은 처리량 시퀀싱 후 ChIA-PET 시퀀스가 먼저 ^8을 구분할 수 특정 내고 제품 및 불특정 내고 제품에서 파생된 링커 바코드 조성과 시퀀스에 대해 분석하고 있습니다. 알려진 chimeras의 비율 (즉, heterodimers 순이 linkers)는 우리 내부에 MCF-7 RNA 중합 효소 II의 ChIA-PET 라이브러리 미만 15 % 제시.

ChIA-PET 시퀀스가​​ 연속적으로, 즉 두 종류, 자기 내고 애완 동물과 인터 내고 애완 동물로 분류됩니다. 상호 내고 애완 동물이 전에서 파생되는 동안 셀프 내고 애완 동물은 염색질 조각 자체 circularization의 결합에서 얻은됩니다서로 다른 두 가지의 DNA 조각 사이 nter-내고 있습니다. 후자 그러면 동일한 염색체 (intrachromosomal 상호 내고 애완 동물)에 또는 둘 다 태그가 두 개의 다른 염색체 (interchromosomal 상호 내고 애완 동물)에 매핑됩니다 각 태그의 게놈 거리에 따라 세 가지 범주로 하위 나눈 값입니다. 우리는 서로 다른 범주에게 ⁸ 해결할 ChIA-PET 도구 소프트웨어 패키지를 개발했습니다. 이것은 라이브러리에있는 DNA 조각을 기준으로합니다. 일반적으로, 작은 칩 조각은 높은 해상도를 제공하고 4킬로바이트에 관한 이러한 RNA 중합 효소 II의 ChIA-PET 라이브러리에 대해 차단됩니다.

또한, 실제 염색질 상호 작용은 상호 작용 클러스터에서 상호 결합 애완 동물의 수를 세어 랜덤 노이즈로부터 구별할 수 있으며, 즉, 높은 PET 개수의 클러스터가 실제 염색질 상호 작용 ^8이라는 높은 확률을 가지고 있다고합니다 .

우리의 잘못된 반응을 필터링하려면무작위로 우연히 간 내고 애완 동물을 형성할 수 매우 풍부 앵커에서 상승, 통계 분석 프레임 워크는 또한 두 앵커 ⁸ 사이의 상호 결합 애완 동물을 무작위로 형성 용도에 대한 상세한 설명이 공식화되었습니다.

결론적으로 ChIA-PET 기술은 세계적인 규모 염색질 상호 작용 네트워크를 매핑 수 있습니다. ChIA-PET의 칩 구현은 도서관 복잡 배경 잡음의 감소 수 있습니다. 또한,이 칩은 특정 전사 인자 ^5과 관련된 구체적인 염색질 상호 작용 시험있게 염색질 상호 작용에 특이성을 추가합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4~20% 구배 TBE 겔	Invitrogen	EC6225BOX	B, 6.3 단계
PEG 5 X T4의 DNA Ligase 버퍼	Invitrogen	46300018	b 단계, 2.2
6% TBE 겔	Invitrogen	EC6263BOX	B, 6.8 단계
애질런트 DNA 분석 100	애질런트 테크놀로지	5067-1504	b 단계, 7.1
애질런트 고감도의 DNA 분석	애질런트 테크놀로지	5067-4626
애질런트 Bioanalyzer 2100	애질런트 테크놀로지	G2940CA
(스핀-X) 튜브 필터 원심 분리기	코닝	CLS8160	단계 B, 3.7 및 6.9
다크 리더 Transilluminator	클레어 화학 연구	DR46B	B, 6.8 단계
디지털 Sonifier 세포 장애	브랜	450D-0101063591	, 4.3 단계
DynaMag-2 자석 (마그네틱 입자 농축기)	Invitrogen	123-21D	단계를 닦고 모든 자석 구슬을 위해,, 7.6.1 단계 B를 단계
DynaMag-15 자석 (마그네틱 입자 농축기)	Invitrogen	123.01D	, 5, 6 단계
DynaMag-PCR (마그네틱 입자 농축기)	Invitrogen	49-2025	B, 6.5 단계
대장균의 DNA의 중합 효소 I	코	M0209	B, 5.6 단계
GlycoBlue	Ambion	AM9516	, 7.6.1 단계 B, 4.3 및 6.5 단계
Illumina cBot 클러스터 발전 시스템	Illumina	SY-301-2002	단계 B, 7.4
Illumina 게놈 분석기 IIx	Illumina	SY-301-1301	단계 B, 7.5
Illumina PE primers	Illumina	PE-102-1004	단계 B, 5.4 (필요한 경우)
Intelli-믹서	Palico 생명 공학	RM-2L	, 회전 어떤 incubations를 B 단계
LightCycler 480 리얼 타임 PCR 시스템	로슈	04 640 268 001	, 7.5.3 b 단계, 7.3 단계
LightCycler480 DNA SYBR 녹색 나는 MasterMix	로슈	03 752 186 001	단계 B, 7.5.3
M-280 Streptavidin Dynabeads	Invitrogen	11206D	B, 5.2 단계
마그네틱 (Dynabeads) 단백질 G	Invitrogen	100.03D	, 5.1.1 및 5.2.1 단계
고밀도 (2ml)을 MaXtract	Qiagen	129,056	, 7.6.1 단계
고밀도 (50ml)을 MaXtract	Qiagen	129,073	단계 B, 4.2
MmeI	코	R0637	R0637
RNase 한 Ribonuclease	Promega	M426C	단계 B, 4.8
RNA 중합 효소 II (8WG16) 단클론 항체	Covance	MMS-126R	, 5.2.4 단계
오크 릿지의 원심 분리기 튜브 (폴리 프로필렌)	Nalgene	3119-0050	, 3.1 단계
오크 릿지의 원심 분리기 튜브 (테플론 FEP)	Nalgene	3114-0050	단계 B, 4.3
Phus이온 하이 피델리티 마스터 믹스	Finnzymes	F-531	B, 6 단계
Picogreen (양의-IT) dsDNA 시약	Invitrogen	P11495	, 7.5.2 단계
폴리스티렌 라운드 히프 테스트 튜브	BD Biosciences	352,057	, 4.1 단계
테아제 억제제 칵테일 알약 (완료, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료)	로슈	11873580001	1.6 이후 단계
Proteinase K 솔루션 (20mg/ml)	Fermentas	E00491	7.6.1, 4.4 단계 b 단계, 4.1
T4의 DNA Ligase	Fermentas	EL0013	단계 B, 2.2, 3.9 및 5.4
T4 DNA Ligase 버퍼 (코)	코	B0202S	b 단계, 3.3 및 3.9
T4의 DNA 중합 효소	Promega	M4215	b 단계, 1.2
T4의 DNA 폴리 뉴클레오 타이드의 키나제	코	M0201	B, 3.3 단계
TruSeq SBS 키트 V5-GA	Illumina	FC-104-5001	Illumina 게놈 분석기 IIx 시스템 Regents
TruSeq PE 클러스터 키트 V2-cBot-GA	Illumina	PE-300-2001	Illumina cBot 클러스터 발전 시스템과 함께 사용 될
SYBR 녹색 전	Invitrogen	S-7585	b 단계, 6.3 및 6.8
XCell SureLock 미니 셀 전기 영동 시스템	Invitrogen	EI0001	b 단계, 6.3 및 6.8

이름	순서		댓글
Biotinylated 반 linkers (200ng/μl)	상단	5 'GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3'	250 nmole 규모의 HPLC 정화 내부 비오틴 DT (9)
	봇	5 'GTT GGA TAA GAT ATC GC 3'	250 nmole 스케일 HPLC 정화
Biotinylated 반 linkers B (200ng/μl)	상단	5 'GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3'	250 nmole 규모의 HPLC 정화 내부 비오틴 DT (9)
	봇	5 'GTT GGA ATG 두드리는 ATC GC 3'	250 nmole 스케일 HPLC 정화
비 biotinylated 반 linkers (200ng/μl)	상단	5 'GGC CGC GAT GGA TCC ATC AAC 3'	250 nmole 규모 PCR 학년
	봇	5 'GTT GGA TCC GAT ATC GC 3'	250 nmole 규모 PCR 학년
GS20 아답터 (200ng/μl)	상단	5 'CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCC CATCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 '	250 nmole 규모 PCR 학년
	봇	5'CTG AGA 배속 GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG 배속 GGA TGA GAT GG 3 '	250 nmole 규모 PCR 학년
GS20 아답터 B (200ng/μl)	상단	5 'CTG AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA 배속 GGG ATA GG 3'	250 nmole 규모 PCR 학년
	봇	5 'CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3'	250 nmole 규모 PCR 학년
Illumina-NN 어댑터	상단	5 'ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3'	250 nmole 규모 HPLC 정화는 단계 B, 5.4 참조
	봇	5 'phos - GAT CGG AAG AGC GGT GCA TCA GGA ATG CCG AG 3'	250 nmole 규모 HPLC 정제는 5 '최종 단계 B가 5.4 참조 Phosphorylated
Illumina 1-454 (전진) 프라이머 (10 μm의)	5 'AAT GAT ACG GCG ACC ACC 개그 ATC 전술 ACC CTA TCC CCT TGC GTG CTT G 3'		250 nmole 규모 PCR 학년
Illumina 2-454 (리버스) 프라이머 (10 μm의)	5 'CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG C​​GT GTC 3'		250 nmole 규모 PCR 학년
qPCR의 프라이머 1.1 (10 μm의)	5 '3 시요 AAT GAT ACG GCG ACC ACC 개그'		10nmole 규모 PCR 학년
qPCR의 프라이머 2.1 (10 μm의)	5 'CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3'		10nmole 규모 PCR 학년
Illumina 3-454 시퀀싱 프라이머 (100 μm의)	5'TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3 '		100nmole 스케일 HPLC 정화
Illumina 4-454 시퀀싱 프라이머 (100 μm의)	5'GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3 '		100nmole 규모HPLC 정화