인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

요약

인간의 피부 펀치 생검에서 섬유 아세포의 절편 배양 프로토콜은 낮은 통로 번호로 만 15-20 세포 은행을위한 4-8 주 이내에 피부 세포를 유도하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.

초록

질병을 가진 개인에서 파생 된 조직 및 세포 라인 질병 관련 세포의 표현형을 연구하는 이상적인 소스입니다. 이 프로토콜에서 환자 유래 섬유 아세포가 성공적으로 모델 병 ¹ 유도 만능 줄기 세포의 유도에 사용되었습니다. 이 섬유 아세포의 초기 구절은 특정 질병 경로, 기계 ² 및 후속 약물 검사 방식을 연구하기 위해 셀 기반 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 효소 절차를 통해 제시된 프로토콜의 장점은 1) 효소 처리를하여 노인 환자, 파킨슨 병, 2에 영향을 예를 들면 환자) 더 도전적인 방법론을 통해 기술적으로 간단한 방법에서 파생 된 조직의 소량의 기술의 재현성 및 3아르 ) 시간 고려 사항 :이 프로토콜은 15 ~ 20 분을 소요하고 생검 도착 후 바로 수행 할 수 있습니다. 효소 처리는 4 시간까지 걸릴와의 문제가있을 수 있습니다세포 생존 제대로 처리하지 세포의 후속 첨부 overdigestion, 감소. 이 프로토콜은 4 mm 인간의 피부 섬유 아세포 문화 유도를위한 생검의 해부 및 준비를 설명하고 환자 파생 된 조직 샘플을 다룰 때 중요한 매우 높은 성공률을 가지고 있습니다. 이 문화에서는, 각질이 준비 후 첫 일주일 이내에 생검 조직에서 마이그레이션 할 수 있습니다. 섬유 아 세포는 각질의 첫 번째 파생물 후에 7-10 일이 나타납니다. 20 % FBS와 보충 DMEM 높은 포도당 미디어 각질 섬유 아세포에 섬유 아세포의 성장 각질을 자랄 것입니다 하시 더군요. 이 구절 후 각질 섬유 아세포 마커 SERPINH1 (HSP-47)를 표현 비교적 균질 한 섬유 아세포 배양 결과 중 희석되었다. 이 방법을 사용하여 15-20000000 섬유 아세포는 세포 은행을위한 4-8 주 얻을 수 있습니다. 피부 절개는 15 ~ 20 분 소요, 세포는 다음 하루에 한 번 모니터링하는현미경, 미디어 2-3 일마다 부착과 세포의 파생물 후 변경됩니다.

프로토콜

펀치 생검이 표준 절차 ^{3 (예를} 들어, 4mm 라운드 Visipunch 계기로 얻은)를 사용하여 얻은 피부는 얼음에 완전한 DMEM 20 % FBS 매체에 보관해야합니다. 일단 샘플을 실험실에 도착, 가능한 한 빨리 조직 검사를 처리합니다.

1. 피부 펀치 생검의 준비

단계 1.1-1.3는 생명 공학 안전성 캐비닛 내부 수행해야 할

1. 사전 준비 : 6 잘 플레이트의 각 웰에 젤라틴 0.1 %의 1 ML을 추가합니다. 30-60 분 동안 옆에 접시를 설정합니다. 젤라틴 용액을 흡입하고 각 well에 완료 DMEM/20 % FBS 매체 800 μl를 추가합니다. 잘의 전체 표면은 매체와 적용되어 있는지 확인합니다.
2. 멸균 10cm 조직 문화 접시의 뚜껑을 반전하고 뚜껑의 중앙에 1.5 DMEM의 ML / 20 % FBS 미디어를 추가하고 혈청 피펫 팁 용지 드롭을 확산.
3. 멸균 집게를 사용하여, 장소 t그는 피부 접시에 미디어 조각을 생검.

2. 피부 펀치 생검의 해부

9 2.1-2.2 단계는 수평 층류 후드 안쪽에 수행해야 할

1. 거꾸로 뚜껑에 10cm 접시의 바닥 부분을 놓고, 피부가 층류 후드 해부 현미경 조직 검사 전송할 수 있습니다.
2. 장소에 생검을 보유하는 하나의 메스를 사용하여 한 방향으로 회전 운동으로 잘라 두 번째 메스 같은 반에서 조각을 절단하여 날카로운 모서리를 가진 12-15 균등하게 크기의 조각으로 4 mm 라운드 피부 생검을 해부하다. 비정형 가장자리와 조각이 좋지 첨부 / 세포 부산물에 기여한다.

3. 해부 피부의 전송 조직 배양 플레이트에 조각 생검

단계 3.1-3.6 생명 공학 안전성 캐비닛 내부 수행해야 할

1. 10cm 조직 문화 접시의 바닥 부분을 배치거꾸로 뚜껑 및 전송 접시 위에 다시 생물 안전 캐비닛에에.
2. 마른 우물에 800 μL 및하지를 포함하는 준비된 6 잘 플레이트의 각 웰에 뾰족한 집게, 장소 2-3 생검 조각을 사용. 조각이 잘 하단에 부착 얻기 위해 운동을 도청하거나 슬라이딩을 사용합니다. 메스 집게에서 모든 생검 조각을 제거하는 데 유용합니다.
3. 37 ° C 배양기에서 6 잘 플레이트를 놓습니다. 어떤 증발 매체를 대체하는 매 2 일 1 ~ 200 μl를 추가, 미디어 코팅 첫 주에 대한 우물의 바닥의 영화가 있는지 확인하기 위해 매일 모니터링합니다.
4. 일주일이 지난 뒤, 전체 DMEM/20 % FBS 및 변경 매체 2-3 일마다 2 ㎖에 미디어의 양을 증가시킵니다.
5. 일단 섬유 아세포는 섬유 아 세포 2X T75 플라스크 (통로 1)에 잘 trypsinize 및 통로 6 잘 플레이트의 가장자리에 도달하는 시점에 각 우물에 합류한다. 조직의 조각뿐만 아니라 전송할 수 있습니다. 그들은 (을)를 부착하지 않으며 세척 할 수다음 미디어의 변화 동안 유타.
6. 일단 섬유 아 세포가 합류하다, 배 T175 플라스크 (통과 2) 완전한 DMEM 매체 동결 플러스 1X10 ⁶ 세포 / 유리 병 ml 당 10 %의 DMSO로 전송할 수 있습니다.

4. 면역 염색을 통해 특성화 섬유 아세포를

1. 8 잘 챔버 슬라이드 문화 섬유 아 세포는 젤라틴으로 코팅.
2. 세포가 자랄 때 80 %에있을 때, 각 우물에서 매체를 대기음.
3. 상온에서 십분 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.
4. 1X PBS로 우물 3 번 씻으십시오.
5. 0.3 %의 150 μL와 세포를 Permeabilize 트리톤 실온에서 5 분간 X-100 (PBS)입니다.
6. 1X PBS로 우물 3 번 씻으십시오.
7. 실온에서 1 시간 동안 200 μL 차단 솔루션 (PBS + 5 % 정상 염소 혈청 (벡터, S-1000))를 추가합니다.
8. 솔루션을 차단하는 안티 SERPHIN-1 (안티 - 토끼, 단클론 항체, 시그마, S5950-200 μL)를 1:250 희석을 준비합니다.
9. 차단 솔루션을 spirate 및 AntiSERPINH-1의 1:250 희석 150 μl를 추가합니다. 실온에서 1-2 시간을 품다, 4 ° C에서 하룻밤.
10. 1X PBS로 우물 3 번 씻으십시오.
11. 솔루션을 차단에 1:200 염소 안티 - 토끼 단클론 항체 (알렉사 플 루어 염소 안티 - 토끼 IgG의 (H + L), Invitrogen의, A11008)를 준비합니다.
12. 각 well에 1:200 염소 안티 - 토끼 단클론 항체의 150 μl를 추가합니다. 상온에서, 어둠 속에서 1 시간 동안 배양한다.
13. 1XPBS 한 번 우물을 씻으십시오.
14. PBS를 대기음,주의 깊게 그냥 슬라이드를 나타 내기 위해 챔버를 들어 올립니다.
15. DAPI (벡터, H-1200)를 포함하는 설치 매체의 2 ~ 3 방울 슬라이드를 장착합니다.
16. 형광 현미경 슬라이드를 분석합니다.

결과

각질 박리 후 48 시간 자마자 생검 조각의 성장. 처음으로 섬유 아세포의 파생물은 주일 정도 처리 한 후 관찰 할 수있다. 우물 confluency에 도달하면, 섬유 아세포는 세 150cm 플라스크 (T150)에 도달하기 위해 두 개 더 구절에 대한 계대하고 세포를 냉동 보존됩니다. 우리는이 방법 15-20000000 세포를 생성합니다. 섬유 아세포는 소포체로 번역 콜라겐 특정 분자 보호자입니다 안티 SERPINH1 (또한 HSP-47라고도...

토론

이 프로토콜을 통해 피부 섬유 아세포 상대적으로 순수 배양을 얻을 수 있습니다. 섬유 아세포는 타원형 세포 핵에 둥근 길쭉한, 스핀들 같은 세포 기관의 특성을 형태 학적 특징을 가지고 때 합류 섬유 아세포는 정렬 및 번들에서 성장. 매체는 섬유 아세포의 성장 예를 들어, 각질 추가 보충 및 성장 인자를 필요로하거나 세포 분열 덜 활성화되어 다른 세포 집단 반면이 상대적으로 순수한 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380
Table A. Table of specific reagents and equipments.
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163
Table B. Reagents.