의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

요약

특정 조건에서 배양해 때 결핵은 Mycobacterium 마약 허용 biofilms를 형성합니다. 여기 culturing M.하는 방법을 설명 결핵 biofilms 및 약물 관용 persisters의 주파수를 결정. 이러한 프로토콜은 M.의 약물 내성의 메커니즘에 대한 연구를 위해 도움이 될 것입니다 결핵.

초록

결핵은 Mycobacterium 인간 결핵의 etiologic 에이전트, 항생제를 포함하여 환경 스트레스에 대한 생존을 위해 특별한 능력이있다. 비록 M.의 스트레스 내성 결핵은 결핵 ¹ 6 개월 동안 화학 요법에 대한 가능성 참여자 중 하나입니다, 병원체의 특성 표현형의 기본 분자 메커니즘은 불분명 남아있다. 대부분의 미생물 종은 biofilms ^2-4이라는 조직화 첨부 표면, 그리고 매트릭스 캡슐 구조로 자기 조립에 의해 스트레스 환경에서 생존하기 위해 진화했습니다. 지역 사회의 성장 미생물 선호하는 생존 전략이 될 것 같습니다, 그리고 표면 부착, 세포 통신, 그리고 세포외 고분자 물질의 합성 (EPS) ^{5,6 조절} 유전자 구성 요소를 통해 이루어진다. 환경 스트레스에 대한 내성 가능성이 높습 physiolo에 의해 아마 EPS에 의해 촉진하고있다biofilms ^7의 복잡한 아키텍처 내에서 이기종 microenvironments 개별 bacilli의 gical 적응.

최근 논문 일련의 우리는 그 설립 M. 결핵은 Mycobacterium의 smegmatis과 50 개 이상의 배 안티 - 결핵 약물 isoniazid와 rifampicin의 ^8-10의 최소 억제 농도를 용인할 수 biofilms라는 조직 다세포 구조로 성장하는 강한 성향을,,합니다. M. 미디어뿐만 아니라 분위기 ⁹ 공기의 제한된 교류 : 결핵 그러나 intriguingly 헤드 스페이스의 특정 9시 1분 비율로 성숙 biofilms를 형성하는 특정 조건이 필요합니다. 특수 환경 조건의 요구는 것도 M. 사실에 링크된 수 결핵은 의무를지게 인간 병원체이며, 따라서 조직 환경에 적응하고있다. 본 출판물에서 우리는 culturing M.하는 방법을 보여줍니다 결핵병 및 세균뿐만 아니라 유전자 연구를위한 편리한 12 잘 플레이트 형식의 biofilms. 우리는 M.의 감쇠 변형을 위해 프로토콜을 설명했습니다 병원체 ⁹ 생체내 성장을위한 중요한 두 loci, panCD 및 RD1에서 삭제와 결핵, ^MC이 7000. 이 변형은 안전 따라서 고가의 BSL-3 시설의 요건을 피하 결핵 병원체의 기본적인 생물학을 이해하기위한 BSL-2 억제에 사용할 수 있습니다. 방법은 다른 culturable mycobacterial 종 biofilm 성장을 위해, 미디어의 적절한 수정으로 연장하실 수 있습니다.

전반적으로, culturing mycobacterial biofilms의 유니폼 프로토콜 mycobacteria의 기본 탄력적인 특성을 공부에 관심이 수사를하는 데 도움이됩니다. 또한, 성장 mycobacterial biofilms의 분명하고 간결한 방법도 임상 및 제약 인보이스 도움이 될 것입니다estigators는 잠재적인 약물의 효능을 테스트합니다.

프로토콜

1. M.의 성장 biofilms 250mL 나사 덮힌 병의 결핵

1. 미디어 준비 : 물 900mL에 글리세롤의 60mL, 산화철 구연산 암모늄의 0.05g MgSO ₄ KH ₂ PO ₄ 0.5g, L-아스파라긴의 4g, 구연산 산성의 2g의 0.5g 디졸브. NaOH로 7.0으로 산도를 조정합니다. 압력솥, 시원하고 직전에 실험을 시작으로, 0.1 % w의 최종 농도로 멸균 ZnSO _4를 추가 / 대 MC ² 7000 판토텐산 auxotroph이므로 이러한 변형은 또한 최종 농도 10μg/mL에서 판토텐산이 필요합니다.

참고 : 이것은 M. 결핵에 사용 Sauton의 미디어의 표준 구성입니다. 필요한 경우에는 다른 전문 미디어는 또한 다른 mycobacterial 종의 사용할 수 있습니다.

2. Inoculums 준비 : M.을 키운 0.05 % 0.7-1.0 중 한 주 동안 십대 초반-80, 또는 OD ₆₀₀ 7H9OADC에서 결핵. 세제곱lture 직접 1:100 희석에 inoculum으로 사용할 수 있습니다.
3. 250mL 나사 뒤덮힌 폴리스티렌 병 (코닝)에 Sauton의 미디어 25mL 하는걸. 아주 단단히 매체, 캡 병에 inoculum의 250μl를 추가, 3 주 동안 humidified 37 ° C 배양기에서 그대로 가져 오십시오. 전혀 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 매일 한 번씩 병을 관찰.
4. 셋째 주말에, M의 추가 성장을 허용하도록 병 뚜껑을 느슨하게 인터페이스에서 결핵. 뚜껑이 단계에서 느슨하게하지 않는 경우 다음 컨테이너에 부족한 산소 농도는 박테리아의 추가 성장을 병신 것입니다.

2. M.의 성장 12 잘 접시에 결핵 biofilms

1. 섹션 A1과 A2에서 설명한대로 ^두 MC 7000의 미디어와 inoculum를 준비합니다.
2. inoculum의 600μl와 미디어 60mL를 섞는다. 4.5m 특면플레이트의 각도에 혼합물의 패. 뚜껑이있는 접시를 덮어. parafilm으로 접시를 여러 번 감싸주세요. 오주 동안 37 ° C에서 humidified 인큐베이터에서 그대로 접시를 품어.

3. M.에서 마약 관용 persisters의 주파수를 결정 결핵 biofilms

1. M.을 키운 섹션 B. 이것은에 설명된대로 12도 형식으로 결핵 biofilms은 약 5 주간의 합계를 취할 것입니다.
2. biofilms가 성숙되면 (인큐베이션의 5 주 후에) 피펫으로 microtip을 사용 biofilms 아래 미디어에 원하는 농도에서 항생제의 선택을 주입.

참고 : pellicles 아래 미디어의 볼륨이 약 3.0mL를 줄여줍니다. 그래서 수사관들이 적절하게 약물의 양을 계산한다.

3. 소용돌이 항생제가 철저하게 중간에 한짓되어 부드럽게되도록 접시. 통계적으로 의미있는 결과를 얻으려면 antibi 투입네 우물의 귀의. 병렬에서 항생제가 다른 네 우물에서 해체되는 용매의 동일한 볼륨을 삽입하고, 온전히 접시의 마지막 네 우물 둡니다. 뚜껑에 커버 플레이트와 플레이트 주변 parafilm 신선한 레이어를 넣어. 원하는 기간 동안 인큐베이터에 다시 놓습니다.
4. 배양이 끝나면 플레이트를 열고 우물 각 0.1 %의 최종 농도 (부피 / 부피)에 십대 초반-80 추가합니다. 소용돌이 세제의 균일한 분산을위한 부드럽게 전체 판. 15 분 동안 상온에서 접시를 품어. 그 전체 내용이 균일하게 15mL 원뿔 튜브로 전송 수 있도록 피펫 여러 번 각 우물의 내용을 섞는다.
5. 상온에서 10 분 동안 4000rpm에서 튜브의 내용을 봐. 신선한 세차 버퍼 (10 % 글리세롤 및 0.05 % 십대 초반-80와 PBS)의 5mL에 펠렛을 Resuspend. 세탁 세 번 반복합니다. 세차 버퍼의 5mL에 펠렛을 Resuspend. O를 위해 로커에 보관4에 vernight ° C.

참고 : 저온 원래 M. smegmatis (분산 동안 성장을 최소화하기 위해)를 위해 개발뿐만 M. 결핵에 사용되었지만, 느린 성장하는 수종은 대부분 결과에 어떤 영향없이 상온에서 누볐어 수 있습니다. BSL-3 시설에서 근무하는 경우에는 실온에서 출렁 이는 것은 필요할 수 있습니다.

6. , 적절한 크기의 넓은 끝을 절단 주사기에 맞추려고하고 parafilm로 포장하여 microtip (2-200μl)를 들으며 멸균 주사기를 준비합니다. 팁-장착되어 주사기를 통해 튜브의 전체 내용을 전달하고 신선한 15mL 튜브에 수집합니다. 당신은 매우 동질적인 서스펜션을 관찰할 때까지이 단계에게 5-6 회 반복합니다.
7. 각 우물에 가능한 콜로니의 수를 결정하는 7H11OADC 접시 서스펜션과 접시 dilutions의 일련 dilutions을 준비합니다. 37 ° C 배양기에서 3 주 동안 번호판을 품어. frequen를 결정용매 처리 접시에서 얻은 이들에게 치료를 항생제로 얻은 콜로니 수의 비율을 계산하여 biofilm 인구의 persisters의 사.

4. 대표 결과

M. 한 병에서 배양해, 성장 결핵은 첫 번째 주말에 병 기지에서 볼 수 있습니다. 공기 미디어 인터페이스의 성장이 세 번째 주 (그림 1A)의 끝 부분에 지속적으로 볼 수 있지만 두 번째 주말함으로써, 공기 미디어 인터페이스에 대한 박테리아의 누덕누덕 기운 성장은 볼 수있다. 이때 용기의 벽에 박테리아의 부착도 관찰됩니다. 이 시점 이후로 문화의 성장은 주로 에어 미디어 인터페이스에서 발생합니다. 표면 성장을 아래에 액체가 분명하다. 일반적으로 구조는 다섯 번째 주 (그림의 1B)의 말까지 자라게. 부화가 장기간 경우 구조 컨테이너의 바닥에 침몰하기 시작합니다. Intriguingly,셋째 주말까지 뚜껑의 강화하는 과정에서 중요한 단계이며, 알려지지 않은 이유로 느슨한 덮인 병을 크게 인터페이스 ⁹ 성장의 개시를 retards.

12 음 형식에서는 공기 미디어 인터페이스에서 강력한 biofilm 다섯 주 (그림 2A)의 끝에 우물 각각 볼 수있다. 접시가 완전히 포장되지 않은 경우 다음 차동 biofilm 성장을 준수하고 있습니다. 최악의 경우에는 상당한 미디어 증발은 박테리아의 성장 (그림 2B)이 정지될 수 있습니다. 따라서, 번호판을 배치하는 것은 모두 증발을 방지하기 위해뿐만 아니라 biofilm 형성 (이전 단락을 참조) 환경을 제공하기 위해 필요합니다.

이 기법으로 결정 biofilms의 유력한 bacilli의 수는 아주 재현할 수있다. M.의 응답 결핵 biofilms는 항생제의 성격에 따라 다릅니다. 같은 rifampicin과 같은 bactericidal 항생제의 경우 생존의 손실 bipha을 따른다 SIC 동향 ^9. 인구의 작은 비율에 관계없이 항생제 또는 노출 시간 농도의 항생제에 완전히 고집 불통 남아있는 영구적인 단계 다음에 첫 번째 3~4일 동안 생존의 급격한 하락. 그림 3은 rifampicin의 50μg/mL에 7 일간 노출 (MIC보다 50 배 이상) 후 성숙 biofilms의 유력한 bacilli의 개수를 보여줍니다.

M.의 그림 1A. 초기 모습 배양 3 주 후에 박테리아의 공기 미디어 인터페이스 결핵 bacilli.

그림 1B 있습니다. M.의 biofilms를 성숙 인큐베이션 다섯 주 후에 공기 미디어 인터페이스에 대한 결핵.

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M.의 그림 2A 있습니다. 5 주 오래된 biofilms 결핵은 12도 형식으로 재배.

그림 2B. parafilm없이 12 잘 플레이트에서 M. 결핵 biofilms 양성하는데 실패 시도.

M.에서 마약 관용 persisters의 빈도를 보여주는 3. 대표 플롯 그림 결핵은 12도 형식으로 재배하고 이레 동안 Rifampicin으로 50μg/mL에 노출 biofilms.

토론

은 Mycobacterium 결핵의 감염에 의한 결핵 (TB)는, 세계 공중 건강에 큰 위협이 남아있다. 세계 인구의 거의 삼분의 일은 asymptomatically 병원체에 의해 감염된 것으로 추정되며, 9 백만에 관한 새로운 환자가 활성 결핵 및 감염의 약 170 만 다이 매년 ¹¹ 증상으로 매년 병원에 표시됩니다. 질병의 큰 부담은 주로 백신과 6~9개월 걸쳐 실시 multidrug 섭생과 관련된 매우 복잡한 화학 요법의 부족?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	VWR international	Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles	Fisher Scientific	03-374-300
12-well tissue culture plate	VWR international	62406-165
50-mL conical tubes	VWR international	89039-660
Rocker	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Chromatographic refrigerator	VWR international	55702-520
petri dish	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobasic)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A4284-100G
citric acid	Sigma-Aldrich	C1857-100G
ferric ammonium citrate	Sigma-Aldrich	F5879-100G
glycerol	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
D-pantothenic acid	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
Middlebrook OADC Enrichment	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
250mL storage bottle	Corning	430281
12 well plates	Falcon BD	353043
rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
methanol	JT Baker	9070-05
10mlLsyringe	BD Biosciences	301604
1-200μL pipet tips	VWR international	89079-458
parafilm M	VWR international	PM-996
15mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic)	Sigma-Aldrich	S0876-500G