높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

요약

우리의 3 차원 나노 biofilms 구성된 고밀도 microarray 플랫폼을 개발했습니다 C. albicans라는 칼슘 BChip. 약물 자화율 프로필에서 테스트 칼슘 BChip는 곰팡이 칩이 이상적으로 antifungal 약물의 진정한 높은 처리량 검사에 적합 것을 제안하고, 기존의 96 - 웰 플레이트 모델과 비교입니다.

초록

칸디다 albicans는 현재 미국의 병원 ¹ 번째 가장 일반적인 nosocomial 혈류 감염을 나타내는 칸디다 증의 주요 etiological 대리인, 남아있다. 이러한 기회 감염은 감염된 개인의 증가를위한 성장 위협하고 unacceptably 높은 사망률 속도를 가지고 다니십시오. 이것은 가장 일반적으로 사용되는 antifungal 요원에 대한 저항의 출현에 또 antifungal 약물의 제한 무기고로 인한 부분이지만. 또한 치료를 복잡하게하는 것은 칸디다 증의 발현의 과반수가 biofilms의 형성과 관련있다는 사실이며, 이러한 biofilms 내의 세포는 대부분 임상적으로 사용되는 antifungal 요원 ^{2 ~} 저항의 증가 수준을 보여줍니다. 여기 C. 구성되어 고밀도 microarray의 개발을 설명 우리가 칼슘 BChip ^{3라는했습니다} albicans 나노 biofilms. 간단히, 로봇 microarrayer이 t를 사용C의 O 인쇄 효모 세포 고체 기판 진입 albicans. 인쇄하는 동안, 효모 세포는 같은 50 NL 같은 낮은 적합한 코팅 유리 기판에 고정화 볼륨을 사용하여 입체 매트릭스로 묶여있다. 초기 인쇄 후 슬라이드는 biofilm 개발을 할 수 있도록 24 시간 동안 37 ° C에서 incubated됩니다. 이 기간 동안 반점이 성숙 C.와 관련된 일반적인 구조와 phenotypic 특성을 표시 그 완벽하게 개발된 '나노 biofilms'로 성장 albicans biofilms (즉 형태학의 복잡성, 입체 아키텍처 및 약제 내성) ^4. 전반적으로, 칼슘 BChip는 ~ 750 상당하고 spatially 뚜렷한 biofilms 구성되어있다; 여러 개의 칩을 인쇄와 동시에 처리될 수있는 추가적인 장점과 함께. 세포 생존 능력은 FUN1 신진 대사의 형광 강도 microarray 스캐너를 사용하여 얼룩을 측정하여 추정된다. 이 곰팡이 칩은적으로 U 적합합니다antifungal 약물 발견을위한 진정한 높은 처리량 검사에서 SE. 현재 기준 (즉 biofilm 형성 ⁵ 96 - 웰 microtiter 플레이트 모델)에 비해 곰팡이 biofilm 칩의 주요 장점은 자동화, 소형화, 금액 및 시약과 분석 시간의 비용 절감뿐만 아니라 노동의 철폐입니다 집중 단계. 우리는 이러한 칩이 크게 antifungal 약물 발견 과정을 빠르게 것입니다.

프로토콜

1. 기능화 슬라이드의 작성

1. 이동식 슬라이드 랙에 현미경 슬라이드를 삽입하고, 99 % 에탄올 (histological 학년)를 포함하는 염색법 항아리에 immersing로 두 번 씻는다. 슬라이드가 압축된 질소 가스의 제트를 사용하여 종이 타올 (종이 먼지를 생성하지 않도록 보장) 및 건조를 사용하여 깨끗하게 닦아주십시오.

참고 : 고급 종이 먼지를 생성하는 것처럼 슬라이드를 없애기 위해 김 - 잎사귀를 사용하지 마십시오.

2. 하룻밤 실온에서 농축 황산과 부화로 가득 염색법 항아리에 슬라이드가 포함된 슬라이드 선반 젖어.

참고 : 집중 지방산과 독성과 부식성 화학 물질과 함께 작업하는 동안 피부와의 접촉을 피하려면, 화학 방지 장갑과 안전 고글을 사용합니다.

3. 30 분 용 밀리 Q로 30 분 및 세차 (MΩ 18) 물 공급을 위해 슬라이드를 Sonicate, 다른 세척 따르5 분 대한 cetone. 이 치료는 유리 표면의 silanol 그룹을 제공합니다.
4. 코트 30 분 동안 APTES의 슬라이드 선반을 immersing 각 세차 15 분 동안 밀리 Q 워터에서 3 번 세척하고, 제빵에 의한 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) 솔루션의 2.5 %와 깨끗한 슬라이드 (물에 권 / 권) 110의 용광로에서 슬라이드 ° C ~ 15 분입니다. 제빵은 표면의-NH2-작용화 그 결과 APTES의 가교 있습니다.

참고 : 우선적 유리 용기의 벽에 APTES 예금 이후 플라스틱 용기에 APTES 솔루션을 확인하십시오.

5. 소수성 코팅 ⁶ 모노 레이어를 달성하는 데 1 % (톨루엔의 wt / 권) 폴리스티렌 - 공동 Maleic 무수물 (PS-MA) (시그마)로 스핀 coater, 코트에게 슬라이드를 사용합니다. 30의 3,000 rpm으로 스핀 coater와 코트에 장착된 깨끗한 유리 슬라이드에 PS-MA 2.0 ML을 추가합니다. 이러한 조건은 같은 코팅과 같은 스핀 코팅 매개 변수에 따라 다를 수 있으므로lution, 기판, 코팅의 두께는 다음 방정식 ^7에 의거하여

H 필름 코팅의 두께이고, E는 증발의 비율이고, η, C와 ρ는 각각 코팅 용액의 점도, 농도 및 밀도이고, ω는 각속도이다.

참고 : 퓸 후드의 긴 시간과 사용을 위해 흡입시 톨루엔이 해로운 것을 권장합니다.

6. 8 ° C. - 슬라이드는 2 시에 건조하고 먼지가없는 조건에서 1 개월 최대 슬라이드 선반에 저장할 수 있습니다

2. 효모 Inocula과 콜라겐 캡슐화의 작성

1. C의 야간 문화를 준비 효모 펩톤 덱스 트로 오스의 albicans 변형 SC5314, [YPD, 10 G / L 효모 추출물, 20 G / L 펩톤 및 20 G / L 덱스 트로 오스] C.의 단일 식민지를 inoculating하여 액체 배지 알10로 bicans - YPD ⁸ 20 ML. 30 ° C 하룻밤 사이에서 - 궤도 흔드는 (200 RPM이 약 150)에서 문화를 품다. 10 밀리미터 인산 버퍼, 2.7 MM 염화칼륨; 수확 한 ML 칸디다 albicans 효모 하룻밤 YPD 문화 (5-10 분 동안 5,000 rpm으로 원심 분리에 의해)의 세포 및 멸균 인산 1 ML 10 분 동안 두 번 씻어도 (PBS 염분 버퍼 137 밀리미터 나트륨 염화물, 세차 당 산도 7.4) (시그마). 수확은 10 분 동안 1,900 rpm으로 원심 분리하여 또한 세포를 씻어. 한 ML 재구성 버퍼 (2.2 % (wt / 권) 나트륨 중탄산염 및 4.8 % (wt / 권) HEPES, pH는 7.2와 0.2 N NaOH 용액)에 입힌 세포를 Resuspend.

참고 : C. albicans는 위험 그룹 1/BSL1 미생물이다. 항상이 미생물과 함께 작업에 좋은 무균 / 무균 기술을 사용하고 biohazardous 재료의 적절한 처분을위한 제도적 절차를 따르도록 기억 해요.

2. hemocyt를 사용하여 세포를 세어명시야 현미경에 ometer 5의 세포 밀도 × 10 ⁷ 세포 / ML로 조정합니다.
3. 또한 10 이외에 의해 정지를 열 번은 희석 × RPMI-1640은 L-글루타민과 함께 보완하고 morpholinepropanesulfonic (대걸레) 산성 (산도 7.2)와 버퍼.
4. 콜라겐 (1.8 밀리그램 / ML)와 RPMI-1640에 세포 현탁액을 혼합하여 콜라겐의 효모 세포를 캡슐 (쥐의 꼬리에서 타입 1, BD Biosciences, 베드 포드, MA)은 / 4의 최종 농도 × 10 ⁶ 세포를 얻는 방법 ML. 인쇄하기 전에 콜라겐의 겔화 방지를 위해 얼음 콜라겐 - 세포 현탁액을 유지.

3. 칼슘 BChip의 작성

1. 청소 및 70% 이소프로판올으로 닦는하여 소스 판 역 세척 및 진공 역, 진공 슬라이드 플래터 및 인쇄 챔버를 포함 microarrayer의 모든 표면, 소독.
2. 마이크의 슬라이드 갑판에 PS-MA-코팅 유리 슬라이드의 원하는 숫자를 놓고 진공에 의해 개최roarrayer.
3. 와동 셀 적극적으로 콜라겐의 서스펜션과 바로 인쇄하기 전에 96 - 웰 플레이트의 우물로 잘 혼합 정학 100 μL를 기음. 로딩 스테이션에서이 소스 접시를 놓습니다.
4. 인쇄 과정에서 microarray 챔버 100 %의 상대 습도를 유지하기 위해 가습기를 전환합니다.
5. conically 테이퍼 190 μm의 오리피스 세라믹 팁을 사용하여 비 접촉 증착하여 microarray 망보고 (Omnigrid 마이크로, Digilab 주식 Holliston, MA)를 사용하여 1.2 mm 간격 잊어버리고 명소로 48 행 16 열의 배열의 세포 현탁액의 50 NL 인쇄 (Digilab).
6. 프라임 인쇄의 각 라운드마다 조언 두 번 씻어 진공 건조.
7. 즉시 인쇄 후, 공기 꽉 humidified 챔버 (하이브 리다이 제이션 카세트, ArrayIt 공사, 서니 베일, 캘리포니아)에 슬라이드를 넣고 37 ° C biofilm 형성을 할 수 있도록 24 시간 동안 알을 품다.

4. 저얼의 자화율 시험Antifungal 에이전트 반대 칼슘 BChip의 eformed의 Biofilms

1. antifungal 약물 주식 솔루션이나 분말에서 RPMI-1640 배지에서 작업 솔루션을 준비합니다. 작업 솔루션의 일반적인 최대 농도는 1,024 μg / fluconazole에 대한 ML 및 amphotericin B ⁵ 16 μg / ML 있습니다. 다른 농도는 여러 에이전트에 사용할 수 있습니다.
2. 가운데에있는 화합물의 예상 IC에서 _50까지의 범위를 두 배 dilutions에서 재고 솔루션을 diluting하여 화합물의 8 개의 농도를 준비합니다.
3. biofilm 성장 24 시간 후, 최소한으로 (20 분 나트륨 차아 염소 산염 대우) 긍정 (단 미디어없이 약물 즉 세포)와 부정과 함께 컨트롤을 약물의 8 개의 농도의 50 NL를 인쇄하는 microarrayer를 사용하여 여섯 biofilms 위에 복제합니다.

참고 : 추가하면서 반점의 건조 방지를 위해 100 % 상대 습도를 유지마약을 접근한.

4. 곧 마약을 추가한 후, 24 시간 동안 37 ° C에서 humidified 챔버에서 마약 칩을 알을 품다.
5. CaBChip에게 2 분 3-5 번 PBS의 모든 시간을 그런 일은하여 약물 씻어 37에서 0.5 μm의 FUN1와 30에 대한 ° C 분 ⁹ 칼슘 BChip을 잠복기로 얼룩.
6. 워시 모든 덩크 1-3 분 동안 PBS에서 칼슘 BChip에게 3-5 번 그런 일은으로 꺼져 얼룩 및 질소 스트림을 사용하여 CA BChip을 건조. 380의 PMT 게인과 532 nm의 파장의에서 microarray 스캐너 (GenePix 4100A, 축삭 인 스트 루먼트, CA)를 사용하여 형광 강도를 읽어보십시오.
7. 긍정적인 컨트롤 (노 약물) 및 100 %와 0 %에서 사망 (표백-대우) biofilm 명소의 형광 강도 각각 설정합니다.
8. 다음 방정식을 사용하여 제어 장소의 평균에 대한 상대 형광 강도 (F)의 감소에 의해 비율 억제를 결정

F, F _맥스와 F _O는 원시 형광 약물 치료의 농도, 노 - 약물 제어 및 표백제 - 대우 명소, 각각 어디에 있는지. 스캐너 설정이 각각 F _맥스와 30000 및 4000 RFU의 F _O를 얻기 위해 조정되었다.

9. GraphPad 프리즘 소프트웨어 (라 Jolla, CA)를 사용하여 변수 경사의 언덕 방정식을 맞추하여 50 % 억제 농도 또는 IC에서 ₅₀ 계산합니다.

5. 대표 결과

48으로 구성된 대표적인 칼슘 BChip, × C의 나노 biofilms 16 배열 albicans은 그림 2에 표시됩니다. 명시야 현미경은 나노 biofilm의 전반적인 건축 기능을 보여줍니다. 곰팡이 균사가의 매트릭스 내에 내장되는 biofilm 쇼의 스캐닝 전자 현미경 이미지직경이 약 2 μm의 100 nm의 위치 콜라겐 섬유, 각각. FUN1 묻은 microarray 스캐너 이미지는 곰팡이 biofilms의 특성이지만 효모와 hyphal 형태를 보여줍니다. FUN1 묻은 biofilms의 2D 및 3D-공촛점 형광 이미지는 세포외 기질 (가 아니라 생산 exopolymeric 재료의 캡슐 재료와 가능성이 높습로 콜라겐으로 구성되어 내에 interspersed metabolically 활성 세포 지역으로 공간적 이질을 가지고 볼 수 있습니다 신진 대사 염색으로 물들일되지 biofilm 세포). biofilm의 두께는 약 50 μm의 것으로 추정되었다. 칼슘 BChip 두 약물, fluconazole과 amphotericin B의 antifungal 자화율을 추정하는 데 사용되었고, 그 결과는 그림 3에 표시됩니다. 업계 표준 96 - 웰 플레이트 assays에 게시된 보고서와 일치, biofilms는 fluconazole ¹⁰ 계산 IC에서 _50에 대한 저항력이 있습니다 amphotericin B는 0.3 μg / ML ^11.

칼슘 BChip의 제조를위한 그림 1. 플로우 차트.

그림 2. 인쇄 높은 thoughput 칼슘 BChip의 사진이 로봇 microarrayer을 사용하고 PS-MA-코팅 슬라이드에 768 명소를 포함. 각 반구형 스폿 지름이 대략 700 μm의, 그리고 관광 명소 사이에 1.2 밀리미터 분리와, 볼륨 년 50 NL이다. 또한 (시계 방향) 표시 가벼운 현미경, microarray 스캐너, 2D 및 3D-형광 현미경, 그리고 칼슘 BChip에 대한 개별 biofilms의 전자 현미경 이미지를 스캔할 수 있습니다. 25,000 X의 높은 배율에서 SEM의 그림은 폭이 2 μm의의 hyphal 필라멘트를 보여줍니다.

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그림 3. 칼슘 BChip를 사용하여 () fluconazole 및 (B) amphotericin B에 대한 IC ₅₀ 값 antifungal 자화율 테스트 및 결정의 결과. amphotericin B-대우 biofilms의 형광 현미경 이미지 (C)에 표시됩니다. 결과는 평균 ± 표준 오차는 10를 포함하는 두 개의 개별 칩을위한 의미있는 것은 각각의 컨디션에 복제합니다.

토론

우리는 칸디다 albicans biofilms의 nanoliter 볼륨으로 구성된 셀 기반의 고밀도 microarray, CA BChip을 개발했습니다. microarray는 비 확산, 반구형 3D 젤 필요한 소수성을 제공함과 동시에 콜라겐 겔 명소 강력한 첨부 파일에 허용되는 수정일 유리 기판에 인쇄되었다. 하나 카 BChip은 약 팔 96 - 웰 플레이트를 대체할 수 있으며, 여러 칩은 동시에 인쇄 및 처리할 수 있습니다. 칩, 나노 스케일...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
3 aminopropyltriethoxysilane (APTES)	시그마 - 올드 리치	440,140
폴리스티렌 - 공동 Maleic 무수물 (PS-MA)	시그마 - 올드 리치	426,946
유리 현미경 슬라이드	피셔 과학	12-549-3
쥐의 꼬리 콜라겐 유형 I	BD Biosciences	354,236
로봇 Microarrayer	Omnigrid 마이크로	MICROSYS4000/4100A
Microarray 스캐너	Genepix 개인 4100A	GENEPIX4100A
하이브리드화 카세트	ArrayIt 주식 회사	AHCXD
FUN1 [2 - 동생아RO-4-(2,3-dihydro-3 - 메틸 (benzo -1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-페닐 quinoliniumiodide]	Invitrogen 사	F-7030
Fluconazole	Sicor 제약 주식 회사	J02AC01
Amphotericin B	시그마	A2411
RPMI-1640	Mediatech 주식 회사	50-020-PC
세라믹 팁 190 μm의 오리피스	Digilab	60020441-00
GraphPad 프리즘 소프트웨어	GraphPad 소프트웨어 주식 회사
Genepix 프로 V4.1	분자 장치