심근 국소 빈혈 및 Reperfusion의 Murine 폐쇄 가슴 모델

요약

외과 외상은 염증 반응을 유도합니다. 크린 시토킨 및 내생 리간드는 국소 빈혈과 reperfusion에 따라 심근 경색 크기를 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 thoracotomy의 영향을 최소화하기 위해 매달려 가중치를 사용하여 murine 국소 빈혈과 reperfusion의 수정된 폐쇄 가슴 모델을 제시.

초록

관상 동맥 내고의 열린 가슴 모델 thoracotomy 의한 외과 외상은 국소 빈혈과 reperfusion에 관련된 다양한 메커니즘을 수정하는 면역 반응을 유도합니다. 면역 반응은 시토킨 표현과 타고난 면역 수용체의 내생 리간드의 릴리스 또는 분비를 포함합니다. 타고난 면역의 활성화 가능성이 경색 크기를 조절하실 수 있습니다. 우리는 심근 사전 및 postconditioning 및 심근 국소 빈혈과 reperfusion에 타고난 면역의 역할을 연구에 유용 될 수 매달려 가중치를 사용하여 기존의 murine 폐쇄 가슴 모델을 수정했습니다. 이 모델은 동물 심근 국소 빈혈의 발병 이전에 수술 상처로부터 복구 할 수 있습니다.

휘발성 anesthetics은 강렬한 연구되었으며 허혈성 심장에 대한 그들의 preconditioning 효과가 잘 알려져있다. 그러나이 보호 효과는 관상 동맥 내고의 열린 가슴 모델 년에 사용하는 걸로. 따라서 다른 이점은 일의 사용이 될 수도만성 폐쇄 가슴이 모델의 계측을위한 전자 제어 아니라 휘발성 anesthetics, 그들의 preconditioning 효과가 72 시간까지 지속하고 있기 때문입니다. 일시적 국소 빈혈과 여러 히트 모델 만성 심장 질환이 모델의 다른 가능한 응용 프로그램입니다.

만성 폐쇄 가슴 모델의 경우 intubated하고 통풍이 마우스는 4 늑간 공간을 통해 가로 무딘 thoracotomy을 받고있다. 끈 내림차순 왼쪽 앞부분에 따라 신분이 그릇 아래에 전달되는 두 봉합 종료는 occluder를 통해 스레드됩니다. 그런 다음, 두 봉합 종료는 루프를 형성 매듭이 가슴 벽, 통과 및 피하 조직에 남아 있습니다. 가슴 폐쇄와 5 일 동안 복구 후 생쥐가 다시 anesthetized이며, 가슴 피부가 재개되고 매달려 가중치는 ECG 통제 루프에 매여있다.

국소 빈혈 / reperfusion 프로토콜의 끝에서 마음이 경색에 대한 TTC 물들일 수사이즈 평가 또는 조직학 및 immunohistochemistry에 추가 morphometric 연구를 허용하도록 관류 고정을 받고있다.

프로토콜

1. 아나스타샤의 유도

1. isoflurane과 유도의 경우, 3.0 권 % 및 0.5 L / 분 산소의 흐름에 증기 세트에 연결되어 유도 상자에 마우스를 놓습니다.
2. 무의식은 응답 및 부재되는 forelimb 또는 hindlimb 페달 탈퇴 반사를 유발시키지 못하는 촉각 자극으로 달성되면, 위로 향한 자세로 온도 제어 운영 테이블에 마우스를 놓습니다. 유도 상자를 통해 증기에 연결된 비강 원추형을 통해 마취를 유지합니다. 삽관법을 촉진하기 5-0 나일론 봉합사로 상부 incisors을 고정하여 머리를 뒤로 젖혀도.
3. 37 바디 코어 온도를 유지하기 위해 직장 온도 프로브를 삽입 ° C. 테이프로 사지를 고정한다. 왼쪽 가슴을 열고 좋은 마음을 폭로 오른쪽 다리 위에 왼쪽 아래 다리를 건너.
4. 목 및 왼쪽 가슴에 depilatory 크림을 적용합니다. 일분 후 아이스크림을 닦아주십시오. 지역 피부 povidone - 요오드를 적용소독. subcutaneously 통증 완화를 위해 buprenorphine 0.05 밀리그램 / kg 체중을 주사.
5. 작은 가위로 중간선 목 피부 절개를합니다. 호흡 관을 커버 분비와 근육을 해부 무딘. 환풍기를 켭니다. 환풍기 설정은 생리적 매개 변수를 조정해야합니다. 우리는 Minivent, 휴고 삭스 Elektronik, 105/min의 호흡 률과 하버드 장치와 200 μl의 조류 볼륨을 사용합니다. 집게로 혀를 당겨 부드럽게 22 G 금속 튜브를 삽입합니다. 기도와 가슴 운동 내부 튜브를 직접 시각화함으로써 삽관법을 확인합니다.
6. 실험실 공간의 오염을 방지하기 위해 가스 튜빙을 낭비 전환하여 유도 상자를 무시할. 2.0 권의 %로 증기를 조정합니다.

2. Thoracotomy

1. 왼쪽 midclavicular 라인의 피부 절개를합니다. 겨드랑이쪽으로 피하 조직을 해부 무딘. 주요 pectoralis 근육의 경계를 식별하고 마이너 P에서 해부 퉁명스러운ectoralis 근육 아래에. 오른쪽에있는 작은 pectoralis 근육을 당기세요. 당신은 흉곽의 직접적인 시야를 얻을 것입니다.
2. 식별 및 퉁명스럽게 포셉로 4 늑간 공간을 pentetrate. 집게의 끝을 자신이 작업 테이블에 부착된 고무 밴드를 조절하는 견인기를 삽입할 수 있도록 늑간 공간을 걸쳐 보자. 당신은 왼쪽 외이를 포함한 심장을 확연히 볼 수 있어야합니다. 이 액세스는 일반적으로 전기 응고의 필요없이 따라서 어떤 혈액의 손실없이 달성하고있다.

3. 마음의 준비

1. 부드럽게 마음을 손상없이 심장막라고 결론 지었다.
2. 좌심실의 앞부분은 벽에서 왼쪽 심방 외이를 리프팅하여 왼쪽 앞부분 내림차순 동맥 (내사)를 식별합니다. 내사는 흐린 테두리와 혈관에 비해 밝은 붉은 색으로 짧은 직선 코스를 통해 보여줄 것입니다.

4. 관상 동맥계측

1. U-모양으로 형성하여 테이퍼 바늘 끝에 8-0 prolene의 봉합을 준비합니다. 내사 아래 정도로 깊은 myocardium를 통해 바늘을 전달합니다.
2. 양쪽에서 봉합의 1 센티미터 가질 봉합의 바늘 끝을 잘라.
3. 모든 날카로운 모서리를 방지 occluder로서 1mm PE-10 튜브 부분을 잘라. . occluder는 알코올 desinfection에서 약물 사용 및 사용 주 전에 활용할 수 있도록 허용 : 튜브가 적절 ^네 그것 멸균을 위해 24 시간 동안 100 %의 에탄올에 몸을 담글 수 있습니다.
4. 실 봉합 모두 occluder로 끝납니다.
5. 두 봉합은 상단 늑간 공간이 만료 안내 크기 3 Kalt의 봉합 바늘을 사용합니다.

5. 가슴 폐쇄

1. 6-0 prolene 봉합사를 함께 열어 늑간 공간의 상위 및 하위 늑골을 묶어서. 당신이 가슴을 닫으 전에 5.2로 이동한다.
2. 열 몇 호흡주기 위해 폐가 Hyperinflate내쉬는 숨의 튜브를 클램핑하여 최대 무기폐. 이 책략은 또한 당신이 사용하는 환풍기의 종류에 달려 있습니다. 가슴이 닫힐 때까지 갯벌 볼륨을 300 μl로 설정합니다.
3. 환풍기 갯벌 볼륨 다시 200 μl로 설정합니다.
4. 그들 루프를 형성하도록 8-0 내사를 내고 봉합의 양쪽 끝을 묶어.
5. ECG를 첨부하십시오.
6. 8-0 루프에 가중치를 가져와 및 가중치 신중하게 걸어 보자. 당신은 몇 심장이 뛰는 내에 ST-해발 크게 나타납니다. . 무게 참고를 풀어 이러한 실험은 무게 5.5 g의 합계를 사용하지만 무게는 변형과 생쥐의 체중에 따라 다릅니다 수 있습니다.
7. 피하 주머니에 루프를 삽입하고 6-0 하나의 매듭이 봉합과 피부를 닫습니다.
8. 마우스가 온난 램프 아래 extubation 후에 복구하자.

6. 심근 국소 빈혈 및 Reperfusion

1. 적어도 5 일간의 복구 기간은 케타민, xylazine의 혼합물과 마취 유도 후그리고 아트로 핀 (4 ML ​​/ kg BW, 케타민 10 밀리그램 / ML, xylazine 2 밀리그램 / ML, 아트로 핀 0.06 밀리그램 / ML, ^1.
2. Intubate과 국소 빈혈 reperfusion 및 실험을위한 실내 공기 환기.
3. 가슴의 피부 봉합을 엽니다. 8-0 봉합사 루프를 준비합니다. ECG를 첨부하십시오.
4. 가중치를 소개 시켜줘들을 기다려 보자. 당신의 국소 빈혈 프로토콜을 따릅니다. ST-해발 ^2의 잠재적인 해산을위한 ECG를보세요.
5. 국소 빈혈의 끝부분에 가중치를 놓습니다. 피부를 닫고 마우스를 extubate하고 복구하자.

7. 최대 3 일이 Reperfusion 시간과 경색 크기 평가

1. 마취 및 원하는 reperfusion 시간의 끝에 마우스를 intubate.
2. xyphoid에 중간선의 가슴 피부를 잘라. 복부를 열고 갈빗대 아래의 다이어프램을 했네요. midclavicular 라인의 양쪽 열린 가슴을 잘라요.
3. 심장으로 탁 트인 액세스 권한을 얻으 봉합과 땅바닥에서 펄떡 거 렸어 흉부 앞쪽에 벽을 수정합니다.
4. 조심스럽게 8-0 봉합사 루프를 준비합니다. 루프를 잘라 그대 윗니와 아랫니가 맞물리다하는 매듭을 묶게.
5. 왼쪽 안마당 10% phthalo 파란색 주사. 심장 볼륨 과부하를 방지하기 위해 서서히 색깔을 만들어 매번 대기음을 주입.
6. 좌심방에 염화칼륨을 주입. 이것은 평등 경색 크기 평가서를 심장 확장의 마음을 체포합니다.
7. 마음을 절단 완화만큼 extracardial 조직을 최대한 남겨두고, 심장을 도려내.
8. 인산염 완충 용액의 마음을 씻는다.
9. 이소펜탄 및 액체 질소의 심장을 멈추고. 살짝 얼어 때까지 양자 택일로, 마음은 냉동실에 배치될 수 있습니다.
10. 1mm의 조각의 마음을 잘라요. 우리는 동등 조각 (그림 4)에서 심장을 잘라 면도날 만든 깔끔히 장치가되어 있습니다. 심장이 제대로 가슴의 긴 축에 직각를 잘라 정렬되어 있는지 확인하십시오.
11. 20 분 동안 37 ° C에서 1.5 % TTC의 조각 알을 품다. 어디 우리는 96도 접시를 사용하여각 슬라이스가 잘 하나에 집어넣습니다. 이것은 TTC을 저장하고 당신에게 유물을 방지하기 위해 워트 먼지 필터의 사용을 아끼지 않습니다.
12. 하룻밤 사이에 4 % 포름 알데히드와 조각을 고쳐. 이것은 조각 축소되지만 염료의 콘트라스트를 향상됩니다.
13. 현미경 슬라이드에 슬라이스 올려. 다른 슬라이드와 커버. 슬라이드의 각 끝부분에 1mm 금속 스페이서를 사용하여 종이 클립과 함께 슬라이드를 누르고 있습니다.
14. 각 슬라이스의 양면에서 디지털 이미지를 가져가라. 항상 동일한 설정을 사용하여 작은 조각을위한 확대하지 않습니다.
15. planimetry을위한 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 NIH에 의해 ImageJ를 사용합니다. 항상 infarcted 영역에 대해 동일한 기준을 사용하여, 예를 들어서만 흰색 영역은 infarcted됩니다. 분홍빛이 도는 흰색 영역은 infarcted되지 않습니다. 우리는뿐만 아니라 개입과 planimetry위한 수사관들의 눈을 멀게했다.

8. 조직학의 대체 심장 준비

1. 7.2 단계 7.1을 따릅니다. 과 8.2로 진행합니다. TTC의 염색법과 신뢰성 경색 평가는 7 ~ 할 수reperfusion 인해 반흔 수축 2 시간.
2. 어떤 extracardial 티슈를 준비하고 대동맥 루트를 덮고 thymus 해부 무딘.
3. 집게와 함께 오름차순 대동맥을 잡고 가능 한한 적은 extracardiac 조직으로 심장을 잘라.
4. 씻고 cardioplegic 솔루션에 부드럽게 심장을 조인다.
5. cardioplegic 솔루션으로 가득 p35 그릇에 마음을 놓으십시오.
6. 오름차순 대동맥을 준비합니다.
7. 포름 알데히드와 prefilled되는 정맥으로 오름차순 대동맥을 Cannulate. 우리는 아연 포르말린 정착액 및 24 G IV 라인 ³ 사용합니다.
8. 왼쪽 이상부과 좌심방 사이에 구멍을 잘라 버릴거야.
9. 그것에 연결된 16cm 긴 튜브로 좌심방에 26 G 카테터를 삽입합니다. 당신은 또한 PE50 튜브를 사용할 수 있습니다.
10. 포르말린 정착액과 십분 마음을 Perfuse.
11. 7 ° C.에 24 시간 최대를위한 정착액 가득한 튜브로 마음을 놓으십시오
12. 준비를 계속조직학 / immunohistochemistry를위한 aration.

9. 대표 결과

만성 관상 동맥 내고 여러 함정과 복잡한 기술입니다. 그러나 일단 그 문이 매우 낮은 사망률 속도와 신뢰성이 높은 결과를 수행할 수 장악하고 있습니다. 생쥐와 심장에 대한 접근의 최적 위치는 내사를 성공적으로 식별 및 계측을위한 열쇠입니다. 결합의 위치가 분명하므로 표준 내고 사이트를 가지고 요구, 경색의 크기에 영향을 미칠 것입니다. septal 가지가 영향을받는 경우에도이 번들 지점 블록 대신 ST 상승으로 이어질 수 있습니다. epimyocardial 정맥이나 뇌실에서 출혈, 내고 너무 깊이 경우가 발생할 수 있으며, 출혈이 과도한 경우 생쥐는 제외한다. Pericard은 가능한 한 완전히 제거하여야한다. pericard을 남겨 내고위한 myocard로 바늘을 밀어 악화됩니다. 또한, 그것은 결국, 심낭염의 원인이됩니다adhesions를 유도하고 histological 시험에 지장이 많답니다. PE-occluder는 myocard에 충격을 최소화하기 위해 모든 날카로운 모서리없이 최대한 짧게해야합니다. 폐의 Hyperinflation은 가슴 폐쇄 후 장력 pneumothorax을 방지하기 위해 절대적으로 중요합니다. 가슴 배수 필요는 없습니다. 긴장을 끄는 것은 통제하기가 어렵습 때문에 봉합 종료를 당겨 열어 가슴의 결합의 정확한 위치의 테스트는 생략한다. 내사의 계측이 실패하면이 myocardium에 외상과 부종을 추가할 것이기 때문에, 더 이상 시도는 피해야한다.

신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해, 프로토콜 매개 변수의 표준화가 있어야합니다. 따라서, 마우스는 intubated 및 실내 공기와 체온이 밀접하게 피드백 시스템으로 제어됩니다들과 통풍이 있습니다. 매달려 도르래의 사용은 이미 강조되었습니다. 기타 당기는 장치는 장력 손실 및 비 표준화된 당기는 긴장 단점이 있습니다. 허혈성reperfusion 및 폐색의 여러 사이클과 사전 및 postconditioning 프로토콜은 더 쉽게 그들은 단지 해제해야하고 (그림 1) 달아 보자 때문에 가중치를 교수형으로 수행됩니다.

경색 영역 (흰색)는 위험 (빨간색)과 위험 (파란색) (그림 2A-B)에서 이외의 지역에서 지역을 구별해야합니다. 경색 크기는 국소 빈혈의 기간에 따라 달라집니다. Reperfusion 시간은 성공적인 TTC의 염색법 (그림 1 및 2)를 허용하려면 최소 2 시간이어야합니다. 가장 중요한 것은 시토킨 RNA 표현은 심근 경색을 (그림 3A-C)에 받았습니다 동물에 비해 국소 빈혈과 reperfusion 제외한 모든 수술 절차를 가지고 허위 조작 동물로 낮습니다.

그림 1. 위험 (IS / AAR의 %)에서 면적의 비율로 크기를 경색. 마우스는 1 다음에 30 분 국소 빈혈을 받았습니다reperfusion 20 분 (I / R, N = 10). IPC : 허혈성 postconditioning, 쥐가 reperfusion / 폐색 20 초 각각의 3주기에 이어 국소 빈혈 30 분 받았습니다 (N = 6 * P에게 <0.05를 나타냅니다.)

그림 2A. 대표 TTC 묻은 ​​심장 슬라이스. 화이트 : 레드 경색 지역 : 지역 위험, 파란색 : 비 occluded 공간이 있습니다.

그림 2B. infarcted (흰색) 영역의 대표 슬라이스. 꼭대기로 좌심실 주변의 원뿔 모양으로 인해, epimyocard는 평면 영역으로 나타나며 planimetric 측정 (블루 / 핑크 외부 영역)에 대해 고려하지 않아야합니다. 레드 = TTC가 가능한 myocard을 묻다.

그림 3A. 내 안에 아니 상당한 차이30 분 국소 빈혈 120 분 reperfusion 후 ocardial TNF-α의 mRNA 발현. N 그룹 당 = 4-6.

그림 3B. 심근 IL-1β mRNA 발현 30 분 국소 빈혈 120 분 reperfusion (I / R) 후. 더 중대한 통제 사이의 차이 (어떤 수술)과 그룹 (노 국소 빈혈 / reperfusion) 가짜로 작동은 없습니다. n은 그룹 당 = 4-6, *는 P에게 <0.05를 나타냅니다.

그림 3C. 심근 IL-6 30 분 국소 빈혈 후 mRNA 발현 120 분 reperfusion (I / R). 더 중대한 통제 사이의 차이 (어떤 수술)과 그룹 (노 국소 빈혈 / reperfusion) 가짜로 작동은 없습니다. n은 그룹 당 = 4-6, *는 P에게 <0.05를 나타냅니다.

그림 4A-C. 옳소하진 장치를 절단. : 절단 위치에 면도날로 마감했다. B : 오픈, 옆으로 볼 수 있습니다. C : 개방, 앞에 볼 수 있습니다. 마음은 면도날 (화살표)에 긴 축 직각으로 흰색 플라스틱 침대 홈에 정렬됩니다.

토론

우리는 왼쪽 측면 늑간 thoracotomy를 통해 마음을 액세스하고 왼쪽 midclavicular 라인의 가슴에 그 소년의 봉합을 선도하여 murine 폐쇄 가슴 모델을 수정했습니다. 뼈다귀 흉곽을 그대로두면, 외상을 최소화하므로 진통제, 외과 사이트 감염에 필요한, ​​회복을 촉진합니다. 왼쪽 내부 포유류 동맥을 보존함으로써 electrocautery에 대한 필요가 없습니다. 우리는 나중에 쉽게 액세스할 수 피하 조직의 봉합...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
증기	Drägerwerk AG	Isoflo
현미경	Leica	M80
광원	SCHOTT	KL 1500 액정
Homeothermic 담요 제어 유닛	하버드 장치
MiniVent 유형 845	휴고 삭스 Elektronik
8-0 Prolene	Ethicon	BV130-5 6.5mm 3/8c
6-0 Prolene	Ethicon	BV-1 9.3 mm 3/8c
Kalt의 봉합 바늘의 크기 3	FST	12050-03
Triphenyltetrazolium	시그마 알드리치	93,145
Phthalo 블루	Heucotech (주)
PowerLab	ADInstruments