루게릭병에 대한 마우스 모델 (ALS)의 임상 시험 및 척수 제거

요약

루게릭병 (ALS)에 대한 마우스 모델은 임상 및 behaviorally 면밀히 검토합니다. 동반 immunohistological 분석을위한 전제 조건으로서 척수의 준비가 상세하게 그려져 있습니다.

초록

루게릭병 (ALS)은 motoneurons의 진보적인 퇴보로 인한 치명적인 neurodegenerative 무질서이다. 발병의 피크는 산발적 질환과 가족성 질환 50 년 주위 육십년 주변입니다. 그 진보 과정으로 인해 환자의 50 %가 증상 발병 후 30 개월 이내에 죽어. 이 질병에 대한 새로운 치료 옵션을 평가하기 위해, ALS의 유전적 마우스 모델 같은 SOD1 (G93A) 돌연변이와 같은 잔디 유전자의 돌연변이 인간 가족을 바탕으로 생성되었습니다. 모델 평가해야 할 가장 중요한 측면은 전반적인 생존, 임상 과정과 운동 기능입니다. 여기서 우리가 임상 평가를 보여주는 두 개의 행동 모터 테스트 전도가 표시되고 모든 매개 변수에 대한 양적 채점 시스템을 제공합니다. ALS 마우스 모델의 심층적인 분석은 일반적으로 척수의 immunohistochemical 시험을 필요로하기 때문에, 우리는 어떻게 적용 자세하게 그 준비를 입증rsal laminectomy 방법. 모범 histological 연구 결과는 증명하고 있습니다. ALS의 마우스 모델에 관한 연구에 묘사된 시험 방법의 포괄적인 응용 프로그램은 연구자들이 안정적으로 나중에 인간 임상 실험을위한 기초를 제공할 수있는 미래의 치료 옵션을 테스트할 수 있도록합니다.

프로토콜

동물 잭슨 연구실 (# 002726) ^1에서 구입했다. 그들은 임상 점수와 모터 기능 (rotarod 시험)과 근력 (선 검사를 교수형)의 테스트를 받게됩니다. 이 모든 테스트 및 동물 나중에 살해 척수를 준비하기 위하여는 동물 실험의 적절한 행위에 대해 현지 가이드와 매우 가까이에 따라서 수행되었습니다.

1. 임상 점수

이외에도 체중 마우스에 대한 평가에서는 다음 4 포인트 채점 방식 ² 모터 적자의 흔적을 검사하고 있습니다 :

4 점 : 정상 (모터 기능 장애의 흔적)

3 점 : 꼬리로 정지했을 때 뒷다리 사지 떨림이 분명 있습니다

2 점 : 걸음걸이의 이상이 흐릅니다

1 포인트 : 최소 하나의 뒷다리로 드래그

0 점 : 대칭마비 자체가 오른쪽으로 무능력 또는 최대 체중의 20 %의 손실,이 경우 동물이 즉시 euthanized하고 실험이 종료된

2. 운동 기능의 테스트 및 근력

철사를 교수형에 처하는

이번 테스트는 근력 ^{3, 4를} 평가하는 데 사용됩니다. 모든 동물은 적어도 하루나 이틀 rotarod 테스트 후이 테스트를 수행합니다. 각 마우스가 0.8 cm의 간격으로 맞춤 와이어 뚜껑에 위치하고 조심스럽게 뒤집어졌다되며, 지푸라기 위에 60cm가 바닥을 커버. 적어도 180의 세 가지 연속 번 훈련하면 빠질 수있는 대기 시간이 측정됩니다. 각 마우스는 180 s의 최대 및 긴 기간이 녹화되는 동안 거꾸로 뚜껑을 보관하는 방법은 세 시도까지 주어집니다.

Rotarod 테스트

rotarod 장치는 (우고 Basile, Comerio, 이탈리아) 모터 조정, 균형과 운동 능력을 ^{3, 4 학습을} 측정하는 데 사용되었다. 좋은 성능 sensorimotor 조정의 높은 수준을 필요로합니다. 기계는 시험 동물에 대한 distractive 자극을 피하기 위해 조용하고 비 교란 환경에 배치해야합니다. 그것은 다섯 쥐를위한 컴퓨터 제어 모터 구동 회전 스핀들 다섯 골목길로 구성되어 있습니다. 생쥐의 폭포는 하단에있는 플라스틱 접시에 압력에 의해 자동으로 감지됩니다. 15 RPM 짐승이 회전 막대에 남아있을 수있는 시간을 일정한 속도로 적어도 180의 세 가지 연속 시간에 대한 교육이 측정되면. 각 동물은 전도가 기록됩니다없이 3 시련과 긴 대기 시간을 거쳐. 모터 조정에 큰 차이의 대부분이 기간에 감지되기​​ 때문에 180 s의 시간은 컷 - 오프 시간으로 선택됩니다.

3. 척수 준비

1. 동물 지방 지침에 따라 CO ₂ insufflation에 의해 살해되는 즉시 4 % paraformaldehyde 용액 다음 PBS 용액으로 transcardially perfused있다.
2. 희생 마우스의 척수를 준비하기 위해서는 마우스의 뒷면을 폭로하기 위해 동물들은 작업 테이블에 배치되고 사지가 측면에 고정되어 있습니다.
3. 70 % 에탄올 용액과 짧은 세차는 절개의 사이트를 청소하고 헤어 코트를 flattens.
4. 그러면 피부가 중간 라인에 날카로운 메스로 베인있다. 피부가 양쪽으로 뻗어있다 절단 촉진하기 위해서. 다리 근육이 준비되어야한다면, 그들의 피부도 베인되어야한다.
5. 피부 절개가 완료되면, 그것은 신체의 기본 천박한 근막을 노출하기위한 족집게 한 켤레로 떨어지게된다.
6. 목과 nuchal 인대의 근육은 CA를 제거해야하고 있습니다refully 준비했습니다. 깊이 및 장애 척수 절개하지 않도록주의하십시오. 어깨 근육은 또한 더 나은 척추 칼럼을 폭로하기 위해 제거할 수 있습니다.
7. 그런 다음 paravertebral 근육은 전체 척추 칼럼에서 제거됩니다.
8. 척추 열의 여러 laminectomies가 수행되어야 할 여는 위해서. 하나는 atlanto - 후두 관절의 사이트에서 상부 두개 부분부터 시작합니다.
9. 그것은 상단이 사지의 고정을 제거하고 첫 번째 척추의 laminectomy를 수행할 수 있도록 더 목을 overstretch하는 것이 가장 쉽습니다. 이러한 노출된 자궁 경부 척수를 건드리지 않고 끌려나됩니다.
10. 더 많은 척추 먼저 직각 가위로 양쪽에서 척추 아치를 끊어 버렸네 후 지느러미 프로세스에 당기에 의해 제거됩니다. 척추의 나머지 측면 부분 척수 이후 완전한 제거를 촉진하기 위하여 제거되어야한다.
11. 요추 spina의 해부 랜드마크내 코드는 또한 자궁 경부 척수에 존재 부풀어 오름이다.
12. 전체 척수의 laminectomy을 완료하는 것이, 당신은 또한 복부 뿌리를 가로로 쪼개다과 meninges의 경질의 mater에서 척수를 풀어 있는지 확인합니다.
13. 그러면 경추 척수는 cranially 끝내 척수를 제거하기 시작합니다.
14. 마지막으로 척수도 완전히 공개하기 말초 cauda equina-에서 절단한다.
15. 궁극적으로, 척수는 하룻밤 만에 postfixating 솔루션 (예 : 4 % paraformaldehyde)에 위치하고 있으며 추가로 처리할 수 있습니다. 우리는 보통 immunohistological 분석을 위해 준비하는 척수를 cryosection.

4. 대표 결과

척수 준비의 기술이 비디오 기사의 초점을 나타냅니다. 그것은 나중에 조직 sectioning 및 궁극적으로 spina의 immunohistological 분석을 위해 필수적인 전제 조건이다내가 코드 섹션. 최종 결과의 예를 들어, wildtype의 마우스 요추 척수 (wt)의 앞부분은 호른 지역과 잔디 G93A transgene (TG)의 immunohistochemical 검사 결과는 마우스가 시연된다. 모터 뉴런은 기본 백신 채팅 항체와 이차 항체 Cy3와 후속 형광 라벨로 확인할 수 있습니다. 또한, DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)과 핵 반대 얼룩은 (그림 1) 수행되었습니다.

그림 1. 안티 채팅 항체 (적색)과 wildtype (wt)의 마우스 요추 척수 앞부분 호른 (왼쪽)과의 DAPI (파란색)에 의한 세포의 핵 반대 얼룩과 motoneurons의 면역을 시각화 형광등 photomicrographs 잔디 G93A 형질 전환 (TG) (오른쪽) 1백30일의 나이에 마우스. 스케일 바 : 40 μm의.

의 immunohistochemical 분석으로잔디 G93A 마우스는 본 문서의 주 범위 아닌 이러한 유전자 변형 생쥐가 특성화되어있는 원래의 게시 및 추가 참고 ^{1, 5, 6에서} 치료 접근법을 공부 더 최근의 것들을 참조하시기 바랍니다. 치료 효과는 명확하게 정의된 immunohistological 수준에 차별한다면 양적 평가 알고리즘 stereological 소프트웨어 (예를 들어 ⁷ 참조)에서 지원 적용되어야합니다.

토론

SOD1 (G93A) 유전자 마우스 모델은 인간 루게릭병 ⁸ 비교 진보 motoneuron 손실의 질병 과정을 연구하는 귀중한 동물 모델입니다. 다른 치료 패러다임의 다양한는이 모델로 평가하고 나중에 인간 임상 연구 ^8-10에서 테스트하기위한 기초를 대표하고있다. 이러한 생쥐의 실험적 치료 연구에 큰 차이를 감지할 수있게하기 위해서는 최소 24 쓰레기 - 검색된 성별 균형 동일한 유전적 배경 생?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
	제조	주문 정보
행동 검사
마우스를위한 로타로드	우고 Basile, Comerio, 이탈리아	# 47600
와이어 장치를 교수형에 처하는	맞춤 양복
척수 준비
작업 테이블 작동 램프 보호 장갑
측면에 직각 '아이리스'가위,	파인 과학 도구, 하이 델베르크, 독일	14063-09
Cohan-Vannas 봄 가위, 스트레이트	파인 과학 도구, 하이 델베르크, 독일	15000-10
마이크로 포셉	해머커, Solingen, 독일	HWC 111-10
메스 "präzisa 플러스"	Dahlhausen, 쾰른, 독일	11.000.00.510, 무화과 10