로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

요약

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

초록

상피 및 내피 세포 (EC)는 외부 및 내부 환경에서 조직을 보호 paracellular 장벽을 구축하고있다. EC의 구성하는 혈액 - 뇌 장벽 (BBB), astrocyte 최종 피트, pericytes 및 기초 멤브레인은 뇌 실질의 보호와 항상성에 대한 책임을지고 있습니다. 체외 BBB 모델에서 BBB의 구조와 기능을 공부하는 일반적인 도구가 세포 수준에서. 체외 BBB 모델에서 다른의 상당한 숫자는 지금까지 다른 실험실에서 연구에 설립되었습니다. 일반적으로 세포는 소, 돼지, 쥐 또는 마우스 뇌 조직 (빌헬름 외하여 검토 상세하게 설명 ^1.)에서 얻을 수 있습니다. 인간 조직 샘플은 실험실 또는 기업 ^2,3의 제한된 숫자 만 사용할 수 있습니다. 기본 셀 준비가 시간이 많이 걸릴 수 있으며 EC의 문화가 일괄 배치로 다를 수 있지만,의 설립은 EC 린에게 불후의에스 과학 관심의 초점이다.

여기, 우리는 신생아 마우스 뇌에서 불후의 두뇌 microvascular EC 라인을 수립하는 방법을 제시한다. 우리는 시약 및 솔루션에 사용 된 절차의 단계별 정보를 설명합니다. 우리 연구소에 의해 설립 방법에 4 내지 5 주 내에 균일 한 불후의 내피 세포 라인의 절연을 할 수 있습니다. 뇌 microvascular 내피 세포 라인 cEND ⁴ 칭했다 (대뇌 피질에서)와 ⁵ (소뇌 피질에서) cerebEND, 포스터의 실험실에서이 절차에 따라 격리 된 효과적으로 BBB의 다양한 생리 학적 및 병리학 과정의 설명에 사용되었습니다. cEND 및 cerebEND를 사용하여 이러한 세포가 글루코 코르티코이드 - ^4,6-9에 응답하고 같은 TNFalpha ^5,8 등 프로 선동적인 질문입니다 중재자에뿐만 아니라 에스트로겐 치료 ^{10 명} 보여주고 있습니다. 또한, 우리는 여러 SC의 병리학을 공부했습니다lerosis ¹¹ EC 수준에서 hypoxia ^12,13. cEND 및 cerebEND 라인 림프구 나 암 세포와 EC의 다른 자극 또는 상호 작용에 ECS의 BBB, 세포 응답의 구조와 기능을 공부하기에 좋은 도구로 간주 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 뇌 Microvessels의 절연

1. 각 준비 중 여성의 5-10 신생아 마우스 (3-5일 이전)을 사용합니다.
2. 지역 IACUC / 수의사 추천에 따라 마우스를 안락사시켜야 즉시 뇌를 제거하고 다음과 같은 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 전송 : 15 밀리미터 Hepes (산도 7.4), 153 MM NaCl, 5.6 MM KCl, 2.3 MM CaCl ₂ X 2H ₂ O, 2.6 MM MgCl ₂ X 6H ₂ O, 1 % (w / V) BSA (이하와 같은 A를 버퍼링 참조).
3. 특별히 명시하지 않는 한, 모든 절연 절차는 층류의 후드 아래에 실내 온도 (RT) (22-24 ° C)에서 수행해야합니다. 버퍼에, meninges 및 모세관 조각을 제거 후, ​​머리를 (소뇌와 뇌간이없는 꿈) 잘라 멸균 메스를 사용하여. 조직가 조각 피펫 아래로 더 clumps가 나타나지 때까지 10 ML의 피펫을 사용합니다. RT에서 5 분 250 XG에서 50 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 정지 전송합니다.

참고 : Meninges는 뇌 세포의 표면에 얇은 투명 멤브레인으로 식별 할 수 있습니다. 그들은 조심스럽게 무균 집게로 제거 할 수 있습니다.

4. 표면에 뜨는 폐기하십시오.
5. 4.5 ML 버퍼에있는 펠릿을 분해 0.75 %의 1.5 ML (w / V)와 collagenase / dispase (로슈)와 37 번 45 분 ° 물 욕조에서 C (가끔 흔들어)에 품다.
6. 한편, 콜라겐 IV (0.1 밀리그램 / 50 MM 아세트산에 용해 ML)로 코팅 네 우물을하여 12 잘 접시를 준비합니다. 1 시간에 준수 할 수 있습니다.
7. 15 ML 얼음처럼 차가운 버퍼 A. Resuspend 철저하게 펠릿의 추가하여 소화를 중지합니다.
8. RT에서 10 분 250 XG에서 정지 원심 분리기.
9. 표면에 뜨는 폐기하십시오.
10. myelin을 제거하려면, 4 ° C.에 20 분 1,000 XG에서 10 ML 25% (w / V) BSA (시그마, 순도> 98%)와 원심 분리기를 추가 25 % BSA는 1X PBS (PAA Laboratories의)에 용해 및 0.2 μm의 F를 통해 필터링해야합니다ilter).
11. 표면에 뜨는을주의 깊게을 삭제, 10 ML 버퍼에있는 펠릿을 분해하고 새로운 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다.
12. RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. 그 결과 펠렛은 내피 세포가 포함되어 있습니다.
13. PBS로 두 번 콜라겐 IV-코팅 12도 판을 씻으십시오.
14. 이 우물, 각도 2 ML에 4 성장 매체의 ML (DMEM 10 % FCS, 50U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민을 포함)와 플레이트 세포 현탁액에서 펠렛을 Resuspend. 37 번 45 분 4 μg / ML 및 배양의 최종 농도 ° 세포 문화 인큐베이터에서 C로 puromycin을 추가합니다. 이 단계는 급속하게 준수 세포의 제거를 할 수 있습니다. 참고 : Puromycin는 24 시간에 추가됩니다. 만 뇌 ECS는 다른 세포 유형에 puromycin ¹⁴ 독성이며,이를 흡수 할 수 있습니다.
15. 이 새로운 우물 (이 우물은 EC 분획을 포함)에 단계 1.14에서 비 준수 세포를 포함하는 2 ML 매체를 전송합니다. STE의 준수 세포로 우물을 작성P 2 ML 신선한 매체 (이 우물은 다른 세포 유형, 예를 들어 섬유 아세포, astrocytes을 포함하고 병렬로 성장하고 형태의 비교에 사용할 수 있습니다)에 1.14.
16. 다음 날 매체를 변경합니다.

2. 브레인 Microvascular 내피 세포를 Immortalizing

1. GP + E-86 네오 (GPENeo) ¹⁵ 섬유 아세포, 분비 10% 열 inactivated FCS, 50U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 MG / ML G418을 (포함 DMEM 매체에 polyoma 중 T의 종양 유전자와 복제 - 결함 바이러스를 배양 . 젤라틴 코팅 플라스크에 PAA Laboratories의) 참고 : Polyoma 중 T의 종양 유전자의 transfection은 4~6주 문화의 내피 형태로 세포의 동질적인 monolayer로 이어지는 비 ECS를 통해 ECS의 성장 우위가 발생합니다. GPENeo가 상업적으로 사용할 수 없으며 (원본 출판물에 ^4,16을 참조하시기 바랍니다) 공유 공공 소재로 얻을 수 있습니다.
2. 에 대한 바이러스 함유 미디어를 사용하려면 불멸화, 24 H에 G418 무료 매체에 GPENeo 세포를 배양.
3. GPEneo 표면에 뜨는 10 ML을 제거 및 8 μg / ML의 최종 농도에 Polybrene (hexadimethrine 브롬화) (시그마)를 추가, 세포 파편을 제거하는 필터 0.45 μm을 통해 소독.
4. 1 부에서 준비 EC 문화에서 성장 매체를 제거하고 우​​물에 GPEneo 표면에 뜨는 / Polybrene 혼합물의 2 ML를 추가합니다. 신선한 GPEneo Polybrene / 표면에 뜨는 혼합물을 사용하여 다음 날을 반복 참고 :. Polybrene는 바이러스 입자)으로 감염을 촉진하기 셀 벽에 구멍을하는 데 사용됩니다.
5. GPEneo 표면에 뜨는 / Polybrene 혼합에게 다음 날 제거 PBS로 두 번 세포를 씻고 그것에게 매 3 일마다 변경의 성장 매체에있는 세포를 유지하고 있습니다. 합류 후, 콜라겐 IV - 코팅 접시에 세포에게 1시 2분을 분할.
6. 일반적으로, 안정적 뇌성 내피 (cEND) 셀 라인 4~5주 나중에 취득해야합니다.

E "> 3. 뇌 Microvascular 내피 세포 육성

1. 10 ML 미리 예열 매체 15 ML-팔콘의 물을 욕조 및 전송에 cryoaliquot에서 세포를 해동.
2. RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기.
3. 매체를 제거합니다 (도금에 대한 세포 밀도가 적어도 1 회 10 ⁴ 셀 / ML이어야 함) 사전 예열 성장 매체와 콜라겐 IV 코팅 T _25cm ² 세포 배양 플라스크에서 펠렛을 전송합니다.
4. 다음 날 매체를 변경하고 세포가 합류에 도달 한 후 (보통 후 5 일) 셀을 분할.

4. cEND - 세포의 분리 (참고 : 분할 만 일주일에 한 번씩 수행 할 경우, 1시 4분보다 높은 분리하지 마십시오).

1. , 중간을 제거 PBS로 세포를 씻어.
2. 37 품다 따뜻한 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 (PAA Laboratories의) (T _75cm ² 플라스크), 3 ML을 추가 ° C 및 셀 레이어가 (보통 5-15 분 이내) 분산 될 때까지 기다리십시오.
3. 5 ML O를 추가합니다F 성장 매체는 최대 피펫 아래로, 그리고 IV-코팅 플라스크 새로운 콜라겐으로 전송됩니다.

5. cEND - 세포의 동결

1. 4 단계에서 설명 된대로 세포 현탁액을 확보
2. RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기.
3. 6 ML 냉동 매체 (95 % 성장 매체, 5 % DMSO)에 세포 펠릿 (1 T _75cm ² 플라스크로부터 얻은) Resuspend.
4. . 한 cryo-나누어지는이 T _25cm ² 플라스크에 놓는 할 수 있습니다 : 네 개의 1.5 ML cryo-aliquots 참고로 세포 현탁액을 나눈다.
5. 액체 질소 증기 온도에서 cryo-aliquots를 저장합니다.

450 ML DMEM, 10 % FCS, 10 ML L-글루타민, 2% 가상 - 키트, 2퍼센트 NEAA, 10 ML의 나트륨의 pyruvate, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 : 성장 매체를 cEND

6. 대표 결과

cEND 및 cerebEND 세포가 내피의 immunostainings을 특징으로 한차 BBB는 transendothelial 전기 저항 (티에르)와 투자율의 측정에 의해뿐만 아니라 마커. cEND과 cerebEND이 합류에서 성장 억제를 전시 단단히 포장 길쭉한 세포 monolayers과 뇌 ECS의 주요 문화와 비슷한 형태했다. 세포는 immunofluorescence (그림 3) ^4,5으로 표시된 셀 셀 접합에서 지역화 된 claudin-5, occludin 및 VE-cadherin 단백질 잘 감지 레벨을 표명했다. 혈청 - 감소 미디어에서 배양의 cEND 전지는 티에르의 증가 (Ωcm ² 150 2퍼센트 혈청의 존재 500 Ωcm ² 혈청 10 %의 존재에서) 하이드로 코티손의 추가에 의해 potentiated되었습니다 (800 Ωcm으로 이어 ²⁾ 혹은 인슐린 (1,000 Ωcm ^{2) 4.} 21일에 대한 혈청 - 할인 매체에 배양 cEND의 Monolayers이있어서 900 Ωcm ² (그림 4)의 티에르. 티에르는 어셈블리를 사용하여 측정되었다포함하는 전류 전달 및 전압 측정 전극 (세계 정밀 계측기). 비교를 들어, 1 차 microvascular 뇌 ECS는 Ωcm ^2, 상업적으로 이용 가능한 마우스 세포주 bEnd.3는 스님 2005 년과 토스 동부 표준시를 참조 최근 검토 100-140 Ωcm ² (중 티에르 값을 가지고 200-600의 티에르 값을 가지고보고되었습니다 알., 2011 년 ^17,18). 또한, 4 시간 이상 같은 비 충전 분자 질량 4, 10, 70, 500 kDa의 FITC-dextrans, 또는 2퍼센트 FCS 차별화 매체에 cEND의 monolayer에서 fluorescein (300 다)와 같은 고분자의 통로가 감소되었다 10% FCS를 포함하는 성장 매체에 유지 관리 전지와 비교 : paracellular 플럭스는 FITC-dextrans 10 70 kDa에 26%까지 fluorescein의 제어 세포의 30 %로 축소되었고, 플럭스는 FITC에 대한 제어 세포의 4.5 %로 감소되었다 - dextrtan 500 kDa. 값을 티에르와 마찬가지로 투자율은 gluc의 면전에서 배양 세포에서 낮은 수준에 있었어요ocorticoids (GC) ^4. 더 연구에서, 우리는 글루코 코르티코이드 대상 유전자, occludin, claudin-5 및 뇌 혈관 내피 ^4,7,9에서 VE-cadherin을 확인. GC 치료는 이러한 단백질의 표현의 증가와 세포 골격에 대한 VE-cadherin의 다시 정리하기로 하였다. 꼭 접합 단백질 occludin과 claudin-5의 직접 GC로 인한 규정은 발기인 지역 ^4,7,19에서 GC 응답 요소를 통해 나타납니다. 또한, claudin-5는 혈관 내피 ¹⁰ 소설 에스트로겐 대상으로 확인되었다.

내피 부전 underlies 여러 가지 질병을. 우리는 산소 / 포도당 박탈 (OGD) 조건 하에서 cEND을 배양. OGD는 GC와 proteasome 억제제를 bortezomib ¹² 결합 치료 후 재구성 할 수있는 BBB 기능의 중단에되었다. OGD 조건은 포도당 통풍 관에서 강한 인상을 이끌어 포도당 transpor의 표현에MK801, NMDA 수용체 - ¹³ 비 경쟁적 억제제를 추가로 감소 될 수 cerebEND의 감마선.

1 그림. 뇌 microvascular 내피 세포 (cEND) 절연을 차례로 일주일 정도. 가벼운 현미경 사진의 형태는 6x (A)와 15x (B) 확대에 따라 촬영 된 것입니다. 내피 세포의 섬 형성 식민지가 표시됩니다.

그림 2. 절연 및 불멸화 후 뇌 microvascular 내피 세포 (cEND)의 형태 일개월. 가벼운 현미경 사진은 15x 배율에서 촬영 된 것입니다. 합류, 동질적인 내피 세포 monolayer를 볼 수 있습니다.

그림 3. 불후의 뇌 microvasculAR 내피 세포 특급 claudin-5, occludin 및 VE-cadherin. CEND 세포는 콜라겐 IV-코팅 coverslips에 성장과 claudin-5에 대한 항체 (A), occludin (B)와 VE-cadherin (C) 물들되었습니다. 이미지는 40x 확대에 따라 Zeiss Axioscop2 현미경을 사용하여 촬영 된 것입니다.

4 그림. cEND monolayer. CEND의 transendothelial 전기 저항 측정 (티에르)는 콜라겐 IV-코팅 transwell 필터 (기공 크기 0.4 μm)에서 성장했다. 합류에 도달 한 후 셀 2% FCS를 포함하는 매체에 유지되었다. 티에르는 전류 전달 및 전압 측정 전극을 포함하는 어셈블리를 사용하여 7, 14, 21 일 후에 측정되었다.

토론

설명 절차는 혈관 내피 기능의 특정 변경 사항을 공부하고 다른 마우스 종자에서뿐만 아니라 다른 똑 아웃 마우스 종자에서 ECS microvascular의 분리에 사용될 수 있습니다. 불멸화의 방법으로 우리는 손쥐 polyomavirus, Polyoma 중간 T 항원의 oncoprotein과 변환을 사용했습니다. 이 생체과 체외 ^20,21,22에 빠르게 미숙 한 내피 세포를 변환합니다. 문학에 설명 된 ECS의 불멸화의 다른 방법은 예를 들어 SV40 대형 유인원 Vacuolating 바이러스의 T 항원 40 ²³ 아데노 바이러스 유전자 산물 E1A ²⁴ 또는 인간의 telomerase ³ 촉매 subunit의 overexpression와 불멸화가 포함되어 있습니다. PymT있는 불멸화는 짧은 시간에 신생아 쥐에서 동질 EC 문화를 취득 할 수 있습니다 손쥐 미숙 한 ECS, 대한 구체적인 있습니다. 불멸화는 세포와 일의 속성을 변경불후의 세포 라인으로 얻은 전자 결과는 기본 셀이나 마우스와 생체 내 실험과 중 비교해야합니다. PymT 불후의 EC는 urokinase 형 plasminogen 활성화의 증가 생산으로 인한 fibrinolytic 활동의 높은 수준을 표현하는 설명과 plasminogen 활성 억제제 ²⁵ 생산을 감소되었습니다. PymT의 직접 비교 체외 BBB 모델에 모두 잘 T 세포 부착 연구 ^26에 적합 것으로 밝혀 기본으로 bEND5 세포주 ECS을 불후의.

설명 절차에 따라 설립 셀 라인 세포가 노화하는 동안 이러한 속성을 잃게로, BBB 및 EC junctional 단백질의 높은 표현으로 장벽 속성을 유지하기 위해 낮은 통로 번호 사용할 수 있습니다. 따라서 장벽 특성의 손실 후, 새로운 세포 라인의 준비가 고려되어야한다. 셀 도금 밀도는이 세포 증식에​​ 중요하므로, ECS 높은해야합니다. 이것은뿐만 아니라 불후의 ECS의 유지와 격리 절차를 수행하는 동안 고려되어야합니다. 각각의 새 셀 라인은 그 장벽 속성 및 다른 세포 유형 가능한 오염 물질에 대한 테스트해야합니다. EC의 monolayers는 oligodendrocytes, astrocytes 및 pericytes ^4,27으로 오염을 제외 할 기본 항체와 같은 안티 galactocerebroside, 안티 glial fibrillary 산성 단백질과 항 평활근 항원 물들 할 수 있습니다. meningal의 vasculature에 의해 오염을 배제하기 위해 thrombomodulin의 표현은 뇌 ^28를 제외한 모든 혈관 침대로 표현되는, 테스트 할 수 있습니다.

흥미롭게도, 다른 뇌 영역에서 격리 불후의 microvascular 내피 세포 라인 프로 염증성 자극에 자신의 장벽 속성과 민감도에 차이가 있습니다. 예를 들어, 뇌성 cEND과 소뇌 cerebEND 셀 라인 ^4,5 언급 할 수 있습니다. CerebEND는 비교에서 보여주요 긴밀한 연결 구성 요소 claudin-1과 occludin의 낮은 표현 수준을 cEND합니다. 그러나, claudin-3 -12의 수준 cerebEND의 상위 있었다. cerebEND 세포의 장벽 기능은 cEND 세포의 장벽 속성은 ⁵ 것보다 TNFα 염증 중재자과 치료, 아래 훨씬 더 고통. 염증 자극에 높은 소뇌 취약점은 다발성 경화증 환자와 뇌척수염 ²⁹ 면역의 동물 모델 실험에서 생체에서 관찰 할 수 있습니다. 이러한 흥미로운 연구 결과는 뇌에 타겟 미래의 약물을 개선하기 위해, 생성하고 다른 뇌 영역에 대한 체외 모델에서 개인을 특징의 필요성을 보여줍니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
소 혈청 알부민 (BSA)	시그마 - 알드리치	A7906	순도> 98%
콜라겐 IV	시그마 - 알드리치	C5533	50 ㎜ 아세트산 50 μg / ML
Collagenase / Dispase	로슈	10269638001
Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM)	시그마 - 알드리치	D5796
디메틸 sulfoxide (DMSO)	시그마 - 알드리치	D2650
태아 혈청 (FCS)	PAA Laboratories의	A15110-1333	최종 농도 10 %, 열 inactivated (56시 30 분 ° C)
L-글루타민	Biochrom AG	K0282	저장 용량 : ≤ -15 ° C
가상 Vitamine	Biochrom AG	K0373	저장 용량 : ≤ -15 ° C
NA-pyruvate	Biochrom AG	L0473
Neomycin (G418)	PAA Laboratories의	P11-012
비 필수 아미노산 (NEA)	Biochrom AG	K0293	4에 저장 ° C
Penicilin / 스트렙토 마이신	Biochrom AG	A2212	저장 용량 : ≤ -15 ° C
인산염은 염분 (PBS)를 버퍼	Biochrom AG	L1825
Polybrene (hexadimethrine 브롬화)	시그마 - 알드리치	107689	PBS의 0.8 MG / ML, -20 ° C에서 저장
Puromycin	시그마 - 알드리치	P8833
트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	Biochrom AG	L1825	0.05 %, PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)