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요약

라고 기술 C omprehensive M icroarray P olymer 프로파일 (CoMPP)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 생물학적 상황의 넓은 범위에서 glycan 발생의 검사를 허용하는 소형 microarray 분석 플랫폼으로 정의 glycan - epitopes로 이동 단클론 항체의 특이성이 조화를 이루고 있습니다.

초록

식물 세포의 벽은 생리학과 식물의 개발에 중요한 역할을하고 인간 사회 (예 : 나무, 종이, 섬유 및 바이오 연료 산업) 1,2의 원료를 제공 이기종 glycans의 복잡한 matrixes 있습니다. 그러나, 이러한 구성 요소의 생합성과 기능을 이해하는 것은 도전 남아있다.

세포 벽 glycans는 화학적 및 빌딩 블록, glycosyl 잔류의 복잡성으로 인해 conformationally 다양합니다. 이러한 형태의 여러 위치에서 연계 및 링 구조에서 차이가이 이성질체 또는 anomeric 구성 할 수 있으며,뿐만 아니라, 비 설탕 잔류의 배열로 대체됩니다. Glycan 구성도 다른 셀 및 / 또는 조직 유형 또는 단일 셀 벽 3의 하위 도메인에 따라 다릅니다. 또한, 자신의 구성은 개발 한 동안, 또는 환경 단서 사에 대한 응답으로 수정됩니다.

예에2000 유전자의 운은 식물 세포 벽 이기종 glycans의 복잡한 matrixes Arabidopsis 5 세포벽 glycan 생합성 및 수정에 참여 할 것으로 예상 했었 있습니다. 그러나, biosynthetic 유전자의 비교적 적은은 기능적으로 4,5 특징되었습니다. 유전자는 종종 differentially 세포 유형 6 시까 종종 낮은 수준에서 표현되기 때문에 역 유전학 방법이 어렵습니다. 또한, 돌연변이 연구는 종종 적절한 세포벽 기능이 7 유지하기 위해 유전자 중복이나 보상 메커니즘에 의해 방해되어 있습니다. 따라서 소설 접근 방식은 빠르게 glycan 구조의 다양한 범위를 특징하고 이해 세포벽 생합성 및 수정에 기능 유전체학 접근을 촉진하기 위하여 필요합니다.

단클론 항체 (mAbs)는 8,9 식물의 glycan 구조와 분포를 결정하는 중요한 도구로 부각되었습니다. 이러한 지구 인식pectins, xyloglucans, xylans, mannans, 글루칸과 arabinogalactans 등의 식물 세포의 벽 glycans의 주요 클래스, 내 현재 inct의 epitopes. 최근의 사용은 공장 및 조직 유형 동시에 9,10,11의 넓은 범위에서 glycans의 상대적 풍부한을 결정하기 위해 대규모 심사 실험으로 확장되었습니다.

여기 감소 시약 및 샘플 볼륨과 소형화 microarray 플랫폼을 사용하여 상영 할 (100 초) 여러 샘플을 수 종합 Microarray 폴리머 프로파일 (CoMPP) (그림 1 & 2) 10,11라는 microarray 기반 glycan 검사 방법을 제시한다. microarray의 현장 신호 공식적으로 glycan 에피토프의 발생에 대한 반 정량 데이터를 제공하기 위해 정량화 할 수 있습니다. 이 방법은 잘 복잡한 생물학적 시스템 12 glycan 변경 사항을 추적하고 세포벽 성분의 글로벌 개요를 제공하는 데 적합합니다 특히 때 사전 지식 OF이 사용할 수 없습니다.

프로토콜

1. 조직 수집 및 준비

  1. 관심의 각 조직 최소한 세중의에 식물 조직의 100 밀리그램 신선한 무게를 (10 MG 건조 중량의 최소)를 수집합니다. 다음 단계는 식물 조직으로부터 세포 벽 재료의 준비에 대해 설명합니다. 저장 조직의 경우, 해제 - 원하는 녹말은 효소 이전에 13에 설명 된대로 세포 벽 고분자의 추출을하기 전에 제거됩니다.
  2. 24 튜브 어댑터 세트와 3 밀리미터 텅스텐 카바이드 비즈 (30 Hz에서, 2 X 30 초)로, Qiagen TissueLyser II를 사용하여 액체 질소로 고급 분말로 샘플을 균질화. 몇 샘플을 처리하는 경우 또는 박격포와 유봉이 사용됩니다.
  3. 10 ML 플라스틱 원뿔 튜브에 homogenates를 전송합니다.
  4. RT 10 ML 80% 브이 / v 에탄올에 homogenates을 닦고 2 분 동안 힘차게 vortexing하여 세포벽 자료를 준비합니다.
  5. 3500 XG에서 샘플을 원심 분리기와 표면에 뜨는 폐기. 표면에 뜨는 명확 때까지 70 % 에탄올 특히 엽록소를 포함하는 조직을 위해, 또는 적어도 세 번 씻어 반복합니다.
  6. 100 % 아세톤과 최종 세척을 수행하고 밤새 공기 건조에 알코올 불용성 잔류 물 (AIR)를 포함하는 알약을 둡니다.
  7. 체 공기 좋은, 균일 한 분말을 달성하고 제대로, 언젠가는 homogenate에 남아있는 지상 입자를 큰 제거하는 0.4 mm 2 메쉬와 샘플.
  8. microtubes, 샘플의 혼합을 지원하기 위해 3mm 유리 구슬을 포함하는 각에 10 MG의 AIR 샘플 무게.

2. 세포 벽 Glycans의 추출

  1. pectins과 관련된 Pectins, 그리고 고분자는 각 샘플의 50 μM C​​DTA (산도 7.5) 500 μl를 추가하여 샘플에서 추출됩니다.
  2. 간단히 소용돌이 튜브는 용매는 샘플 소재와 접촉을 보장하고 8 Hz에서 3 시간 동안 TissueLyser를 사용하여 혼합합니다.
  3. 주의 깊게 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 연구4 ° C.에서 supernatants과 상점을 emove
  4. 13,000 X g에서 남아있는 용매, 소용돌이와 원심 분리기를 희석 및 제거 할 드 - 이온화 물 1 ML에 알약을 씻으십시오. 펠렛을 방해하지 않으면이 단계를 반복하고 다음 단계로 진행하기 전에 튜브에서 모든 액체를 제거합니다.
  5. 교차 연결 glycans는 순차적으로 0.1 %로 4M NaOH의 500 μl로 남아있는 세포 벽 펠렛에서 추출됩니다 단계 2.1에서 설명한 동일한 절차를 사용 w / v를 NaBH4 - CDTA 추출을 위해 2.4. NaBH 4함으로써 다당류의 필링베이스를 방지 알코올로 다당류의 감소 끝에 알데히드 (또는 케토) 그룹을 줄이기 위해 추가됩니다.
  6. 원심 분리 후, supernatants는 다시 제거됩니다 4 ° C에 저장하고, 산탄은 다음 추출을하기 전에 드 - 이온화 물에 두 번 세척.
  7. 선택적 단계로서, 이러한 셀룰로오스 등의 잔류 고분자는, 500 μl cadoxen (31 % V / V 1,2 - diami으로 압축이 풀립니다2.4 - 2.1 단계에 설명 된대로 동일한 절차를 사용하여 0.78 M CDO와 noethane). 또한, 남은 펠릿의 절대 셀룰로오스 내용은 아세트산 / 질소 assays을 (토론 참조)를 사용하여 결정될 수있다.

3. 인쇄 Microarrays

  1. 원심 분리기의 supernatants는 미립자를 제거 13,000 XG에서 세포 벽 고분자를 추출 포함하는.
  2. 잘 폴리 프로필렌 384 샘플 조직 유형 및 추출 종류에 따라 배열되어 사전 정의 된 사용자 정의 레이아웃을 사용하여 microtiter 접시에 각 샘플의 50 μl를로드합니다.
  3. 탈 이온수와 0, 5, 25 × 시리얼 희석 시리즈의 세포벽 폴리머 샘플을 희석.
  4. 이러한 핀 높이 수집 및 시간을 머물러 있으며, 세척 단계와 같은 매개 변수가 microarrayer를 제어하는​​ 소프트웨어에 설정되어 있습니다.
  5. 인쇄 챔버의 습도는 샘플 증발을 방지 60 %로 제어됩니다.
  6. 인쇄 작업이 LabNEXT softwa를 사용하여 시작됩니다재와 microarray 레이아웃에 해당하는 프로그램입니다.
  7. 로봇은 기계의 평면 판에 부착되어 20 X 20cm의 니트로 셀룰로스 막에 샘플 판에서 솔루션을 인쇄 할 모세관 채널 핀을 사용합니다. 배열의 각 지점이 솔루션의 15 NL를 포함하고 세중의에 인쇄됩니다.
  8. 인쇄 작업이 완료되면 동일한 microarrays는 개별 배열에 막과 컷에 서로 옆에 인쇄됩니다.
  9. 각 실험에서 배열을 더 많거나 적은 샘플, dilutions 또는 복제를 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

4. Glycan Microarrays의 프로빙

  1. 인쇄 후, 비 특​​정 바인딩을 줄이기 위해 인산에 용해 w / V 무 지방 우유 분말은 2 시간 동안 실온에서 (MPBS) 생리 버퍼 5 %의 개별 microarrays를 차단합니다.
  2. MPBS에서 2 시간에 세포 벽 glycan epitopes에 대한 특정 단클론 항체와 프로브 microarrays. 단클론 antib의 대부분세포 벽 glycans에 대한 오디 세 회사의 상업적 사용할 수 있습니다, Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource 서비스 ( www.carbosource.net )와 PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
  3. 부정적인 컨트롤 만 MPBS도없고, 1 차 항체와 incubated microarray를 포함합니다.
  4. 인산 3 회가 아닌 특정 바인딩을 제거 할 5 분에 (PBS) 생리 버퍼 microarrays을 씻는다.
  5. 2 시간에 MPBS에 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP)에 복합 이차 항체와 microarrays를 조사. 세포 벽 glycans에 대한 대부분의 단클론 항체 안티 마우스 또는 안티 쥐 보조 항체가 필요합니다.
  6. 비 특정 바인딩을 제거하는 5 분에 3 회 PBS 버퍼로 세척 단계를 반복합니다.
  7. chromogenic (3,3-Diaminobenzidine) 또는 chemil를 사용하여 microarrays를 개발uminecent (루미놀) 기판.

5. 양을 정함

  1. 개발 후, 고해상도 (1,200 dpi의) 바탕 화면 스캐너를 사용하여 개별 microarrays를 검색 및 제외, 16 비트 TIFF 파일 (그림 3)로 이미지를 저장합니다.
  2. 자동 격자 도구가 구비 이미지 처리 소프트웨어 (LabNEXT) Xplore 사용하여 각 영역의 핵심 강도를 계산할 수 있습니다. 통합 현장 강도는 각 지점을 둘러싼 그리드 영역에서 픽셀의 합계에서 파생됩니다.
  3. 각 microarray에 대한 그리드 데이터는 txt 파일로 내보낼 수 있습니다 수동으로 분석을 위해 Excel 스프레드 시트로 가져올 수 있습니다. 온라인 도구 ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/가 ) 자동으로 번역 및 개인 txt 파일에서 데이터를 처리하기 위해 개발되었습니다.
  4. 통합 현장 강도가 인쇄 복제에서 평균과 '비열한 자리를 얻기 위해 dilutions 수 있습니다각 샘플에 대한 강도 '값 (그림 2). 또한, 배열에 하나의 희석 가치에 상응하는 현물 신호는 각 샘플에 대한 상대적 glycan의 에피토프의 풍요 로움을 수량화하는 데 사용됩니다.
  5. 다른 샘플 사이의 상대적인 평균 스폿 농도는 Excel 또는 온라인 heatmapper 도구 (에서 조건부 서식 사용하는 히트 맵 (그림 4)로 제공됩니다 http://bar.utoronto.ca/welcome.htm을 ). 각 항체 유형에 대한 데이터는 100 수정되어 5 %의 컷오프 값은 배경 신호 탐지를 제거하는 부과됩니다.

결과

Nicotiana alata 꽃부터 6 조직 유형 (약의 필라멘트, 꽃가루, 난소, 꽃잎, sepals 및 오명)에서 glycans의 상대적인 풍요 로움은 CoMPP를 사용하여 결정되었다. 그림 3A은 부분적으로 (저) methylesterified homogalacturonan (HG), pectic 다당류 14 일 발생 에피토프에 대한적인 mAb JIM5 특정와 탐색 된 대표 microarray를 보여줍니다. JIM5 에피토프가 모든 꽃 조직의 CDTA 추출물에서 발견하는 것은 stigmatic 조직

토론

CoMPP는 단 몇일 만에 수백 개의 공장 파생 샘플 glycan 구성을 프로파일에 대한 신속하고 민감한 방법입니다. 이 방법은 lectins, 수용체, 그리고 항체 16와 같은 glycan 결합 단백질과 탄수화물의 상호 작용 높은 처리량 검사에 대해 이미 사용 가능한 박테리아 나 포유류의 glycan 배열 플랫폼을 보완합니다. 세포 벽 glycans를 검출하기위한 가능한 프로브의 큰 다양성으로,이 식물 세포 벽의 8,9?...

공개

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 말

IEM은 자금 덴마크 연구위원회 (FTP 및 FNU)을 인정하고 싶습니다. ERL은 ARC DP 교부금의 지원을 인정합니다. AB는 식물 세포 벽의 부여에 우수의 ARC 센터의 지원을 인정한다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트 (선택 사항)
3mm의 텅스텐 카바이드 비즈 Qiagen 69,997
컬렉션 microtubes (1.2 mm) Qiagen 19,560 1.5 ML의 microfuge 튜브도 사용할 수 있습니다
Qiagen TissueLyser II Qiagen 85,300
3mm 유리 구슬 시그마 알드리치 Z143928
CDTA 시그마 알드리치 34,588
산화 카드뮴 시그마 알드리치 202894
1,2 - diaminoethane 시그마 알드리치 03,550
니트로 셀룰로스 막 (0.22 μm의 기공 크기) GE 물 및 공정 기술 EP2HY00010 다른 기공 크기의 멤브레인은 다른 핀 유형에 적합합니다
Xact II microarrayer 로봇 Labnext 001A Xact II 로봇은 니트로 셀룰로스 막가 연결되어 할 수있는 사용자 정의 20 X 20cm 세라믹 플레이트가 장착 된
RM microarray 핀을 Xtend Labnext 0037-350 핀은 멤브레인에 야생에 적합해야합니다
384 잘 microtiter 플레이트 (폴리 프로필렌) Greiner 781207
안티 glycan 단클론 항체 / 공장 프로브
CarboSource / Biosupplies 		웹 사이트, PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "대상 ="_blank "> www.carbosource.net)와 Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ).
안티 쥐 IgG (전체 분자) - 염소에서 생산 퍼 옥시 데이즈 항체. 시그마 A9037 이차 항체의 종류 (예 : 쥐, 마우스, 염소 등의 제기)를 사용하는 기본 항체에 따라 달라집니다.
시그마 FAST 3,3 '- Diaminobenzidine의 정제 시그마 D4293 시약을 개발의 유형은 사용 보조 항체를 검출 방법 (colourmetric, 또는 chemiluminecent)에 따라 달라집니다.
SuperSignal 서 피코 Chemiluminescent 기판 Thermoscientific 34,080 위의 내용을 참조
이미지 처리 소프트웨어의 Xplore LabNext 008 자동 gridding 도구와 많은 소프트웨어 종류를 사용할 수 있습니다microarray 명소의 픽셀 값을 측정합니다.
식물 다당류 시그마 / Megazyme
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참고문헌

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).

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