RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

요약

이 문서 RootChip의 Arabidopsis 모종 배양을위한 프로토콜, 미세한 루트 모니터링 및 세포내 신진 대사 단계의 걱정 기반의 측정과 성장 조건의 자동 제어를 결합한 microfluidic 이미징 플랫폼을 제공합니다.

초록

뿌리 식물의 물리적 앵커와 같은 기능과 같은 식물이 토양으로부터 취득하는 질소, 인, 황산 및 추적 구성 요소로서 물과 미네랄 영양소의 이해에 대한 책임 기관입니다. 우리가 높은 작물 수확량을 생산에 지속적인 접근법을 개발하고자한다면, 우리는 더 뿌리가 영양분의 다양한 스펙트럼을 소요하고, 공생과 병원성 유기체와 상호 작용, 개발 방법을 이해해야합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 몇 분 거리 일까지 기간 동안 미세한 자세하게 뿌리를 탐구 할 수 있어야합니다.

기반 microfluidic 장치, 이미징 ¹ (그림 1)에 대한 준비를하는 동안 뿌리에 어떠한 물리적인 스트레스를 피하는 동안 우리 Arabidopsis 모종의 성장 및 이미지 뿌리하실 수 있습니다 - 우리는 RootChip, polydimethylsiloxane (PDMS)을 개발했다. 장치는 유체 흐름을 안내하는 micromechanical 밸브를 갖춘 bifurcated 채널 구조를 포함솔루션 inlets에서 8 개의 관측 ^실이 각각 있습니다. 이 관류 시스템은 루트 microenvironment를 조절하고 정밀도와 속도로 수정할 수 있습니다. 챔버의 부피 따라서 테스트 솔루션에만 최소한의 금액을 필요로하는 약 400 NL이다.

여기 실시간 해상도로 영상 기반 접근 방법을 사용하여 RootChip에 루트 생물학을 공부를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 뿌리는 시간 저속 현미경을 사용하여 며칠 동안 분석할 수 있습니다. 루츠는 영양 솔루션이나 저해제로 perfused 수 있으며, 최대 8 모종은 병렬로 분석할 수 있습니다. 이 시스템은 화학, 유전자 발현의 형광 기반의 분석 및 biosensors의 분석의 존재 또는 부재의 루트 성장의 분석을 포함하여 어플 리케이션의 광범위한 잠재력을 가지고, 예를 들어이 nanosensors ³ 초조해.

프로토콜

참고 : 무균 조건 하에서 모든 단계 준비 단계를 수행합니다.

1. 종자 발아를위한 플라스틱 원뿔의 작성

1. 5mm의 두께로 1 %의 한천을 포함하는 성장 매체와 10cm 페트리 접시를 채우십시오. 우리는 Hoagland 매체 ^4를 수정한 반 강도를 사용하지만 중간 성분은 개별 실험적인 요구 사항에 맞게 선택되어야한다.
2. 매체가 여전히 액체이지만, 배양 접시에서 매체의 5 μl와 10 μl 피펫 팁을 채우기 위해 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
3. 매체가 완성 때까지 똑바로 견고한 성장 매체를 포함하는 배양 접시에 4mm 긴 플라스틱 콘과 장소로 잘라, 피펫 팁 상자에 채워진 팁을 저장합니다.

2. 종자 발아와 묘목 성장

1. 5 분, 5 %의 NaOCl에 종자를 소독 표면 살균 물로 세 번 씻어 다음, 중간 채워진 원뿔의 각 상단에 하나의 씨앗 배치의.
2. 4에서 Micropore 테이프 (3M)와 상점과 음식을 봉쇄 ° C 발아를 동기화합니다.
3. 3 개월 후엔, 발아를 시작하는 성장 캐비닛에 번호판을 전송합니다. 우리의 성장 조건 16h 높은 light/8h 어두운 사이클에서 23 ° C (100 μE m ^-2 s의 ^-1 빛의 강도)입니다.
4. 5 칠일 발아 후 사이에, 묘목은 RootChip로 전송을위한 준비가 있어야합니다. 이때 루트 팁 플라스틱 원뿔의 아래쪽 콘센트 근처에 있어야합니다. 해부 현미경 묘목 건강, 루트 길이, 해당되는 경우, 형광 마커의 표현을 확인합니다.
5. 칩에 전송을위한 개별 모종을 표시한다. 케이스 하나에 10 명 이렇게 모종을 선택가 전송 중에 손상되었습니다.

3. RootChip쪽으로 모종의 양도

1. 장기적인 실험을위한 RootChip 멸균을 위해 싸다조직 종이, 유리 배양 접시에있는 장소, 그리고 압력솥에있는 장치.
2. RootChip가 냉각되면, 액체 성장 매체와 함께 다룹니다. RootChip 완전히 포장되어해야하지만, 유체 수준 RootChip 표면 위에서 더 이상 3보다 mm이어야합니다.
3. 20 μl 피펫으로 중간에 전망대 챔버를 채우는 루트 입구와 챔버 콘센트를 통해 매체를 당기십시오.
4. 플러그 플라스틱 콘은 RootChip의 inlets로 단계 2.5 선택했습니다. 콘은 inlets에 석판이 적합합니다. RootChip는 광학 유리의 얇은 레이어에 탑재되어 있기 때문에, 칩에 너무 많은 압력을 적용하지 않습니다.
5. 액체 배지에서 하룻밤 RootChip을 품어. 부동 방지하기 위해 칩에 두개의 유리 슬라이드를 넣습니다. 자기 볶음 표시줄을 추가하고 요리를 닫습니다.
6. 자기 활동가로 어셈블리를 전송하고 부드럽게 매체를 선동.
7. RootChip의 inlets는 faci에 정상 장치에 30 ° 각도로 채널을 교차채널 (그림 1A)에 뿌리 성장을 litate. 추가로 원하는 방향으로 성장을 지원하기 위해 콘센트의 칩 반대의 측면에서 배양 접시 아래에 유리 슬라이드를 배치하여 약간 어셈블리를 기울.
8. 타이머에 연결되어 : 다크 / 라이트 사이클을 유지하기 위해 링 스탠드 (100 μE m ^-2 s의 ^-1 빛의 강도)로 묘목을 캐는.

4. 캐리어에 RootChip 연결

1. 다음 날, 액체 성장 매체 (그림 1B)로 sealable, pressurizable 병을 채운다.
2. 칩 캐리어 반전하고 안정된 표면에 놓으십시오. 액체 매질에서 RootChip를 제거하고 칩 캐리어 하단의 조리개로 PDMS 측을 아래로 삽입합니다. 동양 칩은 있도록 제어 계층 inlets을 포함 측면 캐리어 측면 벽에 압력 라인 튜브 커넥터의 측면에 직면하고 있습니다.
3. 에 덮개 유리를 건조부드럽게 티슈로 모래 바닥에 의한 칩의 바닥. 테이프 바로 온 회중과 함께 캐리어로 RootChip를 고정합니다.
4. 튜브 커넥터는 5cm 길이 조각으로 유연한 플라스틱 microbore 튜빙 (TYGON, 0.20 "ID X 0.060"OD)을 절단하고 스테인레스 스틸 microbore 튜브 (뉴잉글랜드 작은 튜브, 0.025 "OD X 0.013"ID X 0.75 "로 연결하여 만들어진다 긴). 칩 해당 컨트롤 계층 입구에 주사기 및 플러그 각 튜브 커넥터를 사용하여 물로 튜브 커넥터를 채우십시오. 물이 나중에 컨트롤 레이어 채널을 채울 것이며 micromechanical 밸브에 압력을 전송하는 데 사용됩니다.
5. 미디어 / 솔루션 유리병 (들)에 라인의 반대편 끝을 연결합니다. 공기 주사기와 솔루션 유리병에 압력을 적용합니다. 솔루션 유리병 내에서 증가 공기 압력 라인에 액체를 강제합니다.

5. 현미경에서 RootChip 마운트

1. microsc에 캐리어를 놓고ope 단계. 방에 진동에 의한 실험의 과정을 통해 변화 어셈블리의 가능성을 줄이기 위해 이동 통신사 무대 인서트의 노치에 정확히 맞도록해야합니다.
2. 칩을 통해 칩 밸브 및 매체의 흐름은 공기 압력에 의해 제어됩니다. 규제가있는 두 개의 라인 메인 압력 라인의 오프 측쇄있다 - 하나는 채널을 통해 매체 흐름을 제어하는​​ 데 사용되며, 기타는 제어 계층의 푸쉬 - 업 밸브 행동시키다 솔레노이드 에어 밸브에 연결됩니다. 솔레노이드 밸브는 밸브의 USB 컨트롤러 (라파엘 고메즈-Sjöberg, 로렌스 버클리 국립 연구소에 의해 개발)를 통해 컴퓨터에서 운영하고 있습니다. 칩을 연결하기 전에 두 압력 레귤레이터를 닫습니다.
3. 어셈블리 내의 습도를 높게 유지하기 위해 운송인의 저수지에 물을 몇 ML를 추가합니다. 이 단계 말리는에서 식물을 유지하는 이상의 실험 과정을 통해 반복해야합니다. t를 최소화하기 위해 볼륨은 줄이고현미경에 쏟았 수있는 액체의 그 금액입니다. 장기 실험은 칩 콘센트에서 유출은 microbore 튜빙 (단계 4.4 참조)와 저수지에 칩 콘센트를 연결하여 운송인의 저수지로하실 수 있습니다. 양자 택일로, 칩 표면에 축적 유출은 pipetting에 의해 수집된 수 있습니다.
4. 시트 보호 장치에서 투명 플라스틱 (C 라인)의 제곱 시트를 준비합니다. 어셈블리의 높은 습도를 유지하기 위해 양면 테이프로 캐리어에 투명 플라스틱을 수정합니다.
5. 칩 위에 링 빛을 위치와 다크 / 라이트 사이클을 유지하고 있습니다. 고리 빛이 직접 조명 이미지 컬렉션에 방해하므로, 형광 마커를 사용하는 모든 실험이 시작하기 전에 꺼져 있어야합니다.

6. LabView 인터페이스를 사용 RootChip 운영

LabView 소프트웨어 플랫폼을위한 RootChip 컨트롤러 인터페이스 수저희 웹 사이트에서 다운로드할 수 http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

1. 칩 밸브는 솔레노이드 공기 밸브를 열어이 경우 제어 계층에 압력을 적용하여 종료됩니다. 컨트롤러 인터페이스는 밸브 번호 아래의 버튼을 클릭하여 밸브의 작동이 가능합니다. 밝은 녹색 칩 밸브 (그림 2B)의 압력과 폐쇄의 응용 프로그램을 나타냅니다. 압력 레귤레이터를 열기 전에 컨트롤러 인터페이스의 세 가지 솔루션 유입 밸브를 활성화합니다. 참고 : 컨트롤러 인터페이스는 시스템의 상태 모니터링을 허용 피드백 루프를 갖추고 있습니다. 이 기능은 컨트롤러 인터페이스에 "Readback"버튼을 클릭하면 활성화됩니다.
2. 제어 계층에 대한 압력 조절기를 열고 처음에 15 PSI로 설정한 다음, 흐름 계층을위한 레귤레이터를 열고 처음 5 PSI로 설정합니다. Depen원하는 유속에 땡, 압력 나중에 조정할 수 있습니다.
3. 매체와 챔버를 플러시하는 선택의 성장 매체의 입구 밸브를 엽니다.
4. 현미경 흐름 경로를 확인합니다. 일반적으로 공기 흐름 채널에 갇혀하고 제거해야합니다. 또한, 컨트롤 레이어의 채널은 여전히​​ 튜브 커넥터 (막다른 충전)을 통해서 물이 밖으로 강제하고 교체해야 공기가 포함되어 있습니다. 두 작업 모두 공기가 PDMS로 채널 ( "degassing")에서 강제 때까지 8 챔버 각각의 여러 번 (5 PSI)를 플러시에 의해 달성된다. 참고 : 컨트롤러 인터페이스가 실험을 자동화하도록 프로그래밍 할 수 있습니다. 이러한 루틴은 가스를 제거하다 칩에도 사용할 수 있습니다.

7. 대표 결과

RootChip의 주요 목적은 통합을 높은 수준으로 단일 장치의 이미징 플랫폼과 관류 시스템을 결합하는 것입니다. 조작을 입증하려면뿌리의 microenvironment에서 우리는 어두운 식용 색소 (인거 매체 1시 4분 희석)와 챔버 스를 플러시하고 챔버 내의 유체의 교환을 측정했습니다. 5 PSI의 권장 압력에서 우리는 약 1.5 μl / 분 (그림 3)의 계산 유량에서 10 초 이내에 전체 교환을 측정했습니다.

우리는 또한이 사건 어둠 속에서 성장하고 외부 에너지원 (그림 4)와 같은 10 MM 포도당과 함께 제공에 모종의 루트 성장을 관찰했다. 이러한 빛과 매체의 구성과 같은 성장 조건에 따라 식물의 세 일 동안 RootChip에서 볼 수 있습니다.

RootChip는 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) ^5-7을 바탕으로 유전자 인코딩 nanosensors을 표현 뿌리에서 세포내 포도당과 갈락토 오스 수치를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 칩의 뿌리는 포도당이나 갈락토 오스 솔루션의 사각형 펄스로 perfused되었다 ( 그림 5). 설탕의 세포내 수준 모니터링되었으며 여기에 표시된 기증자 ECFP의 강도에 대한 수용체의 형광단의 황수정의 강도의 비율로 표현됩니다. 비율의 상승은 설탕의 축적을 나타냅니다.

1 그림. RootChip 원리.

1. RootChip은 뿌리의 성장과 이미징위한 8 개의 관측 실이 있습니다. 종자는 먼저 플라스틱 콘에서 발아 - 플라스틱 피펫 팁에서 가공 - 어떤은 고체 매체로 가득합니다. 루트 팁이 매체를 통해 성장과 액체 매체의 지속적인 흐름 챔버 상수의 조건을 유지 챔버에 도달합니다. Micromechanical 밸브 (적색)는 흐름을 제어합니다. 이 칩은 광학 커버 유리에 마운트됩니다.
   확장하지 그리기. (Grossmann 외., 2011 식물 세포의 허가로 적응.)
2. SCH다이어프램 (적색)와 pressurizable 솔루션 유리병의 리.

그림 2. 연결 및 RootChip를 장착.

1. 완전히 연결된 RootChip와 이동 통신사 위로보기는 거꾸로 현미경에 장착.
2. 제도 valving 시스템과 컨트롤러 인터페이스를 설명. 단일 챔버에 유체 흐름을 안내하는 설정 밸브에 대한 예를 나타납니다. 동안 밸브 4 싱글 밸브, 단체에서 3 행위를 통해 밸브를 0과 같은 여덟 행위를 통해. 이 시스템을 통해 개별 챔버는 밸브의 조합을 활성화하여 해결하실 수 있습니다.

그림 3. 관측 채널의 솔루션의 교환ambers. 염료 용액을 사용하여 관측 챔버의 유체의 교환의 시각화. 이미지는 명시야 및 염료 신호의 허위 색의 강도의 오버레이이다.

4 그림. 온칩 루트 성장. 관측 형광등을 표현하는 하나의 성장 루트는 20h의 과정을 통해 포도당 / 갈락토 오스를위한 nanosensor 초조해. 시간 형식 : HH : MM, 스케일 바 : 100 μm의.

그림 5. 사용하여 측정 세포 내 설탕 수준은 nanosensors을 무서워.

1. 센서의 금액은 루트 팁 이내 황수정 강도 (왼쪽)으로 표시됩니다. 세포 내의 반​​응은 포도당이나 갈락토 오스 솔루션의 응용 프로그램에 nanosensor이 ratiometric 이미지로 표시됩니다 초조해. (Grossmann 외로부터 허가를 적응. 2011 괞찮아가NT 셀) 규모 모음 :. 100 μm의.
2. 추적은 세 반복 평방 포도당의 펄스 (녹색)와 갈락토 오스 (적색)에 대한 응답으로 비율 변화를 무서워.

토론

기존의 성장 방식을 통해 RootChip의 주요 장점은 현미경을위한 최소한 침략적 준비, reversibly 반복 루트 환경을 변경할 수있는 능력, 그리고 몇 일간의 기간 동안 발달 능력과 생리학적으로 건강한 조직의 지속적인 관찰을위한 용량입니다. 이전에는 모종은 gelled 미디어에 수직으로 성장되었으며 한 번에 ⁸ 시에 하나의 뿌리를 측정하는 허용 실험 직전 관류 시스템에 전송. Microfluidic 도구는 Arabidopsis에게뿐만 아니라 낮은 통합 레벨 ⁹ 또는 관류 컨트롤 ^열없이 사용되었습니다. RootChip 정확한 흐름지도를 통해 실험을 자동화하는 기능과 함께 통합의 높은 수준을 자랑합니다. 모든 microfluidic 장치 ¹¹ 특성이 플랫폼, 또 다른 이점은 액체의 단지 최소한의 금액이 필요한 너트와 루트를 제공하는 데 필요한 것입니다심지어 며칠 걸치는 실험을위한 rients. RootChip는 현재 단일 사용 장치로 설계되어 있지만, 칩의 생산 비용이 낮은이기 때문에, 소비 시약의 소량은 여전히​​ 매우 비용 효율적인 칩을 만들 수 있습니다.

모종의 건강을 보장하기 위해 촬영해야합니다 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 :

플라스틱 원뿔의 부피는 공기에 노출되면 건조되기 시작합니다서만 3-4 μl입니다. 따라서 그것은 원뿔이 빠르게 칩에 전송되고 뿌리가 충​​분한 물로 그들을 공급할 것입니다 전망대 챔버를 도달할 때까지 습도가 높은 유지되는 것이 중요합니다. 4.2-4.5 단계는 빠르고 모종의 건조를 방지하기 위해 중단없이 수행되어야한다.

단계 3.5-3.8는 뿌리가 관측 실로 성장하는 동안에 액체 매체 칩의 인큐베이션을 설명합니다. 이 단계는 C에 칩을 장착하여 생략 수 있습니다arrier 즉시과 성장 매체와 지속적인 관류를 시작합니다. 그것이 몇 가지 장점이있다 그러나, 우리는 하룻밤 사이에 성장 매체에 몸을 담글 좋습니다 묘목들이 관찰 챔버로 성장로서 desiccated 될 확률이 적은있다 그래야 그것이 습한 환경을 조성 1), 2) 칩은 액체에 배어 있으므로 degassing (6.4 단계)이 빠르게 될 것입니다.

그것은 낮은 용질 농도와 미디어를 사용하는 것이 중요합니다. 더 농축 솔루션은 칩은 며칠 동안 사용되고 특히, 침전 및 채널을 방해할 수 있습니다.

장치가 공기 압력 라인에 연결되면, 매체의 유량은 밸브의 유압 압력을 변경하여 제어됩니다. micromechanical 밸브의 적절한 종결을 보장하기 위해서는 유동 압력보다 약 세 배 높다 제어 압력을 선택하는 것이 중요합니다. 유체가 루트 inlets에서 밀쳐되므로 유동 압력이 15 Psi를 넘지 않아야합니다. 높은 압력 mAY는 또한 칩을 사용할 수 없게를 렌더링 칩, 박리의 원인.

RootChip의 제한은 PDMS는 다공성과 소수성이라는 것입니다. 자료가 수성 솔루션에 거의 불활성이지만, 그것은 유기 화합물에게 ¹² 흡수할 수 있습니다. 이것은 유기 화합물이 화합물의 공급 장치가 입구에서 중지되었습니다에도 물질로부터 누출 수 있으므로 솔루션의 신속한 교환을 방해할 수 있습니다. 다공성으로 인해 유기 용제를 사용하면 PDMS ¹² 부기의 원인이 될 수 있습니다.

우리는 작물 식물의 뿌리 RootChip을 최적화하고 예를 들어, 자사의 유틸리티를 확장하는 것을 계속한다. 우리는 치료와 관찰에 대한 루트 액세스를 향상시킴으로써, RootChip 같은 microfluidic 도구 루트 연구의 새로운 차원을 열었을 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
항목	출처	안내
칩 캐리어, 소프트웨어 및 기타 정보를 제공합니다.	카네기 연구소 - DPB	캐리어 제조, 컨트롤러 소프트웨어 및 자세한 정보는 CAD와 CNC 파일은 웹 사이트에서 다운로드할 수 있습니다 http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip의 캐리어도이 웹 사이트에서 주문할 수 있습니다.
RootChip	스탠포드 주조	마스크 설계 및 제조 프로토콜은 요청시 가능합니다. 즉시 사용하기 RootChips는 주문할 수 http://www.stanford.edu/group/foundry/
칩 컨트롤러	가정 내장	자동 밸브 컨트롤러 시스템은 원래 라파엘 고메즈 - Sjöberg, 로렌스 버클리 국립 연구소에 의해 개발되었다. 어떻게 자신의 actuated 밸브 컨트롤러를 구축하는 자세한 지침은에서 찾을 수 https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers