성인 마우스에서의 모터 단위 제작 룸버 Motoneuron과 포스의 동시 세포 녹화<em&gt; 생체에</em

Marin Manuel; C.J. Heckman

doi:10.3791/4312

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요약

이 새로운 방법은 하나의 성인 마우스 motoneuron과 근육 섬유에 의해 생성 된 힘의 측정의 동시 세포 녹음을 할 수 있습니다. 정상과 유전자 변형 동물의 모터 장치의 전기 및 기계적 성질의 결합 조사 신경 근육 시스템의 연구를위한 돌파구이다.

초록

가 (1) 쉽게 식별 할 목표를 (근육 섬유)를 갖는와하는 것은 따라서 매우 잘 알려진 기능을 갖는 고유의 특성을 가진 중추 신경계의 신경 세포이기 때문에 척추 motoneuron 긴 신경 기능을 연구하기위한 좋은 모델 시스템 왔습니다 (근육 수축을 조절하는), (2) 많은 척추와 내림차순 네트워크의 수렴 대상 "최종 공통 경로"의 따라서 이름 존재하며, (3)이 가능 날카로운 세포 전극과 함께 침투 할 수있는 대형 소마를 갖는 . 또한, 생체에서 공부했을 때, 그것은 동시에 motoneurons과 근육 목표에 의해 개발 된 힘의 전기 활동을 기록 할 수 있습니다. 생체에 motoneurons의 세포 녹음을 수행하는 것은 동시에 공부 할 수있는 독특한 위치에 experimentalist 넣어, "모터 유닛"(motoneuron, 그 축삭에 지정된 이름의 모든 격실, 그리고가 ¹ innervates 근육 섬유) : motoneuron에 impinging 입력은 motoneuron의 electrophysiological 속성 및 motoneurons의 생리적 기능에서 이러한 특성의 영향은 그 모터 장치에 의해 발생 된 힘을 즉. 준비가 마비 될 수 있으며 따라서 세포 내 기록에 대한 기계적 안정성이 감소되기 때문에 그러나,이 방법은 매우 어려운 것입니다. 따라서, 실험의이 종류는 고양이와 쥐의 달성되었습니다. 이 정상과 유전자 변형 생쥐에서 유사한 실험을 수행 할 수 있었던 경우에는 척추 모터 시스템의 연구는 강력한 도약을 수 있습니다.

기술적 인 이유로, 마우스의 척수 네트워크의 연구는 대부분 motoneurons과 척추 네트워크 유치 체외 준비에 신생아로 제한되었습니다 motoneurons는 목표에서 분리하고, 슬라이스, 미주리에서 공부했을 때 아르toneurons들은 입력의 대부분에서 구분됩니다. 최근까지 몇 그룹은 우리가 성인 마우스에 생체에 ^5,6를 motoneurons 매우 안정적인 레코딩을 얻을 수 새로운 준비를 출판 저희 팀을 포함, 생체 ^2-4 motoneurons의 세포 레코딩을 수행하기 위해 관리했습니다. 그러나, 이러한 녹음 즉, 이러한 motoneurons의 힘 출력을 기록 할 수있는 가능성이없는, 마비 동물에서 얻은되었습니다. 여기 우리가 motoneurons의 electrophysiological 속성 및 모터 유닛에 의해 개발 된 힘의 동시 녹음을 얻을 수있었습니다있는이 원래 준비의 확장을 제시한다. 그것은 우리가 자신의 힘 프로필에 따라 motoneurons의 다른 유형을 식별함으로써 자신의 기능을 공개 할 수 있으므로 이것은 중요한 성과입니다. 유전자 모델은 척추 segmental 회로 ^7-9 방해가, 또는 인간의 disea를 reproducting와 커플 링SE ^{10,11, 우리는이} 기술이 척추 모터 시스템의 연구를위한 필수 도구가 될 것으로 기대합니다.

프로토콜

1. 단계 하나

사전 마취 약물 : 마취의 유도 전에 10-15 분, 각각 타액의 분비 및 부종을 방지하기 위해 아트로핀 (0.20 밀리그램 / kg)와 methylprenidsolone (0.05 MG) 하위 cutaneously를 삽입.

2. 2 단계

마취의 유도 : pentobarbital 나트륨 (70 밀리그램 / kg) 또는 케타민 / xylazine (10 MG / kg, 각각 100 밀리그램 / kg 이상) 간 peritoneally의 혼합물을 주입. 마우스가 더 발가락 핀치 반사를 얻을 수 없습니다 때까지 아래 가자. 마취가 너무 빛이 발생하는 경우 복용량의 1 / 4 보충.

3. 세 번째 단계

* 참고 사항 :이 수술은 터미널 절차입니다.

마취의 수술 비행기에 도달 할 때 발생하기 쉬운 위치에 제기 따뜻한 담요 위에 마우스를 전송합니다.

100 ML / 분 주위에 흐름에서 순수 O _2를 제공 마스크와 마우스의 주둥이를 다룹니다.
을 머리 깎기를 사용하여 꼬리의 기지로 목의 목덜미에서 등쪽 지역을 면도.
또한 오른쪽 hindlimb 면도.
위로 향한 위치로 마우스를 뒤집하지만 장소에 산소 마스크를 남겨하는데주의를 기울여야.

4. 4 단계

사지 주변에 고정하고 작업 표면의 네 모서리에 고정 봉합과 장소에 마우스를 고정합니다.

5. 5 단계

마우스 코어 온도를 모니터링하기 위해 온도 프로브를 삽입합니다. 36 ° C와 38 ° C. 사이의 핵심 온도를 유지하기 위해 가열 담요 / 램프 전력을 조정

6. 기관 절개술 및 인공 환기

무딘 가위를 사용하여 기관을 통해 상처를 만들고 양쪽에 떨어져 피부를 당긴다.
무딘 집게를 사용하여 기관을 다루는이 얇은 근육 (Sternohyoid)을 노출로 침샘 때문에 찢어.
무딘 집게를 사용, 두 musc을 분리기관을 표시하는 방법으로 자신의 중간 분리를 따라 레.
뒤몽 7 포셉을 사용하여 기관에서 4.0 실크 봉합의 두 길이를 끼 웁니다.
이 연골 성의 고리 사이에있는 기관에서 횡단 컷을하지만 섹션의 호흡 관을 완전히하는데주의를 기울여야.
기관 아래 tracheal 튜브를 넣고 그 위에 봉합을 매는하여 삽입 개방의 양쪽에 고정하십시오. tracheal 튜브는 마우스 환풍기 (SAR-830/AP, CWE 주식회사)과 capnograph (μcapstar, CWE 주식회사)에 연결되어 있습니다. 환풍기는 순수 O _2의 소스로, 준수 백을 통해 연결되어 있습니다. 마우스가 인공 환기 싸우고되지 않고 최종 갯벌 PCO _2는 4와 5 % 사이 안정되도록 환풍기 (호흡 속도 100-150 BPM, 최종 갯벌 볼륨 170-310 μl)의 매개 변수를 조정합니다.

7. 정맥 선의 위치

무딘 절개 기법 사용, 경정맥에 노출목의 한쪽면에 정맥. 이 단계에서, 경정맥 정맥은 두 가지 주요 줄기, 앞쪽과 뒤쪽 얼굴 정맥으로 나눕니다.
두 번 한이 줄기 각각에 대해 설정 한 다음 단계를 수행합니다 :
1. 뒤몽 4 ~ 5 포셉 사용하여 주변 결합하는 조직에서 정맥을 신중하게 구분합니다.
2. 뒤몽 7 포셉을 사용하여 정맥에서 6.0 실크 봉합의 두 길이를 끼 웁니다. 정맥의 길이를 따라 멀리 가능한 한 그들을 구분합니다.
3. 정맥 (심장에 가장 가까운 쪽)의 근위 측면에 작은 혈관 클립을 배치하고, 정맥의 말초 측면을 묶을.
4. 아주 좋은 홍채 가위 사용을 완전히 섹션에 정맥 큰 신경 안 복용, 정맥에 작은 가로 절개를합니다.
5. 최대 선박 클립에, 개방에 미리 기입 1Fr 카테 테르 (premicath, Vygon)를 삽입합니다.
6. 뒤몽 4 포셉에 함께 정맥과 카테터를 잡고, 조심스럽게 선박 클립을 제거 후, 카테터 몇 가지 mor을 밀어정맥에 전자 mm.
7. 삽입의 양쪽에 모두 봉합으로 매는하여 카테터를 고정합니다.
카테터 중 하나의 anesthetics 때마다 필요한 (보통 매 10-30 분). 보충 용량을 주입하는 주사기 또는 주사기 펌프에 연결되어 IV 투여는 중 6 밀리그램 / pentobarbital 나트륨 또는 1250 40 μg / kg / 케타민 / xylazine ¹² 분 kg. 다른 카테터는 NaHCO ₃ (1 %)과 plasmion (14 %)를 포함하는 4 % 포도당 솔루션의 속도가 느린 정맥 주입 (50 μl / 시간)에 주사기 펌프에 연결되어 있습니다.

8. 니들과 봉합사로 목 피부를 닫고 쉽상 위치에 마우스로 돌아 가기

9. 뒷다리 - 사지 근육과 신경의 해부

가위를 사용하여 아킬레스 힘줄의의 허벅지의 상단에서 절개를합니다. 혈관을 손상하지 돌보는, 기본 근육에서 피부를 분리합니다. 필요에 따라이 부식.
허벅지를 실행하는 흰 선으로 나타납니다 팔뚝 Femoris의 앞쪽 가장자리를 식별합니다. 가위를 사용 조심스럽게 무릎에서 라인을 따라 엉덩이 뼈에있는 모든 방법을 엽니 다. 근육을 분리합니다. 좌골 신경은 이제 팔뚝 Femoris 아래에서 볼 수 있습니다.
조심스럽게 어깨를 Femoris을 해부. 출혈을 방지하기 위해 필요에 따라 / 끈을 부식. 팔뚝 Femoris는 완전히 제거하거나 좌골 신경과 삼두근 Surae 근육을 노출 reclined 할 수 있습니다.
Sural 신경을 해부.
8 / 0 실크 스레드를 사용하여 일반 Peroneal 신경의 말초 부분을 묶고, 매듭을 말초 컷. 가능한 한 유행에 가까이, 신경 끝까지를 해부.
일반 Peroneal와 Sural 신경 사이에 정강 신경을 확인합니다. 정강 신경의 서로 다른 지점 사이에, (지금의 정강 신경로 칭함) 더 깊은 지점에서 삼두근의 Surae을 innervating 지점을 식별합니다.
8 / 0 실크를 사용하여나무 가지가 삼두근의 Surae을 innervating 그대로 유지하면서 목록, 정강 신경의 모든 가지를 함께 묶어. 매듭에 distally 정강 신경을 잘라까지 가능한 신경을 해부.
다음 단계로 진행하면서 dessication을 방지하기 위해 식염수에 imbibed 거즈로 전체 hindlimb을 다룹니다.

10. Laminectomy

가위를 사용하여 백본을 따라 절개를합니다. 기본 근육에서 피부를 분리합니다.
피하 근육을 분리 할 수있는 척추의 각 측면에 두 절개를합니다. 다음 각 측면에있는 척추의 측면에 부착 근육의 각 힘줄을 잘라.
무딘 집게와 고급 퀴렛 사용하여 명확하게 각각의 척추 뼈를 식별 할 수 spinous 프로세스 주위 척추의 등쪽에 근육의 나머지 부분을 제거합니다.
척추 T13와 L1을 식별합니다. T13는 늑골이 첨부 할 마지막 척추 뼈이다. 척추 열 w병 커닝햄 척추 척추 겸자 (주 Stoelting)를 사용하여 고정합니다. T13와 L1의 각 측면에있는 척추 클램프를 놓습니다. 척수를 압축하지 않도록주의하지만, 종 방향 축에 긴장이 약간 넣어. 척추 잘 집게로 살짝 아래로 눌러 고정되어 있는지 확인합니다.
고급 rongeurs를 사용함으로써 척수를 노출 T13와 L1을 통해 다음 laminae을 척추 프로세스를 제거합니다.
탈수를 방지하기 위해 식염수에 imbibed면이나 spongel의 작은 비트로 노출 된 척수를 다룹니다.
척수를 둘러싸고있는 다시 상단에 맞춤 제작 플라스틱 욕조를 배치합니다. 4 / 0 실크 스레드를 사용하여 장소에서 목욕을 고정합니다. 욕조가 편의점 - 캐스트 밀봉 (WPI)와 함께 밀폐하여 방수인지 확인하십시오.
편의점 - 캐스트가 건조되면, 척수를 덮고있는면을 제거하고 미네랄 오일과 함께 목욕탕을 입력합니다.
뒤몽 5 포셉 매우 훌륭한 홍채 가위를 사용하여 부드럽게 경질의 친구를 당겨R은 척수를 둘러싸고 있으며, 두 방향으로까지 가능한 엽니 다. 척추의 각면에 경질를 접으십시오.
이 척추 클램프에 의해 중지 유지하기로 마우스가 그렇게 거짓말을하는 제기 플랫폼을 낮 춥니 다.
동물의 뒤쪽 지역을 지원하는 엉치 지역의 spinous 프로세스를 클램프 다른 척추 클램프를 사용하십시오.
세 번째 클램프가 오른쪽 hindlimb과 발목을 고정하는 데 사용됩니다, 무릎에서 90 ° 각도로 근육이 수축.

11. 아킬레스의 힘줄의 해부

다리는 무릎과 발목에서 90 °에서 구부러으로 hindlimb 면적 거즈를 제거하고 조직을 주변의 무료 아킬레스의 힘줄 해부. 많은뿐만 아니라 조직을 주변에서 가능한 삼두근의 Surae으로 해부.
calcaneus에 가까운 Plantaris 근육의 힘줄을 잘라 다음 완전히 힘줄을 제거하려면 다시 잘라.
스레드 바늘 사용, 일을 통해 6 / 0 실크 실을 첨부전자 아킬레스의 힘줄과 힘줄 주위에 트리플 매듭을합니다.
매듭에 가까운 힘 변환기를 배치, 힘줄의 말초 부분을 잘라 내고 실크 스레드를 사용하여 힘 변환기에 첨부합니다.
삼두근의 Surae 근육의 근막 아래 스테인레스 스틸 와이어의 두 길이를 넣습니다. 이 와이어는 EMG 기록에 대한 세포 AC 앰프에 연결되어 있습니다.
이 양극성 훅 전극에 공통 Peroneal 신경과 정강 신경을 배치합니다.
양극은 주변 근육을 만지면으로 훅 전극의 음극에 삼두근의 Surae 신경을 놓으십시오.
절연 장치에 대한 모든 자극 전극을 연결합니다.
코드 dorsum 잠재력을 기록하는 세포 AC 증폭기에 연결된 척추의 등 표면에 볼 전극을 배치합니다. 다시 근육과 연락 자세 / AgCl 참조 전극을 배치합니다.

12. 단계 천

삼두근의 Surae 신경을 자극최대 트 진폭이 관찰 될 때까지 낮은 주파수 (<1 Hz에서)에서 증가 강도의 50 μsec 사각형 펄스를 사용합니다. 천천히 트 진폭이 최대에 도달 할 때까지 트 응답의 진폭을 모니터링하는 동안 근육을 향상시킬 수있는 힘 변환기를 이동합니다.

13. Motoneurons의 세포 레코딩

에이 시점에서, 표준 electrophysiological 기술은 세포 내 전극을 준비 척수에 신경에 침투 motoneuron로 식별하는 데 사용됩니다.

피펫 풀러 (P-97 Micropipette 풀러, 셔터 악기)를 사용하여 ~ 1 μm 팁에 유리 micropipette를 당겨. KCl 3M 솔루션 (전극 MΩ 10-20의 저항)으로 전극을 입력합니다.
micropositioner 사용하여 척추에 세포 증폭기 (Axoclamp 2B, 축삭 인스트루먼트)에 연결된 micropipette를 운전합니다. 전자의 자극에 의해 elicited 지역 필드 잠재력을 모니터링이크 신경 삼두근의 Surae의 모터 풀을 찾습니다.
microelectrode의 저항을 모니터링하면서 putative motoneurons을주의 깊게 접근한다. 막에 대한 밀어 때, 저항은 증가합니다. 침투 가끔 세포 증폭기의 "버즈"기능을 사용하여 용이하게 할 수 있습니다.

14. 안락사 절차

실험의 끝에서 동물은 pentobarbital의 과다 복용 목 베기 다음 (210 밀리그램 / kg IV)에 의해 euthanized 있습니다.