카본 블랙 잉크의 혈관 재관류은 뇌 혈관의 신뢰성 시각화 수 있습니다

Mohammad R. Hasan; Josephine Herz; Dirk M. Hermann; Thorsten R. Doeppner

doi:10.3791/4374

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참고문헌
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요약

쥐 뇌 혈관 해부학 분석 실험 뇌졸중 연구에 중요한 역할을한다. 이러한 맥락에서, 색 라텍스와 혈관 재관류는 몇 년을위한 표준 도구로 간주되었습니다. 그러나,이 기술은 재현성을 저해 별개의 기술적 한계를 의미합니다. 여기, 우리는 재현 방식으로 뇌성 혈관을 시각화 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 고 대비 시각화와 뇌성 혈관의 충분한 충전의 왼쪽 심실 심근 결과를 통해이 상업적으로 이용 가능한 카본 블랙 잉크 혼합물의 주입. 우리는 성공적으로 다른 유전 적 배경을 가진 쥐 대뇌 혈관 지역 사이 anastomotic 포인트를 확인하기 위해이 기술을 적용했습니다. 쥐 경색 볼륨을 관찰하고 분석 할 수있는 널리 사용되는 도구 - 우리는 마침내 우리 선박 착색이 소설과 간단한 방법은 triphenyltetrazolium 염화 (TTC) 염색과 결합 할 수 있다는 증거를 제공합니다.

초록

대뇌 혈관의 해부학 적 구조는 뇌 혈류 역학의 주요 결정자뿐만 아니라 허혈성 모욕에 따라 부상의 심각성입니다. 대뇌 vasculature 동적으로 다양한 pathophysiological 상태에 응답하며 긴장 사이 유전자 조작 조건에 따라 상당한 차이를 전시하고 있습니다. 기본적으로 intracranial 선박 착색에 대한 신뢰할 수있는 기술은 허혈성 뇌졸중의 pathogenesis을 연구하기 위해 필수적입니다. 최근까지 다양한 기술의 집합은 낮은 점도의 수지, araldite F의 주입을 포함하여 대뇌 vasculature, 젤라틴 ² 또는 검은 색 ³ 탄소없는 다양한 염료 ¹ (즉, 카민 붉은 색, 인도 잉크) 또는 라텍스과 혼합.를 시각적으로 고용되었습니다 오름 대동맥을 통해 흰색 라텍스 화합물의 재관류가 먼저 코일과 Jokelainen ^{3보고되었습니다.} 마에다 외. ² carbo을 추가하여 프로토콜을 수정 한뇌의 생리 재관류 후 혈관의 개선 대비 시각화를위한 라텍스 화합물로 N 검은 색 잉크. 그러나, 비효율적 인 재관류와 혈관의 불충분 한 충전이 자주 라텍스 화합물 ^4의 높은 점도로 인해 발생합니다. 따라서, 우리는 재현 방식으로 ⁵ 대뇌 vasculature을 시각화 두 상업적으로 이용 가능한 카본 블랙 잉크 (CB1과 CB2)의 혼합물을 사용하여 간단하고 비용 효율적인 기술을 설명하고 있습니다. 우리는 라텍스 재관류 ⁵ 비교에서 더 높은 밀도에 훨씬 작 뇌성 선박의 얼룩에 마우스 결과에 CB1 + CB2와 그 세례를 보여 주었다. 여기, 우리는 앞 (ACA)와 다른 유전 적 배경을 가진 쥐 선박 변화를 공부하는 중 뇌동맥 (MCA) 사이 anastomotic 점을 식별하기위한 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 CB1를 조합하여 마우스의 과도 초점 대뇌 국소 빈혈 모델에서의 기술의 가능성을 보여줍니다 +허혈성 부상의 다양한 각도 TTC의 착색과 CB2로 인한 선박 착색.

프로토콜

1. 동물

실험은 실험실 동물의 보호 및 사용에 대한 NIH 가이드 라인에 따라 실시하고 지방 자치 단체에 의해 승인되었습니다. 모든 실험 C57Bl6 / J 야생 타입 마우스, ApolipoproteinE ^{- / -} (ApoE KO) 및 (12-16주 오래된 26~30그램의 체중, 실험 집단 당 5-6 동물) SV129 마우스가 사용되었습니다.

2. 컬러 라텍스와 뇌 혈관의 얼룩

EP 관 1시 20분 비율에 라텍스 화합물의 0.5 ML (Pebeo, 프랑스)와 25 μl 카본 블랙 잉크 (Herlitz, 독일)의 혼합물을 준비하고 물을 욕조에 37 ° C에서 혼합을 따뜻하게. 동물을 anaesthetizing 전에 28 30g의의 바늘로 2 ML의 주사기에 혼합를 수집합니다.
멸균 정상적인 생리의 1 ML에 papavarine 염산염 분말의 50 MG를 해산. 인슐린 주사기의 솔루션을 수집합니다. 다른 멸균 인슐린 주사기에서 바늘을 중지. 20 C의 끝에이 바늘을 삽입합니다m 길이 PE10 튜브. 지금 vasodilatation과 혈관의 적절한 충전을 보장하기 위해 넙 다리 정맥을 통해 주입 할 수 papavarine 하이드로 클로라이드 솔루션을 포함하는 인슐린 주사기의 바늘에이 PE10 튜브를 연결합니다.
또 다른 두명의 인슐린 주사기에게 생리의 각 함유 한 ML을 준비합니다. 인슐린 주사기는 정확한 위치에 주입 유체의 원활한 전송을 할 수 있습니다. 그러나, 라텍스, 대체 이동식 넓은 바늘 1 ML 주사기의 높은 점도로 인해 사용해야합니다.
운영 단계에 가까운 모든 주사기와 살균 해부 악기를보세요. 운영 단계 주위에 수술 포목상 시트를 확산. 작업 단계는 충분히 조명해야하고 필요한 경우 운영 현미경을 사용할 수 있습니다.
이제 C57Bl6 / J 마우스의 체중을 측정 한 후 5%이 70 % N ₂ O 30 % O _2의 isoflurane 기화로 마취를 유도. 기화 isoflurane의 1 %로 마취를 계속합니다. 적절한 positionin 후사지의 그 뒤로 고정에 마우스 g, 마취의 깊이를 신고 할 수 있습니다. 그런 다음 왼쪽 넙 다리 정맥을 통해 피부를 잘라 정맥을 찾습니다. PE10 튜브에 삽입 바늘의 날카로운 끝을 넣고 천천히 분 당 100 μl (50 밀리그램 / kg 체중)의 속도로 papavarine 하이드로 클로라이드 솔루션을 주입.
분사 후, 복강과 관통 가로막을 잘라. 을 손상하거나 멍이없이 마음을 노출 갈비뼈를 잘라. 동맥 포셉으로 내림차순 흉부 대동맥을 클립. 정맥 피가 사라져 있도록 오른쪽 심방을 통해 날카로운 상처를합니다. 18-20 초 이상 약간의 압력을 수동으로 색 라텍스를 주입 한 다음, 왼쪽 심실에 생리 2 ML를 삽입. 미리 채워진 주사기 다른 후 하나를 사용하십시오. 모든 거품을 주입하지 마십시오.
라텍스의 주입 후, 5 분의 동물을 두십시오. 동물 목을 벨 조심스럽게 전체 뇌를 제거합니다. 선박 건축과 corte을 해치다하지를 잘 가져가X 두개골 뼈와 meninges를 제거하는 동안. 사진을 가져 4% PFA 6-8 ML을 포함하는 60mm 세포 배양 접시의 뇌를 놓습니다. 투명한 접시 아래에 측정 통치자를 놓습니다. 운영 현미경에 부착 된 카메라로 등쪽와 뇌의 복부 표면의 25x 확대 사진을 찍습니다. 사진은 원래 거리를 수량화하기 위해 페트리 접시와 현미경 대물 사이에 90 ° 각도로 촬영해야합니다.
또 다른 4-5 동물의 절차를 반복합니다.

3. 카본 블랙 잉크의 혼합과 뇌 혈관의 얼룩

우리 프로토콜 라텍스 기반의 대뇌 혈관 착색의 결과를 비교하려면, 1.5 ML EP 관 펠리칸 Scribtol Schwarz 잉크 (CB2) 900 μl를 Herlitz Stempelfarbe 잉크 (CB1) 100 μl의 혼합물을 준비하고 있습니다. 1시 9분 비율 CB1과 CB2 2 ML 혼합물의 총 볼륨을 두 EP 튜브를 준비합니다. 두 개의 인슐린 주사기 (1 혼합물을 수집ML 각). 37 ° C.까지 따뜻하게 주사기를 모자하고 물 욕조에 넣어 또 다른 두명의 인슐린 주사기에 생리 2 ML를 수집하고,뿐만 아니라 물 목욕에 배치합니다.
동물을 마취하고 papavarine 하이드로 클로라이드의 주입을 제외하고 위에서 설명한 것과 같은 절차를 반복합니다. 왼쪽 심실에 두 ML salaine의 주입 후, 카본 블랙 잉크 대신 색 라텍스의 2 ML 혼합물을 주입. ML 당 18-20 초 이상 약간의 압력 손으로 주사를 수행합니다. 주사하기 전에 내림차순 흉부 대동맥을 클립.
동물을 희생 뇌를 제거하고 사진을 찍어.
부동 뇌는 완전히 submerges 때까지 뇌의 장기 보존의 경우 (5 % 15 % 다음 다음 30 %) 점차 증가 농도 자당과 부화에 의해 PFA는 하루 아침에 다음 4퍼센트에 뇌를 넣어. 색 라텍스와 perfused 동물의 두뇌는 같은 방법으로 보존 할 수 있습니다.
을 수행또 다른 4-5 동물의 절차. 다른 유전 배경이나 변종으로 인한 뇌성 혈관 해부학의 차이를 비교하려면 각각 ApoE KO와 SV129 마우스의 동등한 수의 프로토콜을 반복합니다.
깊은 마취 (수술에 대한 자세한 설명은 본 문서의 범위를 넘어 아래에있는 MCA의 intraluminal 가림의 표준 프로토콜에 따라 45 분 또는 90 분에 과도 초점 뇌성 국소 빈혈을 유발, 허혈성 조건 하에서 혈관 해부학을 공부한다 리더는 Doeppner 외., 2010)라고합니다. 경색 볼륨을 식별 할 수 reperfusion 기간 (1 일 ~ 5 일) 계획의 끝에서 CB1 + CB2 잉크 만 사용하여 혈관 착색을 수행하고 5-10 분 동안 37 ° C에서 2% TTC 솔루션을 가지고있는 전체의 뇌를 더럽 히다 . TTC는 mitochondrial 효소 (특히 호박산 탈수소 효소)에 의해 붉은 색의 formazan으로 감소된다. TTC의 착색 후, infarcted 조직 unstai는 붉은 색의 metabolically 활성 조직 얼룩 남아있는 동안네드는와 때문에 역기능과 변성 mitochondrial 효소에 흰색 나타납니다. 위에서 설명한 것과 같은 방식으로 이미지를 수집합니다.

4. 뇌 혈관 지역의 연구

대뇌 혈관, + CB2 잉크가 ImageJ 소프트웨어 (영상 처리 및 분석에 사용되는 자바 기반의 공개 소프트웨어)를 분석 할 수 색 라텍스 또는 CB1과 뇌 중 스테인드의 등 표면의 이미지의 총 해부학을 분석 할 수 있습니다. CB1 + CB2 살포가 복부와 등쪽 표면 모두에있는 모든 선박을 착색 반면 색 라텍스와 perfused 뇌는, 등쪽 표면에있는 선박 착색의 변수도 표시 될 수 있습니다.
ImageJ 소프트웨어와 이미지 파일을 엽니 다. ACA와 MCA 사이 anastomotic 점을 확인합니다. anastomotic 포인트는 혈관 직경이 좁은 또는 각각 ACA의 가장 가까운 분기 포인트와 MCA 지점 사이의 반 거리, ² 사이트로 정의됩니다. 분할 줄 도구를 그리기의 도움과 플러그인 "점선"로 anastomotic 점을 표시하여 가상의 선 (anastomotic 선)을 그립니다.
mm의 규모를 설정합니다. anastomotic 라인과 직선 그리기 도구 및 "측정"도구를 사용하여 뇌의 전두엽 극에 꼬리 4mm의 중간 선 사이의 거리를 측정합니다. caudally 정면 극에서 6mm에서 동일한 작업을 수행. 동물 당 3-4 이미지를 분석하고 평균 값을 계산합니다. 뇌 혈관 해부학의 변화를 확인하기 위해 동물의 서로 다른 그룹 사이의 값을 비교합니다. C57Bl6 / J 동물에서 ACA와 MCA 사이의 anastomotic 라인은 caudally 정면 극에서 6mm에서보다 4mm에 가까운 중간 선을 추적 할 수 있습니다. ApoE KO 마우스는이 점에 큰 차이를 제공하지 않습니다. 한편, SV129 마우스에 anastomotic 라인은 정면 극에서 caudally 추가 및 4mm의 중간 선 모두 병렬 및 6mm 거짓말을합니다.
혈관 해부학을 분석해서N 허혈성 조건은 위에서 언급 한 동일한 계산을 수행합니다. 각각 metabolically 활성 조직 및 괴사 흠없는 조직을 대표하는 빨간색과 흰색 컬러 조직 마진로 경색 테두리를 식별합니다. 4mm에서와 뇌의 전두엽 극에서 꼬리 6mm의 중간 선에서 경색 테두리의 거리를 측정합니다. 동물 당 3-4 이미지에서 평균 값을 수집합니다. 다른 국소 빈혈 reperfusion 및 기간 사이의 결과를 비교합니다.