RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

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Method Article

RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹, Margaret Gibson¹, Suman Chaudhary¹, Li Qin Zhang¹, Daniel P. Heruth¹, Dmitry N. Grigoryev¹, Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

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요약

이 프로토콜은 다음과 같은 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 프로필 transcriptomes에 RNA-seq, 강력한 차세대 DNA 시퀀싱 기술을 적용 할 완전하고 자세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시약 또는 질병 상태에 의해 영향을 다양한 세포 나 조직에 generalizable 수 있습니다.

초록

mRNA 수준의 측정을 통해 세포의 유전자 발현의 특성은 세포의 전사 기계가 외부 신호 (예 : 약물 치료), 또는 어떻게 세포가 건강한 상태와 병에 걸린 상태 사이의 차이에 의해 영향을하는 방법을 결정하는 유용한 도구입니다. 차세대 DNA 시퀀싱 기술의 출현과 지속적인 개량을 통해 RNA-시퀀싱 (RNA-seq)는 성적 증명서의 모든 종류를 분류하기위한 모든 표현 유전자의 전사 구조를 파악하고 계량화 할 수 transcriptome 분석의 점점 인기있는 방법이되었다 주어진 셀, 조직 또는 유기체 ^1,2의 성적 증명서의 총 집합의 변화 표현 수준. RNA-seq은 점차 그 완전한 transcriptome를 프로파일의 장점을 가지고 있기 때문에, transcriptome 분석을위한 선호하는 방법으로 DNA의 microarrays를 대체하는 디지털 형 자료 (모든 증명서의 사본 번호)를 제공하고 알려진 게놈의 sequen에 의존하지 않습니다CE ^3.

여기, 우리는 함께 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포에 프로필 transcriptomes에 RNA-seq를 적용 할 수있는 완전하고 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 자격이 최근 출판 연구에 기초가 성공적으로 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 첫 번째 전체 transcriptome 분석을 수행하는 ⁴ "RNA-seq은 트롬빈으로 치료 인간의 폐 Microvascular 내피 세포의 유전자와 Isoforms의 소설 Transcriptome를 보여" 트롬빈은 RNA-seq을 사용하여 치료. 그것은 염증 조건, 암, 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환의 pathogenesis에 트롬빈로 인한 내피 기능 장애의 근간이 분자 메커니즘에 통찰력을 얻기 위해 추가 실험을위한 전례없는 자원을 굴복, 이러한 질병에 대한 치료 타겟에 대한 잠재적 인 새 리드를 제공합니다.

이 프로토콜의 설명 텍스트네 부분으로 나누어 져 있습니다. 첫 번째 부분은 트롬빈과 RNA 분리, 품질 분석 및 정량화와 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 치료에 대해 설명합니다. 두 번째 부분은 도서관 건설 및 시퀀싱에 대해 설명합니다. 세 번째 부분은 데이터 분석에 대해 설명합니다. 네 번째 부분은 RT-PCR 검증 분석을 설명합니다. 몇 가지 주요 단계를 대표 결과가 표시됩니다. 주요 단계에서의 성공을 높일 수 유용한 팁이나주의 사항은 토론 섹션에서 제공됩니다. 이 프로토콜은 트롬빈로 치료 인간의 폐 microvascular 내피 세포를 사용하지만, 그것은 포유류와 비 포유류의 세포 모두에서 서로 다른 자극이나 억제제, 또는 건강 상태 사이의 셀이나 조직에 transcriptomes를 비교로 치료 조직의 프로필 transcriptomes에 일반화 할 수 및 질병 상태.

프로토콜

이 프로토콜을 요약 순서도는 그림 1에 표시됩니다.

1. 트롬빈, RNA 분리, RNA의 품질 평가 및 정량화와 세포의 치료

5% FBS, 성장 요인 및 항생제와 EGM-2 중간에 6 잘 접시에 90~100%의 합류로 문화 인간 폐 Microvascular 내피 세포 (HMVEC-LBl) (Lonza, 고양이 # CC-3202).
기아 미디어 (0 % FBS) 이전 트롬빈 치료를 30 분에 미디어를 변경합니다.
0.05 U / ML 트롬빈으로 세포를 치료하거나 ° C 5 % CO ₂ 37에서 6 시간에 대한 제어로 치료 둡니다.
제조업체의 지침에 따라 Ambion 미르 Vana 키트를 사용하여 처리 및 제어 세포로부터 총 RNA를 분리합니다.
Experion 자동 전기 영동 역 (에서 표준 프로토콜에 따라 Experion StdSense의 진핵 세포 RNA 칩과 RNA의 품질을 평가= "_blank"> www.bio-rad.com).
표준 분광 방법을 사용하여 RNA을 수량화.

2. 도서관 건축 장면

자료를 시작으로 샘플 당 고품질의 총 RNA의 1 μg을 사용합니다.
라이브러리를 구축하려면, Illumina (프로토콜 # 15008136 목사)에서 표준 절차를 수행하십시오. 이 프로토콜에서는 폴리의 두 발 (A)가 포함 된 mRNA의 선택은 rRNA 배열을 최소화하기 위해 rRNA를 제거하는 수행됩니다.
Experion 자동 전기 영동 역 (에서 표준 프로토콜에 따라 Experion의 DNA 1K 칩을 사용하여 라이브러리의 품질 평가 www.bio-rad.com을 ).
qPCR을 사용하여 라이브러리를 수량화 : 이전에 표준 곡선과 출혈도 잡았 어댑터에 대한 특정 프리 머으로 순서가 된 라이브러리를 사용합니다. 알 수없는 라이브러리 (예 : 1:100, 1:500 및 1:1,000)의 dilutions의 범위를 사용합니다. qPCR acco를 실행SyberGreen MM 프로토콜에 rding 각 도서관의 원래 주식 농도를 계산합니다.
클러스터 흐름 셀을 할 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 10 NM하고 저장할 라이브러리 주식을 희석.
경우 클러스터 흐름 셀을 할 준비가 물 목욕에 cBot 시약 판을 해동. cBot은 클러스터 생성 과정을 간소화하는 데 사용 Illumina 악기입니다.
cBot 악기를 씻으십시오.
라이브러리를 변성 : 튜브의 측면에 13 μl 1X TE 6 μl 10 μM 라이브러리 및을 조합 한 μl 1 N NaOH를 (Illumina에서 제공)를 추가합니다. 소용돌이, 스핀 다운 5 분 동안 실온에서 배양과 얼음의 변성 라이브러리를 배치합니다.
라이브러리를 희석 : 12 PM의 최종 농도에 996 μl HT1과 4 μl 변성 라이브러리를 결합하여 사전에 차가운 하이브 리다이 제이션 버퍼로 변성 라이브러리 (HT1, Illumina에서 제공)을 희석. 얼음의 변성과 희석 라이브러리를 배치합니다.
, cBot 판의 튜브의 각 행을 반전모든 시약이 해동되어 있도록. 판 스핀 다운 / 펑크 호일 씰을 제거하고 cBot에로드합니다.
스트립 관의 희석, 변성 도서관 나누어지는 120 μl는, 1-8이라는. 제어 스파이크 -에서와 같이 각 튜브에 1.2 μl 희석, 변성 PhiX 제어 라이브러리를 (Illumina에서) 추가합니다. 소용돌이와 튜브를 스핀 다운하고 올바른 방향으로 cBot (오른쪽 튜브 # 1)을로드합니다.
cBot로 흐름 셀 및 매니 폴드를로드합니다.
흐름이 확인하고 클러스터링 실행을 시작 완료합니다.
실행이 완료되면 모든 차선에서 시약 납품을 확인합니다. 모든 이상주의하십시오. 어느 4 ° C.에서 바로 시퀀싱 실행을 시작하거나 제공된 튜브에 흐름 세포를 저장
시퀀싱 별 합성 (SBS, Illumina) 시약을 해동.
절단 믹스를 만진 후에는 다른 시약을 터치하지 않도록하고, 시약 트레이에 적절한 장소에 시약을로드합니다.
더를 사용하여N-시퀀싱 흐름 셀 (즉, 이전에 순서가되었다 하나), 주요 시약 선 두 번.
철저하게 70 % EtOH 및 렌즈 종이에 이어 70 % EtOH와 Kimwipes과 시퀀싱 흐름 세포를 청소하십시오. 모든 줄무늬의 흐름 셀을 검사합니다. 그 필요한 경우 다시 청소하십시오.
시퀀서에 흐름 셀을로드하고 매니 폴드 및 흐름 세포 사이의 인감 꽉 있는지 확인 확인 흐름을 수행합니다.
시퀀싱 실행을 시작합니다.
사람들이 실행하는 동안 제공 될 품질 측정 항목을 (클러스터 밀도를 예를 들어, 필터를 통과 클러스터, 질문 30, 강도) 평가합니다.
실행에 걸쳐 강도를 모니터링 할 수 있습니다.
101 사이클이 완료되고 나면, 두 번째 읽기 완료 처리 화학을 수행 페어 최종 시약 및 두 번째 읽기 설립 버퍼 (ICB, SBS 시약의 구성 요소, Illumina)를 해동 및 시약을로드합니다.
제 ^2는 강도, 질문 30를 참조 평가, 순서 실행을 계속실행 진행 차 기타 품질 통계를 확인할 수 있습니다.

3. 데이터 분석

각 샘플에 대해 하나의 fastq 파일의 생성을 보장하기 위해 0으로 fastq-클러스터 수를 설정. fastq 파일에 기본 통화 파일 (. BCL) 파일을 변환 할 수 CASAVA (Illumina, 현재 1.8.2)의 최신 버전을 사용 . 하류 분석을위한 fastq 파일의 압축을 풉니 다.
RNA-seq은 매우 높은 처리량 짧은 읽기 aligner (Bowtie, 0.12.7) ⁶ SAMtools을 (0.1 사용 포유류의 크기 genomes을 읽어 정렬 TopHat (1.4.1) ^5의 최신 버전을 사용하여 쌍으로 최종 정렬을 수행합니다. 17) ^7. SAMtools는 SAM 형식의 후 처리 정렬을위한 다양한 유틸리티를 구현합니다. 참조 인간 transcriptome는 iGenomes (에서 다운로드 할 수 있습니다 www.illumina.com ). TopHat를 실행, 우리는 FR-unstranded (기본값)로 라이브러리 유형 옵션을 포함한 모든 기본 매개 변수 설정을 사용했습니다.
우리⁸ 소프트웨어 패키지 프로그램 CuffDiff, 커프스 단추의 일부를 (1.3.0) 들죠, 인간의 참조 transcriptome에 따라 이전에 differentially 표현 유전자 성적 증명서를 화면에 컨트롤 세포에 트롬빈 - 처리 세포를 비교합니다. 이 비교 알려진 성적 차등 표현을 감지합니다. 테이블 형태의 결과를 시각화하기 위해 Microsoft Excel을 사용합니다. 커프스 단추 프로그램을 실행에서, 우리는 모든 기본 매개 변수 설정을 사용했습니다. FPKM <0.05 및 P>있는 사람 유전자 성적은 0.05는 제외됩니다.
소설 isoforms을 검색하려면, 참조 transcriptome없이 커프스 단추를 실행합니다. Cuffcompare를 사용하여 참조 게놈에 샘플 스크립트 파일을 비교 한 분석을위한 참조 게놈과 두 번째 분석을위한 참조 게놈으로 통합 제어 스크립트 파일로 결합 된 트롬빈 대본 파일을 사용 Cuffdiff으로 차등 표현을 테스트합니다. 표 형식의 결과를 시각화하기 위해 Microsoft Excel을 사용합니다. 다시 도스FPKM <0.05 및 P>과 전자 유전자 성적은 0.05는 제외됩니다. 이 단계 후, 조사관은 UCSC 게놈 브라우저 웹 사이트 (에 새로보고 된 성적 증명서의 목록을 업로드하도록 선택할 수 있습니다 http://genome.ucsc.edu/ 수동으로 검사하여 유효성을 확인하기 위해).
독창성 경로 분석 (IPA에 differentially 표현 유전자의 목록을 제출 www.ingenuity.com 트롬빈 치료에 의해 영향을 유전자 및 경로의 특성을 위해). 이 단계에서, 수사관들이 CummeRbund (사용하도록 선택할 수 있습니다 http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ 시각화, 관리 할 수 있도록), 커프스 단추 RNA-seq 출력을 분석하는 작업을 지원하고 단순화하도록 설계되었습니다 R 패키지를, 그리고 Cuffdiff 분석에 의해 생산의 모든 데이터를 통합 할 수 있습니다.

4. 수량 실시간 - 포에 의한 RNA-seq 결과의 유효성을 검사lymerase의 연쇄 반응 (qRT-PCR)

제어 및 트롬빈 - 처리 HMVEC - LBl 세포 RNA 품질 평가 및 1.6 단계 1.4에 설명 된 RNA의 정량화에서 총 RNA 격리를 수행합니다.
제조업체의 지침 (Invitrogen, 18080-051)에 따라 윗 첨자 III 1 스트랜드 합성 시스템 RT 키트 각 샘플의 1 μg 총 RNA에서 DNA 보완를 생성 할 수 있습니다.
CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor의 검출을위한 Taqman 분석 주문형 설계 oligonucleotides를 사용하여 응용 Biosystems ViiA 7 리얼 타임 PCR 시스템에 qRT-PCR 분석을 수행 - 관련 인자 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) 및 β-고를 (ACTB, Hs99999903_m1). 각 샘플은 총 RNA의 5 NG에 해당 템플릿을했습니다. DDCt 방법을 사용 quantitation를 측정하고 β-고를를 정상화. 각 분석은 복제 적어도 세 생물학에 걸쳐 수행되었다.