대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

요약

CyTOF 질량 cytometer의 성능의 일상 튜닝 및 최적화에 필요한 단계에 설명되어 있습니다. 최적의 샘플 준비와 유량의 댓글이 논의

초록

최근 몇 년 동안, 단일 세포의 급속한 분석은 일반적으로 유동 세포 계측법과 휘황-라벨 항체를 사용하여 수행되었습니다. 그러나, 형광 방출의 스펙트럼 중복의 문제는 동시 프로브의 수를 제한하고 있습니다. 반면, 오히려 fluorophores보다 ICP-MS. ¹ 액체 단일 셀 도입 시스템 DVS 과학 커플의 새로운 CyTOF 질량 cytometer는 매우 강화 금속 동위 원소를 포함하는 킬레이트 화 고분자는 항체 또는 기타 특정 프로브에 연결된다. ^2-5가 때문에 금속 순도와 질량 cytometer의 대량 해상도, 인근 동위 원소로부터 "스펙트럼 중복"은 없습니다, 따라서 보상 매트릭스 필요. 또한, 란탄 족 금속의 사용으로 인해, autofluorescence 대한 동등한 따라서 거기에는 생물학적 배경이 없습니다합니다. 원자 질량 103-203, 이론적으로 최대 100 레이블이 동시에 구별 할 수에 걸쳐 대량 창을 갖추고 있습니다. 현재, 35 개 이상의 채널 샘플 면역 프로파일의 전례 절개를 허용 DVS 과학에서 사용할 수있는 킬레이트 시약을 사용하여 사용할 수 있습니다. ^6-7

대량 세포 계측법에 단점은 프로브 당 별도의 금속 동위 원소 (앞으로 또는 측면 분산 가능성이 이에 상응하는 금액),하고 파괴적인 기술 (복구를 정렬의 어떠한 가능성)이라는 사실에 대한 엄격한 요구 사항이 포함되어 있습니다. 대량 cytometer의 현재 구성도 만의 셀 전송 속도 ~ 25 %, 따라서 세포의 높은 입력 번호를 필요가 있습니다.

대량 cytometer의 최적의 일일 실적은 몇 가지 단계가 필요합니다. 최적화의 기본 목표는 M 신호 강도를 줄이고 M 16에서 원하는 신호를 방해한다는 산화물 (M 16)의 형성을 최소화하면서 원하는 금속 동위 원소 (M)의 측정 신호 강도를 극대화하는 것입니다. 첫 번째 단계는 시스템 때문에 고온, 안정적 I을 따뜻하게하는 것입니다CP 플라즈마가 설립되었습니다. 둘째, 현재와 메이크업 가스 유량에 대한 설정은 매일 최적화해야합니다. 샘플 수집하는 동안, 최대 셀 이벤트 요금은 검출기 효율과 처리 속도 1,000 세포 / 초에 의해 제한됩니다. 그러나, 느린 셀 이벤트 속도 (300-500 셀 / 초)은 샘플의 품질에 따라 보통 셀 이벤트 사이하므로 더 나은 해상도가 doublets와 파편을 통해 그대로 singlets을 극대화 할 수 있도록하는 것이 바람직하다. 마지막으로 하루의 끝에 기계의 적절한 청소는 무료 금속에 의한 배경 신호를 최소화하는 데 도움이됩니다.

프로토콜

CyTOF의 모든 세포 샘플은 고정 per​​meabilized해야합니다. 이 이리듐 함유 DNA의 intercalator의 큰 항목을 가능하게하고, 또한 대량 cytometer에 주입하기 전에 즉시 MilliQ 물 세척 및 resuspension 단계 동안 세포 용해를 방지 할 수 있습니다.

1. 시작 - 최대 질량 Cytometer의

1. CyTOF 소프트웨어 프로그램을 엽니 다. 악기 설정을 선택합니다. 카드 케이지 탭에서 오른쪽 하단 모서리로 이동하고 버​​튼을 "ON"히터를 클릭합니다. 200 ° C.에 도달하는 스프레이 챔버 맨틀에 대한 충분한 시간을 허용하도록 히터에 원하는 시간 전에 적어도 15 분을 돌려
2. MilliQ 물로 가득 찬 신선한 주사기와 주사기 펌프에 흰색 규격-Ject 3 ML의 주사기를 교체합니다.
3. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 청소. 작은 액체 소개 포트와 큰 가스​​ 도입 포트 모두를 통해 5% citranox 2 ~ 3 배를 끌어 주사기와 튜브를 사용하여 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 Backflush. MilliQ 물 t으로 backflushing 반복잔여 citranox를 제거 O.
4. CyTOF의 전면 패널에있는 표시등은 그림 1에서와 같이 불이되어 있는지 확인하십시오.

시작하기 전에 그림 1. CyTOF 패널 등.

5. 아르곤 가스 탱크 밸브를 엽니 다. 이 켜하기 위해 전면에있는 '아르곤'빛의 원인이됩니다.
6. 가스 유입을 업 할 수있는 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 연결합니다. 나사가 빠지다 가스 튜브 커넥터를 메이크업과 검은 색 고무 O-링과 흰색 원뿔 플라스틱 조각을 제거합니다. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 가스 도입 포트 줄기에있는 넓은 "마디"를합니다. 가스 도입 포트에 커넥터를 배치합니다. 가스 포트의 끝 부분 위에 검은 색 O-링을 배치하고, 포트 줄기의 넓은 부분을 통과 O-링을 강제로. 화장 가스 튜브로 하얀 원뿔 플라스틱 지적 좁은 끝으로 상단에 작품과 나사를 배치합니다.
7. 액체 소개 관에 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 첨부합니다. 조심스럽게 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 끝에 개통에 작은 튜브를 삽입합니다. micropipettor에 정류장에 느끼는 유사한 두 정거장이 될 것입니다. 당신은 가벼운 저항을 만날 때까지 첫째, 키를 눌러, 작은 튜브의 끝은 유리의 직선 섹션의 끝 부분에 있어야합니다. 둘째, 피팅에 더욱 유리의 직선 부분의 끝을 강제하기 위해 더 열심히 눌러 밀봉 할 나사 피팅 조입니다. 가열 망태에있는 하얀 개방에 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 끝을 삽입합니다.
8. 악기 설정 창 RFG 컨트롤러 탭에서 "시작 플라즈마"를 누르십시오. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요이 이미 삽입되어 있기 때문에, "OK"를 누릅니다. 이 소프트웨어는, 냉각기를 켜 가스의 흐름을 시작하고 플라즈마에 불을 지필 것입니다. 검출기 전압 두는 것입니다. 완료되면 "플라즈마 시동 순서가 성공적으로 완료되었습니다"라는 팝업 창이있을 것이다; 보도 "OK". 새로운 불빛 (그림 2 전면 패널에에 있어야합니다 >).

그림 2. 플라즈마 점화 및 시동 성공적으로 완료 CyTOF 패널 등 후.

9. 주사기 펌프 켜기. 오른쪽 상단에서 주사기 펌프를 시작하고 튜브를 통해 액체를 흐르는과 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요에서 분사를 시작 녹색 '재생'버튼을 누릅니다. 기본 주사기 설정 물 3 ML위한 것입니다. 이 물 부족하면 샘플 샘플 루프를 통해 흐르는 될 위해서는, 주사기 펌프는 주기적으로 변경해야합니다. 화면의 상단에 액체가 주사기 펌프 밖으로 흘러이 얼마나 나타내는 카운터가 있습니다. 주사기 펌프이 카운터가 주사기의 끝을 도달 "3.000"또는 플런저에 도달 할 때 중단됩니다. 주사기를 충진 할 때, "그만하세요"가 아닌 카운터를 재설정 할 수있는 파란색 '일시 중지'버튼을 누르해야합니다.

대량 Cytometer의 전자 "> 2. 매일 보정

1. 대량 cytometer는 보정 전에 뜨거운 안정적인 플라즈마를 달성하기 위해 약 20 분 필요합니다. 높은 가치의 3 % 이하 신호, 조정 단계의 목적은 "Gd155"을 (La139 + O16 산화) 유지하면서 Tm169 또는 Tb159의 원하는 신호를 극대화하는 것입니다. 데이터 수집 설정 창을 엽니 다 수집 설정 버튼을 클릭합니다. Analytes 탭에서 동위 원소 선택 패널을 열려면 주기적으로 테이블을 클릭합니다. 설명서에 나와있는 DVS 과학 튜닝 솔루션에서 동위 원소를 선택한 다음, '저장'을 클릭합니다.
2. 읽기 창 당 질량을 (ES) 열 버튼을 읽기 당 동위 원소를 클릭합니다. 새 번호를 입력하고 "입력"키를 눌러 "펄스 카운트", 그리고 rescale y 축을 선택합니다.
3. 튜닝 솔루션을 그린 한 ML 규격 - Ject의 주사기를 채우십시오. "로드"를 샘플 포트 선택기를 돌려, 튜닝 솔루션 450 μl를 삽입 한 다음 '삽입'할 수있는 선택기를 켜십시오. 데이터 Acquisit의 질량 보정 탭에서 이온 설정 창은 군중에 의해 흐르는되는 모니터링하기 위해 '실행'을 누르십시오. 오른쪽은 높은 질량 상태에서 창 왼쪽은 낮은 질량입니다. 참고 : 이미 아르곤 가스의 크세논의 동위 원소 (그림 3)에 의한 TOF 9400-9800 지역에서 신호가있을 것입니다. 튜닝 솔루션 동위 원소가 디스플레이에 줄무늬 (그림 4)로 표시되기 시작 때까지 기다리십시오.

세탁 솔루션과 물 헹굼 후 다양한 동위 원소에 대한 배경 수준을 보여주는 그림 3. 질량 보정 탭 창. TOF 9400-9800 주변 지역은 아르곤 가스의 크세논의 동위 원소에 해당하는, 항상 존재해야합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 4. 질량 보정 탭 창, DVS 튜닝 솔루션의 다양한 동위 원소에 대한 수직 줄무늬를 보여주는이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

4. 창을 읽기 당 질량 (ES)로 돌아가서 왼쪽 상단 모서리에있는 녹색 "재생"버튼을 누르십시오. 단계 2.1에서 선택한 각 동위 원소는 다른 색 선으로 표시됩니다. 기본 x 축은 초에 "시간"입니다. 사람들이 안정된 때까지 서로 다른 동위 원소의 양을 모니터링 할 수 있습니다.
5. 현재의 조정. 데이터 수집 설정 윈도우의 매개 변수 탭에서 드롭 다운 메뉴에서 '현재'를 선택합니다. = 0, 마무리 = 10, 단계 값 = 0.5, 정착 시간 = 200을 시작하자,하고 '저장'을 누릅니다. 읽기 창 히트 플레이 당 질량 (ES)에 돌아 가기를 클릭합니다. x 축은 이제 "현재"입니다. 참고 곳 동위 원소 피크 (그림 5), 그리고 R의 신호 ecord. 악기 설정 창 DAC 채널 설정 탭에서 '현재'아래로 스크롤하고 새 값을 입력합니다. 보도는 "실제 현재 값을 설정"을 선택한 다음 "저장"을 클릭하십시오.

그림 5. 현재 튜닝 프로필.

6. 화장 가스의 조정. 드롭 다운 메뉴 변경 '메이크업 가스를. " = 0.95, 단계 값 = 0.05, 정착 시간 = 200 = 0.55, 최종을 시작하자. 저장을 누릅니다. 읽기 창 히트 플레이 당 질량 (ES)로 돌아 가기. x 축은 이제 "메이크업 가스"유량입니다. 기록 곳 동위 원소 피크의 신호. 끝 부분의 "Gd155"신호 (그림 6)의 급속한 증가를 관찰. DAC 채널 설정 탭으로 돌아 가기로 "메이크업 가스"를 아래로 스크롤하고 새 값을 입력합니다. 보도는 "실제 현재 값을 설정"을 선택한 다음 "저장"을 클릭하십시오.

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그림 6. 메이크업 가스 조정 프로필.

7. 의 녹화 비율은 동위 원소 대 산화물을 원하는. 튜닝 솔루션의 두 번째 450 μl 주사를합니다. 매개 변수 탭에서 드롭 다운 메뉴에서 "시간"을 선택, 시간 = 200 정착, = 0, 최종에게 = 10, 단계 값 = 1을 시작해보세요. "저장"을 누르십시오. 창을 읽기에 따라 대용량의 '재생'(ES)를 누르십시오. 라인 (그림 7) 안정화 한 후 Tm169 또는 Tb159 (높은 값)에 대한 왼쪽 상단 상자에 값을 읽어 커서를 사용하고 또한 "Gd155"값 (높은 값의 <3 %). 이 값은 나중에 참조 할 수 있도록 조정 파일에 저장할 수 있습니다.

그림 7. 현재 및 메이크업 가스를 최적화 한 후 튜닝 솔루션 신호 강도의 측정.

8. 샘 청소ple 루프. DVS 워시 솔루션 500 μl 다음, 샘플 루프를 통해 MilliQ 물 3 ML를 삽입. 질량 보정 탭에서 "실행"을 눌러 청소의 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다. 줄무늬의 강도는 (그림 4) 배경 수준 (그림 3)으로까지 MilliQ 물 및 모니터 3 ML에 따라 다음 감소하기 시작 때까지 씻는다.

3. 실행 샘플

1. 취득 창을 엽니 다. 기본 설정 : 즉석에서 분석 = 수행 = 듀얼, 듀얼 카운트 보정 = 데이터를 분석하는 신호. 노이즈 감소가 선택됩니다. 원하는 경우 다음의이 변경 될 수 있습니다. 파일 이름을 입력합니다. 모든 파일은 E의 :/ / 드라이브에 저장해야합니다.
2. 인수 지연을 설정합니다. 샘플 루프와 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 사이의 튜브의 길이에 따라 약 30 초의 전지 이벤트를 등록에 다소 시간이 지연 될 수 있습니다. 따라서, 합 "취득 지연"총과 "감지기 세인트능력 지연은 "최소 30 초이어야합니다. 탐지기 안정성 지연은 적어도 20 초이어야합니다.
3. 데이터 수집 시간을 설정합니다. "취득 시간은"당신이 샘플을 실행하려면 시간 (초)입니다. 전체 450 μl 샘플 루프를 작성하면 600 초 완료 할 필요합니다. 그것은 50-100 초는 샘플을 수행 오버 최소화하기 위해 런타임의 마지막에 추가하는 것이 좋습니다.
4. 시료의 Resuspension. 기계에 염분의 빌드 업 최소화하기 위해, 그것은 MilliQ 물에서 최종 resuspension 다음, 세포 염색의 끝에서 MilliQ 물에서 적어도 두 개의 세차가 완료하는 것이 좋습니다. MilliQ 물의 볼륨 펠릿은 당신이 시작 셀 및 전체 염색 절차 후 세포 회복의 수에 따라 달라집니다 셀을 resuspend하는 데 사용됩니다. 좋은 시작 장소는 10 ⁶ (시작) 셀 / ML입니다. resuspension 후, 응집체를 제거 할 셀 스트레이너를 통해 필터링합니다.
5. 시작 샘플 실행합니다. 현재 샘플에 대한 새 파일 이름을 입력합니다. , "로드"샘플을 삽입, 취득 창에서 다음 누르 "실행"을 "주입"로 전환하려면 샘플 루프 밸브를 전환합니다.
6. 셀 이벤트를 등록. 셀은 각 수직 동위 원소 / 마커 채널 (그림 8)에서 마르크의 수평 모음으로 스냅 샷 창에 표시됩니다. 대량 cytometer 1,000 세포 / 초를 등록 할 수 있지만, 셀 이벤트 사이의 더 나은 해상도는 일반적으로 300-500 셀 / 초에서 얻어진다. 이 ~ 1 셀 / 화면 재생의 평균에 해당합니다. 셀 이벤트 카운터가 뜨기 시작하기 전에 30 초까지 걸릴 수 있습니다. 이것은 "에 On-The-Fly"데이터 처리로 인해, 더 셀 이벤트 정보가 손실되지 않습니다.

8 그림. 샘플 동안 수집 창에 별도의 세 가지 세포 사건과 관련된 요소에 해당하는 장소의 수평 행을 보여 실행할 수 있습니다.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 세포 사건의 품질. 각 동위 원소 채널뿐만 아니라 셀 이벤트 요금 좋겠어 어떤 배경을 확인할 수 있습니다. 대량 cytometer는 배경 위에 신호의 특정 증가로 "셀 이벤트", 이렇게 무료로 금속 또는 언 바운드 항체는 "셀 이벤트"수를 변경할 수에서 배경 신호를 인식합니다. 또한, 너무 높은 농도에서 세포를 실행하는 것은 쌍으로 된 것 이벤트의 증가 된 수의 원인이 될 수 있습니다. 배경은 추가 세차 이상 세포 희석가 감소 할 수 있습니다. Doublets이 증가 런타임의 비용에서 큰 세포 희석하여 최소화 할 수 있습니다.
8. 샘플 데이터 수집을 완료. 수집 시간에 도달하면 데이터 수집이 완료된다. 있는 팝업 창이하기 전에 약간의가있을 것 "OK"버튼이 나타납니다, 다시이 '에 On-The-Fly "데이터 처리 때문입니다. 샘플 획득도 premat 중지 할 수 있습니다urely "중지"버튼을 눌러. 이 경우 이미 등록 모든 셀 이벤트는 출력 파일에 포함하여 처리됩니다.
9. 각 샘플 사이의 MilliQ 물을 적어도 500 μl의 주입은 또한 샘플 carryover를 최소화하는 데 도움이됩니다.

4. 사용 후 기계 청소

1. 솔루션을 씻으십시오. 최종 샘플을 실행하고 물 플러시 샘플 루프, 샘플 루프로 세척 솔루션의 450 μl를 삽입 한 후. 단계 2.8에서와 같이 데이터 수집 설정 창 (그림 9)의 질량 보정 탭에서 무료로 금속의 릴리스를 모니터링 할 수 있습니다. 무료 금속 신호가 감소하기 시작하면, MilliQ 물 3 ML로 플러시하고 배경 수준이 달성 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다.

DVS 워시 솔루션과 사후 운영 청소하는 동안 그림 9. 질량 보정 탭 창,. TOF 지역 9800-11000의 수직 줄무늬는 기계 청소하는 항체 - 라벨 동위 원소입니다. TOF 11,500 주변의 수직 줄무늬가 두 적외선 intercalator의 동위 원소에 해당합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

5. 컴퓨터를 종료

1. 악기 설정 창 RFG 컨트롤러 탭에서 "플라즈마를 중지"를 선택합니다. 절차가 완료되면 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 제거하라는 팝업 창이있을 것입니다. "OK"를 누릅니다. 카드 케이지 탭에서 히터를 끄십시오. 아르곤 공급 장치의 밸브를 닫습니다.
2. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 제거. 조심스럽게 뒤로 당겨 스프레이 챔버에서 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 제거합니다. 나사가 빠지다 샘플 소개 단계 1.6에서 관 그리고 옆 넣습니다. 약간 느슨하게하기 위해 돌려서 메이크업 가스 도입 연결 한 다음, 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 당긴다. 함께 망 피팅으로 남겨두면 리터의 가능성을 줄일 수 있습니다검은 색 고무 O-링과 흰색 원뿔 플라스틱 조각을 osing.
3. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 청소. 단계 1.3에서와 같이 주사기와 튜브를 사용하여 5 %의 citranox과 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 두 포트를 Backflush. 스토어, 다음 사용 때까지 5 % citranox에 덮여.

결과

위의 프로토콜을 따르면 네 가지를 달성해야합니다. 첫째, 대량 cytometer를위한 충분한 워밍업 시간을 허용하는 것은 최적의 신호와 최소한의 산화물 형성에 필요한 뜨거운, 안정적 플라즈마를 생성합니다. MilliQ 물과 DVS 워시 솔루션 (그림 9)와 대량 cytometer의 두 번째, 적절한 세척은 (그림 8) 샘플 수집하는 동안 배경을 감소하는 데 도움이, 금속 흡착의 수준 튜브와 기계의...

토론

지난 몇 수십 년 동안 형광 유동 세포 계측법은 표면 표현의 측면과 기능 assays에서 모두 단일 세포를 분석 주력 방법이었습니다. 그러나, 형광 염료의 스펙트럼 중복의 문제가 동시에 마커의 수를 제한하고 있습니다. 12 개 이상의 동시 마커를 사용하여 실험이보고 된 반면, 필요한 보상의 양이 기술적으로 어려워집니다.

대신 fluorophores의, 대량 세포 계측법은 항체에 대한 라?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
CyTOF TM 대량 cytometer	DVS 과학
솔루션을 씻으십시오	DVS 과학	201071	물에 0.05 % 불화 수소산 산
솔루션을 튜닝	DVS 과학	201072	0.5 ppm으로 라, CS, TB, TM, IR, 추적 질산
유럽​​ 연합 (EU) 함유 폴리스티렌 구슬	DVS 과학	201073	약 1,000,000 / ML에서 제공 구슬, 자연 풍부한 유럽 연합 (EU) 동위 원소를 포함
멀티 란탄 족 함유 (라 / 홍보 / TB / TM / 루) - 폴리스티렌 구슬	DVS 과학	아직 상업적으로에 사용할 수	등록 된 란탄 계열 원소의 자연 풍부한 동위 원소를 포함
질산 (집중)	피셔 과학	A467-500	Optima 추적 메탈 순수 ICP-MS 학년
폴리스티렌 내내 아래로 튜브 셀 스트레이너 캡-5mL로	BD	352235	주입하기 전에 세포 샘플을 필터링하는 데 사용
규격 - Ject tuberkulin 주사기-1mL	헨케 말대꾸 늑대	4010-200V0	실리콘 무료, 라텍스 무료
규격 - Ject의 주사기-3 ML	헨케 말대꾸 늑대	4010.000V0	실리콘 무료, 라텍스 무료
MilliQ 물			18 MΩ 순수한 물, 유리 또는 상업적 세제 (바륨 현재의 높은 수준으로 인해)으로 세척 한 플라스틱 병에 저장해서는 안됩니다.
Citranox	시그마 - 알드리치	Z273236	산성 세제
아르곤 가스	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999 % 초 고순도