자유롭게 미생물 수영의 양적 운동 연구는 레이저 회절을 사용하여

요약

자유 수영 선충류와 같은 미세한 미생물 C. elegans 생활하고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 우리는 분석을 제공하는 새로운 접근 방식을보고 C. elegans 회절 패턴을 사용합니다. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다.

초록

토양 및 수생 미세한 미생물들은 살고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 미세 유기체의 행동의 대부분은 연구 반면, 우리는 실시간 분석을 제공하는 새로운 분석 방법을 제시 좁은 거의 2 차원 초점 필드에 움직임과 행동을 제한 현미경 기반의 접근 방법 ^1.를 사용하여 수행되었습니다 자유롭게 C. 수영 현미경 기반의 장비에 의존하지 않고 큐벳에서 elegans. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다. 우리는 자유롭게 수영을 nematodes에 대한 진동 주파수를 측정합니다.

원방 회절 패턴 분석 nematodes의 파형에 대한 단서를 드러내고있다. 회절은 개체 주위에 절곡 빛의 과정입니다. 이 경우에는 빛이 생물에 의해 diffracted입니다. 빛 파도가 방해 및 광고 게재를 형성 할 수iffraction 패턴. 화면에 객체 거리가 diffracting 객체보다 훨씬 큰 경우 멀리 필드, 또는 Fraunhofer, 회절 패턴이 형성된다. 이 경우 회절 패턴은 푸리에 변환을 사용하여 (모델화) 계산 될 수있다. ²

C. elegans의 세 차원에서 탐색 무료 생활 토양 - 사는 nematodes 있습니다. 그들은 크롤링라는 정현파 locomotory 패턴과 수영라는 다른 패턴의 액체에서 흙이나 한천 같은 고체 매트릭스에 모두 이동합니다. ³ 역할은 mechanosensory, chemosensory 및 locomotory에 플라스틱 변경 사항을 적용 thermosensory 세포에 의해 제공 감각 정보에 의해 연주 패턴에 패턴 및 스위치는 elucidated 수하기 시작합니다. 우리는 현미경을 필요로하지 않습니다 그리고 우리가 다른 공동에서 선충류의 운동의 복잡성을 탐험하기 시작 할 수있게 될 것 가로, 세로, 높이로 선충류의 운동을 측정하는 광학 방식을 설명 ⁴nditions.

프로토콜

1. C. 비디오 분석을위한 elegans 준비

1. 얇은 플랫 백금 와이어 곡괭이를 사용하여 신선한 NGM 한천이 가득한 페트리 접시에 10-20 gravid 성인 nematodes를 이동합니다. NGM 한천로 가득 페트리 요리 E.의 작은 원형 반점을 포함 대장균 먹을 수 nematodes에 대한 (성장 제한 스트레인, OP50은 최상의 결과를 제공합니다). nematodes은 3-5 시간에 알을 낳기 위해 허용하고 따라서 50-150 nematodes의 작은 발달 - 동기화 문화를 확립, 성인을 제거합니다. nematodes 4-5 일 동안 20 ° C에서 페트리 접시를 잠복기에 의해 초기 성인기로 성장할 수 있습니다. 이러한 문화 방식은 설립 절차 (Stiernagle 2006)을 기반으로합니다. ⁵
2. 비디오 분석의 일에 따라서 동기화 문화 50-150 웜를 수집, deionized, 증류수 1 ML과 젊은 성인 nematodes의 접시를 플러시. M9 또는 PBS와 같은 완충 용액도 사용하실 수 있습니다. w를 회전 할 microcentrifuge를 사용하여튜브의 하단하거나 15 분 동안 중력에 의해 정착 할 수 있도록 orms. 관에서 물의 대부분을 제거하고 nematodes에서 모든 준수 세균을 씻어하기 위해 deionized, 증류수 1 ML로 교체.
3. micropipette를 사용하여 석영 큐벳에 물이나 버퍼에 nematodes을 전송합니다. 한 번에 한 선충류는 레이저로 조명 될 가능성이 있도록이 한 번 또는 더 적은에서 총 5-10 nematodes에 대해, 적은 수의 작업하는 것이 중요합니다. 문화 접시에 nematodes의 숫자가 너무 큰 경우에는 원하는 밀도에 도달 할 때까지 물이나 버퍼에있는 벌레를 희석. 그것은을 씻고 큐벳에 개별 웜을 전송하는 새로운 한천 플레이트에 물이나 버퍼의 한 방울에 개별 nematodes을 선택하는 것도 가능합니다. 우리의 연구에서 우리는 행동을 수영에 대한 물리적 제약의 효과를 조사 할 1mm, 2 mm와 5mm 큐벳 크기를 사용했습니다.

2. 비디오 Analysi에 대한 광학 설정에스

1. 할 수있는 543 나노 미터 (녹색) 헬륨 - 네온 (HeNe) 레이저, 두 전면 표면 알루미늄 거울, 큐벳 홀더, 프로젝션 스크린, 고속 카메라 (건반 고속 Exilim)를 사용하여 그림 1에 표시된 설정을 수행 ~ 240 FPS에서 촬영. 두 거울은 큐벳을 통해 레이저 빔을 조정하는 데 사용됩니다. 큐벳의 다른 크기는 연구의 특성에 따라 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 수영 주파수 공간 제약의 효과를 표시 할 수 두께 5mm 아르 큐벳를 사용했습니다. 레이저 빔은 오버 샘플링을위한 요구 사항을 충족해야하며. 즉, 조직은 레이저 빔의 더 이상보다 세째을 방해한다. C.에 대한 이 선충류와 상호 작용하는 경우 elegans는 레이저 빔의 직경은 약 2 mm해야합니다. 회절 패턴이 찾을 어려울 수 있기 때문에 레이저 빔 직경 5mm보다 클 수 없습니다. 화면에 diffracting 유기체의 거리보다 훨씬 커야합니다유기체 자체.
2. 장소는 큐벳의 맨 위에 parafilm과 물 열에 nematodes를 섞어을 반전. 웜은 큐벳의 상단에 처음하는 일이 없도록 큐벳 홀더에 큐벳를 놓습니다. 거울 사용하여 큐벳의 중심을 통해 레이저 빔을 조종. nematodes은 물보다 밀도가 있기 때문에 같은 시간에 물이 항목에서 수영을하는 동안, 그들은 천천히, 큐벳의 바닥에 떨어질 것입니다.
3. 전송 빔이 투영 화면 (그림 2) 충족 투영 화면, 색상에 검은 전송 레이저 빔에 해당하는 곳 분산을 줄일 수 있습니다. 또는 전송 빔이 화면을 통과 할 수 있도록 투영 화면에 구멍을 넣어. 제거하거나 전송 빔의 산란을 줄여하면 전송 빔으로 인해 포화에서 카메라의 CCD 어레이를 유지합니다.
4. 회절 패턴의 크기의 측정을 캡처하려면이 줄을 긋다diffracted 빛 이미지 방해없이 전송 레이저 빔 스폿 옆에 투영 화면에 대한 5cm.
5. 객실 빛에 따라서 5cm 라인 회절 이미지와 같은 장면에 있다는 것입니다 동안 카메라로 녹화를 시작합니다. 객실 라이트를 켜십시오. 카메라 화면에 기록 회절 이미지 웜은 레이저 빔을 통과 있습니다.

3. 비디오 데이터 준비

1. : 비디오 분석 프로그램 (로거 프로 설치 http://www.vernier.com/products/software/lp/를 컴퓨터에). 비디오 분석 프로그램에 비디오를 가져 오기
2. 전송 레이저 스폿과 일치 할 수있는 근원을 설정합니다. 투영 화면에 5cm 줄을 사용 규모를 설정합니다.
3. 비디오 분석 소프트웨어를 사용하여 각 선충류에 의해 형성된 회절 이미지의 각도 변위 (그림 3)을 추적
4. angula를 찾으려면스프레드 시트 (엑셀)로 아크 탄젠트 (Y / X), 복사 및 붙여 넣기 데이터를 복용하고 연속 그래프 (Figure. 4) 생산 모든 부정적인 각도 180 ℃ 일 또는 π를 추가하여 R 변위.

4. 수영 주파수의 실시간 관찰을위한 실시간 데이터 수집

1. 비디오 분석을위한 동일한 설정을 사용하여 마우스 오른쪽 투영 화면의 앞의 회절 패턴에 중심을 벗어난 작은 영역 (~ 1mm ^2)와 포토 다이오드를 (ThorLabs에서 DET10A) 넣습니다.
2. USB 포트를 통해 컴퓨터에 연결하는 디지털 오실로스코프 (피코 기술에 의해 만들어진 PicoScope)에 포토 다이오드를 연결합니다. 컴퓨터 화면에서 대패 패턴을 관찰합니다.
3. ASCII 또는 텍스트 형식으로 인수 데이터 세트를 저장합니다.

5. 데이터 분석

1. 데이터가 치 평방 최소화를 사용하여 피팅 파형 할 수있는 데이터 분석 프로그램에 비디오 나 포토 다이오드를 사용하여 획득 가져 오기. 여기에 사용 된 프로그램은 (출처 http://www.originlab.com/ ). 탈곡 주파수를 (도 4 및 5) 결정하는 정현파 곡선을 맞추기.
2. 평균 수영장 다양한 샘플의 주파수와 편차를 결정합니다. 본 연구의 경우, 데이터는 통계적으로 Bonferroni 다중 비교 테스트에 이어 단일 요소 ANOVA를 사용하여 분석 하였다. <0.05의 P-값은 통계적으로 의미있는 것으로 간주되었다.

6. 예를 들어 Mathematica를 사용하여 모델 회절 패턴

참고 : 회절 패턴은 여러 가지 계산 도구를 사용하여 모델링 할 수 있습니다. 이 절차는 MATLAB, 엑셀 등 다양한 전산 도구, 원산지 등에 다를 수 있습니다

1. 이미지 만들기 : 전통 현미경을 사용하여 현미경 슬라이드에 nematodes의 이미지를보십시오.
2. 이미지를 Binarize : 가져 오기 웜 이미지 '웜'전Mathematica로 이미지를 드래그하여 n 인물 Mathematica. 흑백 이미지 (binarize)로 이미지를 변환합니다. 이 작업은 Mathematica의 'Binarize'명령으로 달성 될 수있다 : BlackandWhiteImage = Binarize [웜]. 이미지가 흑백 이미지로 볼 수 있습니다.
   EdgeDetect [웜, 6.0,0.035] 두 후행 숫자가 결과 가장자리의 거침을 제어 : 또는 BlackandWhiteImage을 만들 수있는 'EdgeDetect'명령을 사용합니다.
3. 0과 사랑하는 사람들의 행렬로 이미지를 변환 :이은 Mathematica의 'ImageData'명령으로 달성 될 수있다 : 매트릭스 = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. 푸리에 변환 매트릭스 : 지정된 FourierParameters를 사용하여 행렬을 변환 푸리에에 Mathematica의 '푸리에'명령을 사용하여 FTransform = 푸리에 [매트릭스, FourierParameters -> {0, -2}].
5. 매트릭스의 광장 계수는 회절 매트릭스를 얻을 및 이미지 대비를 개선하는 방법은 다음과 같습니다 절대 광장매트릭스의 값과 원본 이미지에 해당하는 회절 패턴입니다 결과 이​​미지를 볼 수 있습니다. 또한, 이미지의 대비를 확장 할 수있는 '로그'기능을 사용 ImageContrast = 이미지 [로그 [1 + (ABS [FTransform]) ^ 2] / 0.5].
6. 쉽게 볼 이미지 크기 조정 내기 : 중앙 회절 패턴을하고 원하는대로 조정될 크기 : ImageResize [ImageContrast [Y, 100], 500].
7. 자유롭게 헤엄 웜에서 얻은 회절 패턴과 모델을 회절 패턴을 비교합니다. (그림 6)

결과

예를 들어, 우리는 C.을 공부 다양한 석영 큐벳 1cm, 두께 5mm와 4cm 높이 큐벳에서 elegans. 비디오 분석을 사용하여 하나의 웜을 샘플링, 5mm 두께의 큐벳에서 비디오 분석에서 얻은 평균 수영 주파수는 2.5 Hz에서 (그림 4)입니다. 마찬가지로, 실시간 데이터 수집 방법을 사용하여 하나의 웜을 샘플링, 우리는 2.7에 대한 Hz에서 (그림 5)의 수영장 주파수를 얻을 디지털 오실로스코프 (PicoScope)를 사용합니다.이 절차는 많은 벌레 반복 할 수 있습니다. 자유롭게 헤엄 웜에 대한 자세한 연구가 5mm 큐벳에 2.37 Hz의 평균 수영장 주파수를 공개했다. ⁶ 예상대로, 수영 주파수는 크롤링 웜 (~ 0.8 Hz에서)에 대한보다 높은 것입니다. ^3이 회절 방법을 사용하여 C.의 평균 수영 주파수 현미경 슬라이드에 국한되어있다 elegans은 2 Hz의 이전에 다음 ID로 출판 값과 일치하는 것으로 확인되었습니다. ^1,7

ve_content는 "> 다음 절차 3.) 후 6). 기존의 현미경으로 얻은 웜 이미지의 도움으로 회절 패턴을 수영의 모델링 할 수 있습니다. 모델화 회절 패턴은 C. elegans의 수영주기를 (시뮬레이션하는 데 사용됩니다 그림 6). 성공적인 모델은 수영 주파수를 일치 물리적으로 가능한 연속 수영 패턴으로 구성되어 있습니다.이 수영 사이클의 처음과 같이 웜은 수영주기의 끝 부분에 동일한 모양에 있어야합니다.

그림 1. 녹색 HeNe 레이저 라이브 C.를 사용하여 동적 회절 패턴을 생성하는 데 사용 된 elegans. 이 회절 패턴은 240 프레임으로 촬영했습니다.

그림 2. 드라 날개는 검은 색 점은 전송 빔의 흡수를 증가시킵니다. 분산 된 광으로 인해 카메라의 채도가 감소하고 회절 패턴은 표시되고 있습니다.

그림 3은. 추적하는 웜 회절 패턴과의 영상 분석 소프트웨어의 스크린 샷 (로거 프로). 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4. 5mm 큐벳에 선충류의 수영주기에 해당하는 비디오 데이터입니다. 곡선 맞는 ~ 2.5 Hz의 주파수 수영을 드러내고있다.

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그림 5. 5mm 큐벳에 선충류의 수영주기에 해당하는 실시간 데이터입니다. 곡선 맞는 ~ 2.7 Hz의 주파수 수영을 드러내고있다.

그림 6. 상단 행은 실제 회절 패턴을 나타내며 아래쪽 행에있는 모델을 회절 패턴을 일치합니다. 모델을 회절 패턴은 현미경 슬라이드 (중간 행)에 웜을 사용하여 제작되었다.

토론

우리는 실시간 운동의 측정과 현미경의 사용을 필요로하지 않습니다 nematodes 같은 미세한 미생물에서 간단한 locomotory 행동에 새로운 접근 방식을 개발했습니다. ^8이 방법 론적 접근 방법도 protists 같은 수많은 미세한 미생물을 연구에 활용 될 수 있습니다. 이 방법은 사용 빛의 파장에 의해 제한됩니다. 조직은 빛의 파장보다 작은이 아니어야합니다. 필요한 장비의 비용 절감과 휴대뿐만 아니라,이 접근법의 하나 장점은 현미경 이미지 비행기의 좁은 제약없이 실시간으로 세 차원의 행동을 측정 할 수있는 능력입니다. 이 기술은 현미경 기반의 접근 방식을 사용하여 공부 할 수없는 행동에 중력의 힘이나 여러 다른 조건의 영향을 조사하기 위해 함께도 가능합니다. ⁹ 따라서, 우리는 미생물 자연 locomotory beha의 더 나은 이해를 얻을 수 있습니다현미경 슬라이드 방울 또는 전문 마이크로 유체 챔버 (파크 외, 2008)의 굴레에서 해방 viors ^10.

회절 패턴의 위상 정보의 부족 원방 회절 패턴이 푸리에 변환의 절대 값의 제곱에 비례하기 때문에 diffracting 객체에 해당하는 이미지의 직접 검색을 허용하지 않습니다. 그들이 자유롭게 헤엄 nematodes (그림 6)의 회절 패턴과 일치 할 수 있도록 따라서 웜 이미지에서 회절 패턴을 계산합니다.

이 방법은 진정으로 자유롭게 C. 수영에 대한 결과가 생긴 elegans와 어떤 미세한 종에 적용 할 수있는 물이나 여러 가지 이온 솔루션과 같은 광학 투명 환경에서 연습. 기존 현미경은 마이크로 미터의 순서에 초점 깊이 연구 만 할 수 있습니다. ^11이 제한된 때문입니다빛을 초점 피사계 심도 :

이 회절 방법은 확실히 기존의 현미경을 대체 아니지만 N은 짧은 초점 길이가 큰 C와 연결되어 있으므로 혼동 (C)의 원과 상호 관계를 맺고 F-번호입니다. ^12,13, 그건 할 수있는 곳 그렇게 빨리 종 더 적은 비용으로 실시간으로 조작 할 수 양적 결과를 제공합니다. 회절 패턴은 어떤 레이저 포인터를 얻을 수 있습니다. 회절 패턴은 일반 디지털 카메라를 사용하여 감소 시간적 해상도로 촬영 할 수 있습니다. 사용자가 쉽게 사용할 수있는 현미경이나 광 다이오드가없는 수 있지만, 이러한 탈곡 주파수를 측정하고 회절 패턴을 평가하는 등이 실험의 핵심 부품은 매우 적은 비용으로 완료 할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
543 nm의 HeNe 레이저	Melles Griot	LGX1	이하 5 MW로 보이는 범위에 포함되지 않는 모든 레이저가 사용할 수 있습니다.
이 전면 표면 알루미늄 거울	Thorlabs	PF10-03-F01
고속 Exilim 카메라	건반
석영 큐벳	Starna 셀	21/G/5
LoggerPro (소프트웨어)	버니어		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	볼프람		http://www.wolfram.com/